一种芽孢杆菌的pcr模板及其制备方法和应用
阅读说明：本技术 一种芽孢杆菌的pcr模板及其制备方法和应用 (PCR template of bacillus and preparation method and application thereof ) 是由 曹树威 廖玉英 邱磊 王自豪 卢慧林 甘露 陈政瑜 刘克俊 黄焕昌 卢文宜 向雷 于 2021-01-20 设计创作，主要内容包括：本发明适用于生物技术领域,提供了一种芽孢杆菌的PCR模板及其制备方法和应用,该PCR模板的制备方法包括以下步骤：将芽孢杆菌菌体与DNA提取液进行混合后,再加入石英砂进行混合,同时进行沸水浴处理,得到混合液；将混合液进行离心处理,取上清液,得到所述PCR模板；其中,DNA提取液包括三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、乙二胺四乙酸、聚乙烯吡咯烷酮、蛋白酶K和溶菌酶。本发明实施例提供的制备方法,结合物理和生物等方法,利用石英砂、溶菌酶、蛋白酶K等物质,充分裂解菌体,可在短时间内制备出满足PCR需求的DNA模板,其具有安全、高效、环保等特点。(The invention is suitable for the technical field of biology, and provides a PCR template of bacillus, a preparation method and application thereof, wherein the preparation method of the PCR template comprises the following steps: mixing bacillus thallus with the DNA extracting solution, adding quartz sand for mixing, and simultaneously carrying out boiling water bath treatment to obtain a mixed solution; centrifuging the mixed solution, and taking supernatant to obtain the PCR template; wherein, the DNA extracting solution comprises trihydroxymethyl aminomethane hydrochloride, ethylene diamine tetraacetic acid, polyvinylpyrrolidone, proteinase K and lysozyme. The preparation method provided by the embodiment of the invention combines physical and biological methods, utilizes substances such as quartz sand, lysozyme, proteinase K and the like to fully crack thalli, can prepare the DNA template meeting the PCR requirement in a short time, and has the characteristics of safety, high efficiency, environmental protection and the like.)
技术领域
本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种芽孢杆菌的PCR模板及其制备方法和应用。
背景技术
芽孢杆菌近年在生态养殖领域应用广泛，种类繁多，功能各异，结合PCR方法对其进行分子鉴定是实现菌株快速分类的重要方法。在制备PCR反应菌株基因组模板时，传统的基因组提取方法耗时耗力，不能满足轻量化、少量化的需求，且需要接触苯酚、氯仿等剧毒的化学物质。
另外，现有的试剂盒虽能在低毒条件下，提高基因组DNA的提取效率，但成本较高，在实验经费预算有限的情况下，难以满足大批量菌株鉴定的需求。
发明内容
本发明实施例的目的在于提供一种芽孢杆菌的PCR模板的制备方法，旨在解决背景技术中提出的问题。
本发明实施例是这样实现的，一种芽孢杆菌的PCR模板的制备方法，其包括以下步骤：
将芽孢杆菌菌体与DNA提取液进行混合后，再加入石英砂进行混合，同时进行沸水浴处理，得到混合液；所述DNA提取液包括三羟甲基氨基甲烷盐酸盐（Tris-Hcl）、乙二胺四乙酸（EDTA）、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、蛋白酶K和溶菌酶；
将混合液进行离心处理，取上清液，得到所述PCR模板。
作为本发明实施例的另一个优选方案，所述芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌，地衣芽孢杆菌，解淀粉芽孢杆菌，巨大芽孢杆菌，蜡状芽孢杆菌中的任一种。
作为本发明实施例的另一个优选方案，所述石英砂与DNA提取液的质量体积比以mg/μL计为(0.3~0.7):1
作为本发明实施例的另一个优选方案，所述DNA提取液的pH值为7.5~8.5。
作为本发明实施例的另一个优选方案，所述DNA提取液中，三羟甲基氨基甲烷盐酸盐的浓度为15~25mmol/L。
作为本发明实施例的另一个优选方案，所述DNA提取液中，乙二胺四乙酸的浓度为1.5~2.5mmol/L。
作为本发明实施例的另一个优选方案，所述DNA提取液中，聚乙烯吡咯烷酮的浓度为8~12g/L。
作为本发明实施例的另一个优选方案，所述DNA提取液中，蛋白酶K的浓度为80~120μg/L。
作为本发明实施例的另一个优选方案，所述DNA提取液中，溶菌酶的浓度为0.8~1.2mg/mL。
本发明实施例的另一目的在于提供一种上述制备方法制得的PCR模板。
本发明实施例的另一目的在于提供一种上述的PCR模板在芽孢杆菌鉴定和/或分类中的应用。
本发明实施例提供的一种芽孢杆菌的PCR模板的制备方法，结合物理和生物等方法，利用石英砂、溶菌酶、蛋白酶K等物质，充分裂解菌体，可在短时间内制备出满足PCR需求的DNA模板，其具有安全、高效、环保等特点。具体的，酶解菌体之前先利用石英砂磨伤菌体，便于酶解更加充分；芽孢杆菌是革兰氏阳性菌，细胞壁的主要成分是肽聚糖，溶菌酶能高效水解肽聚糖，因此，针对芽孢杆菌使用酶解法，大大提高细胞的裂解效率。酶解之后再次用石英砂打磨，从而可以彻底裂解菌体。
另外，针对菌体裂解释放的多糖、蛋白等易污染DNA的物质，本发明利用PVP结合多糖，利用蛋白酶K消化蛋白质，最后利用沸水浴充分增加细胞裂解效率的同时，使蛋白质变性、凝聚，最后利用高速离心使未裂解的菌体，变性的有机大分子，细胞碎片等沉降，与上清液中的DNA分离。
DNA提取液中的Tris-Hcl，提供了弱碱缓冲环境，同时EDTA可以抑制DNA酶的活性，二者共同作用可以保护模板DNA一直稳定，不被降解。
本发明在充分裂解菌体，释放DNA的同时，最大程度消除多糖、蛋白等对DNA的污染，制取模板母液。母液经过高倍稀释后，残留的少量的DNA污染物不会对PCR反应产生影响。
本发明仅需制备少量的，可满足PCR反应需要的DNA模板，无需基因组DNA的浓缩，纯化，因此本发明的操作方法相对传统的基因组提取方法大大简化，不仅节约了大量时间，而且避开了苯酚、氯仿等剧毒的化学物质，安全，高效。
本发明直接利用牙签挑取少量的菌体即可满足实验需求，无需液体培养，收集菌体等繁琐的操作，可在短时间内制备大量芽孢杆菌菌株的满足PCR需求的基因组DNA模板，成本远不及试剂盒，相对于试剂盒的实验方法，简化了操作步骤；在科研经费有限的情况下，可以满足大批量的菌株鉴定需求。
附图说明
图1为不同方法得到的PCR模板的扩增产物的电泳检测结果对比图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
该实施例提供了一种芽孢杆菌的PCR模板的制备方法，其包括以下步骤：
S1、用无菌牙签从枯草芽孢杆菌固体培养基表面挑取绿豆粒大小菌体至1.5 mLEP管内，加入1 mL无菌生理盐水，用枪头反复吹洗5次，然后经12000 rpm/min离心1min，弃上清，得到芽孢杆菌菌体。
S2、将上述芽孢杆菌菌体与600μL的DNA提取液进行混合，并用枪头反复吹洗3次至菌体均匀分布后，再加入300mg的石英砂进行混合，并进行涡旋震荡3 min后，再置于58℃水浴锅15min，然后从水浴锅取出后继续涡旋震荡3min后，再进行沸水浴5min，得到混合液；
其中，DNA提取液包括三羟甲基氨基甲烷盐酸盐20mmol/L、乙二胺四乙酸2mmol/L、聚乙烯吡咯烷酮10g/L、蛋白酶K 100μg/L和溶菌酶1mg/mL，其pH值为8。
S3、将上述混合液经12000 rpm/min离心1min后，取上清液至另一个无菌EP管内，作为模板母液，并于-20℃下冷冻保藏，待使用时，将母液稀释500倍，即可直接用作PCR模板。
实施例2
该实施例提供了一种芽孢杆菌的PCR模板的制备方法，其包括以下步骤：
S1、用无菌牙签从地衣芽孢杆菌固体培养基表面挑取绿豆粒大小菌体至1.5 mLEP管内，加入1 mL无菌生理盐水，用枪头反复吹洗6次，然后经12000 rpm/min离心1min，弃上清，得到芽孢杆菌菌体。
S2、将上述芽孢杆菌菌体与600μL的DNA提取液进行混合，并用枪头反复吹洗3次至菌体均匀分布后，再加入180mg的石英砂进行混合，并进行涡旋震荡3 min后，再置于58℃水浴锅15min，然后从水浴锅取出后继续涡旋震荡3min后，再进行沸水浴5min，得到混合液；
其中，DNA提取液包括三羟甲基氨基甲烷盐酸盐15mmol/L、乙二胺四乙酸1.5mmol/L、聚乙烯吡咯烷酮8g/L、蛋白酶K 80μg/L和溶菌酶0.8mg/mL，其pH值为7.5。
S3、将上述混合液经12000 rpm/min离心1min后，取上清液至另一个无菌EP管内，作为模板母液，并于-20℃下冷冻保藏，待使用时，将母液稀释500倍，即可直接用作PCR模板。
实施例3
该实施例提供了一种芽孢杆菌的PCR模板的制备方法，其包括以下步骤：
S1、用无菌牙签从解淀粉芽孢杆菌固体培养基表面挑取绿豆粒大小菌体至1.5 mLEP管内，加入1 mL无菌生理盐水，用枪头反复吹洗6次，然后经12000 rpm/min离心1min，弃上清，得到芽孢杆菌菌体。
S2、将上述芽孢杆菌菌体与600μL的DNA提取液进行混合，并用枪头反复吹洗3次至菌体均匀分布后，再加入420mg的石英砂进行混合，并进行涡旋震荡3 min后，再置于58℃水浴锅15min，然后从水浴锅取出后继续涡旋震荡3min后，再进行沸水浴5min，得到混合液；
其中，DNA提取液包括三羟甲基氨基甲烷盐酸盐25mmol/L、乙二胺四乙酸2.5mmol/L、聚乙烯吡咯烷酮12g/L、蛋白酶K 120μg/L和溶菌酶1.2mg/mL，其pH值为8.5。
S3、将上述混合液经12000 rpm/min离心1min后，取上清液至另一个无菌EP管内，作为模板母液，并于-20℃下冷冻保藏，待使用时，将母液稀释500倍，即可直接用作PCR模板。
实施例4
该实施例提供了一种芽孢杆菌的PCR模板的制备方法，其包括以下步骤：
S1、用无菌牙签从巨大芽孢杆菌固体培养基表面挑取绿豆粒大小菌体至1.5 mLEP管内，加入1 mL无菌生理盐水，用枪头反复吹洗5次，然后经12000 rpm/min离心1min，弃上清，得到芽孢杆菌菌体。
S2、将上述芽孢杆菌菌体与600μL的DNA提取液进行混合，并用枪头反复吹洗3次至菌体均匀分布后，再加入240mg的石英砂进行混合，并进行涡旋震荡3 min后，再置于58℃水浴锅15min，然后从水浴锅取出后继续涡旋震荡3min后，再进行沸水浴5min，得到混合液；
其中，DNA提取液包括三羟甲基氨基甲烷盐酸盐18mmol/L、乙二胺四乙酸1.8mmol/L、聚乙烯吡咯烷酮9g/L、蛋白酶K 90μg/L和溶菌酶0.9mg/mL，其pH值为7.8。
S3、将上述混合液经12000 rpm/min离心1min后，取上清液至另一个无菌EP管内，作为模板母液，并于-20℃下冷冻保藏，待使用时，将母液稀释500倍，即可直接用作PCR模板。
实施例5
该实施例提供了一种芽孢杆菌的PCR模板的制备方法，其包括以下步骤：
S1、用无菌牙签从蜡状芽孢杆菌固体培养基表面挑取绿豆粒大小菌体至1.5 mLEP管内，加入1 mL无菌生理盐水，用枪头反复吹洗6次，然后经12000 rpm/min离心1min，弃上清，得到芽孢杆菌菌体。
S2、将上述芽孢杆菌菌体与600μL的DNA提取液进行混合，并用枪头反复吹洗3次至菌体均匀分布后，再加入360mg的石英砂进行混合，并进行涡旋震荡3 min后，再置于58℃水浴锅15min，然后从水浴锅取出后继续涡旋震荡3min后，再进行沸水浴5min，得到混合液；
其中，DNA提取液包括三羟甲基氨基甲烷盐酸盐22mmol/L、乙二胺四乙酸2.2mmol/L、聚乙烯吡咯烷酮11g/L、蛋白酶K 110μg/L和溶菌酶1.1mg/mL，其pH值为8.2。
S3、将上述混合液经12000 rpm/min离心1min后，取上清液至另一个无菌EP管内，作为模板母液，并于-20℃下冷冻保藏，待使用时，将母液稀释500倍，即可直接用作PCR模板。
分别利用现有技术的菌落PCR法、本发明实施例1提供的方法、现有技术的CTAB法、现有技术的试剂盒法等4种不同的方法提取枯草芽孢杆菌、地衣芽胞杆菌、巨大芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌等4株菌体的基因组DNA（PCR模板），并分别进行PCR反应，其得到的扩增产物的电泳图如图1所示。
图1中，L1，L2，L3，L4是利用菌落PCR的方法获得的枯草芽孢杆菌、地衣芽胞杆菌、巨大芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌等4株菌的16srDNA条带；L5，L6，L7，L8是利用本发明实施例1提供的方法获得的枯草芽孢杆菌、地衣芽胞杆菌、巨大芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌等4株菌的16srDNA条带；L9，L10，L11，L12是利用CTAB法获得的枯草芽孢杆菌、地衣芽胞杆菌、巨大芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌等4株菌的16srDNA条带；L13，L14，L15，L16是利用试剂盒法获得的枯草芽孢杆菌、地衣芽胞杆菌、巨大芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌等4株菌的16srDNA条带。
图1中4种菌的16srDNA基因大小约为1500bp；由图1可知，菌落PCR法虽然是4种方法中最简单，省时，安全的方法，但扩增产物浓度低，且不稳定，难以满足测序的要求；本发明的方法扩增的基因产物浓度高，特异性好，使用效果完全可以媲美甚至超过CTAB法及试剂盒法，本发明的方法PCR产物满足测序要求。
综上所述，本发明的主要优势在下列几方面：
1.安全：传统的CTAB基因组提取法，需要使用巯基乙醇，苯酚，氯仿等3类物质，此3类物质公认毒性强，且多具有挥发性，易进入呼吸道，及时实验操作正规亦难免会摄入体内。本发明中所用的DNA提取液由Tris-Hcl，EDTA，PVP，蛋白酶K，溶菌酶等成分组成，无公认的毒性化学物质，这些物质组合在保证高效实验效果的同时具备安全性；
2．快速：本发明可以快速完成基因组模板提取工作，主要体现在如下3方面：
（1）无需液体培养的菌体收集：传统的CTAB基因组提取法及试剂盒基因组提取法，需要提前培养菌，即将菌接种至液体培养集中培养数天后收集菌体，但本发明对菌体量要求极少，只需要用牙签从固体平板或试管斜面上挑取少量菌体至1.5ml EP管内，避免了菌株液体摇床培养及菌体收集等工作；也避免了液体培养过程中存在杂菌污染的风险。因为本发明中菌株收集工作简单，只需用无菌牙签挑取少量菌体至1.5ml EP管内，一个人可以在短时间内同时完成几十株甚至上百株菌株的采样工作，因此大大提高了工作效率。
（2）实验操作步骤少且操作简单，节约了单菌株基因组提取时间：本发明步骤操作技术要求简单，安全性好，且步骤大大简化，可以在35min之内完成1株菌株的基因组提取工作。
（3）基因组提取完成后无需电泳检测：本发明提取的基因组模板不需要经过提取后的电泳检测，即可直接稀释后作为基因组模板进行PCR，节约了实验步骤及时间。
3、提取的模板用作PCR效果好：本发明利用改良的DNA提取液，结合了物理破壁法，生物酶解法及化学法，能在高效破壁释放菌体基因组的同时降解蛋白，抑制蛋白、多糖类物质对PCR的干扰，且可抑制DNA酶对模板DNA的降解，本发明的PCR产物条带浓度高，远远满足测序要求。
4、成本低廉：菌落PCR法、本发明方法、CTAB法、试剂盒法等4种不同的提取基因组DNA方法中，菌落PCR法是成本最低，耗时最少的方法，但难以满足应用需求；本发明方法提取单菌株耗材成本略高于CTAB法，但远低于试剂盒法；本发明方法提取单菌株时间成本（35min）略高于试剂盒法（30min），但远低于CTAB法（90min）（此处的时间不包含菌的培养、菌体收集时间及基因组提取物的电泳凝胶检测时间）。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。