Lamp反应体系/分体系的分割处理和常温运输方法
阅读说明：本技术 Lamp反应体系/分体系的分割处理和常温运输方法 (LAMP reaction system/split system segmentation treatment and normal temperature transportation method ) 是由 陈晓东 于 2020-12-31 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种LAMP反应体系/分体系的分割处理和常温运输方法,该方法以无菌无纺布/无菌无毛纸作为LAMP反应体系/分体系的无菌载体,首先将LAMP反应体系/分体系与海藻糖混合,得到混合液；再将无菌载体放入混合液中,充分浸润；再利用冷冻干燥机对上述的无菌载体进行冷冻干燥处理；最后将冷冻的无菌载体通过切割仪器进行等量切割,一管化分装,常温保存或运输。本发明将酶组分和PCR反应液组分分别固定在不同的无菌载体上,等量切割后按需求放入反应管内,重新组合成一管式LAMP反应体系,既避免了常规一管式混合冻干法假阳性率高的问题,又延长了LAMP反应体系的常温保存或运输期限。(The invention discloses a method for partitioning an LAMP reaction system/a split system and transporting the LAMP reaction system/the split system at normal temperature, which takes sterile non-woven fabrics/sterile non-woven paper as a sterile carrier of the LAMP reaction system/the split system, and firstly, the LAMP reaction system/the split system is mixed with trehalose to obtain a mixed solution; then putting the sterile carrier into the mixed solution for full infiltration; then, freeze-drying the sterile carrier by using a freeze dryer; and finally, equivalently cutting the frozen sterile carrier by a cutting instrument, subpackaging by one tube, and storing or transporting at normal temperature. According to the invention, the enzyme component and the PCR reaction solution component are respectively fixed on different sterile carriers, cut in equal amount and then placed into the reaction tube as required to be recombined into the one-tube LAMP reaction system, so that the problem of high false positive rate of the conventional one-tube mixed freeze-drying method is avoided, and the normal-temperature storage or transportation period of the LAMP reaction system is prolonged.)
技术领域
本发明涉及生化试剂技术领域，具体涉及一种LAMP反应体系/分体系的分割处理和常温运输方法。
背景技术
2000年日本学者Notomi在Nucleic Acids Res杂志上公开了一种新的适用于基因诊断的恒温核酸扩增技术，即环介导等温扩增技术，英文名称为“Loop-mediatedisothermal amplification”，简称“LAMP”技术。“LAMP”技术是针对靶基因的6个区域设计4种特异引物，在链置换DNA聚合酶(Bst DNA Polymerase)的作用下，60～65℃恒温扩增，15～60分钟左右即可实现109～1010倍的核酸扩增。
与常规PCR相比，“LAMP”技术具有以下优势：
1.灵敏度高，比传统的核酸扩增法高2～5个数量级；
2.反应时间短，不需要模板的热变性，30～60分钟就能完成反应；
3.反应全过程恒温，无温度循环，临床使用不依赖于昂贵的专业检测设备；
4.反应结果可通过肉眼观察白色浑浊或绿色荧光的生成来判断，不需要电泳及紫外观察，简便快捷，不具备专业技能的一般人员就能在疾病现场进行快速诊断。
近年来，“LAMP”技术已被多国广泛运用于病原体微生物快速检测，如SARS、流感病毒、肺炎支原体、结核分枝杆菌等。但在实际应用中，LAMP反应所需的试剂：引物、d NTPs、聚合酶、反应缓冲液等均需要在-20℃以下低温长期保存及短期运输，且试剂反复冻融会影响其活性甚至失效。同时，预先将除待测样品核酸(DNA或RNA)以外的各种LAMP反应试剂组分(即引物、d NTPs、聚合酶、反应缓冲液等)配制成一管式预混物，长期放置有可能会使体系受引物二聚体的影响造成假阳性的发生。
所以，发明一种将引物与其他LAMP反应试剂组分冻干在不同的无菌载体上，避免了常规一管式混合冻干法假阳性率高的问题，且便于常温保存或运输的方法具有重要意义，目前，尚没有相关记载。
发明内容
目前，由于核酸扩增反应试剂各组分混合成一管式的体系长期放置有可能会使体系受引物二聚体的影响造成假阳性的发生，不利于长期保存及运输，因此，现有的商品试剂盒一般会将酶组分和PCR反应液组分分装在2个不同的容器内，商品试剂盒需要在-20℃以下低温长期保存及短期运输，且试剂反复冻融会影响其活性甚至失效，而现有的冻干技术制备成的体系冻干粉中，引物和酶组分混合成一管式的体系长期放置有可能会使体系受引物二聚体的影响造成假阳性的发生。本发明提供了一种LAMP反应体系/分体系的分割处理和常温运输方法，确切的说是除待测样品核酸(DNA或RNA)、水分以外的LAMP反应体系/分体系的分割处理和常温运输方法。
为实现上述目的，本发明所设计一种LAMP反应体系/分体系的分割处理和常温运输方法，包括以下步骤：
1)将LAMP反应体系/分体系与海藻糖混合，得到混合液；
2)将无菌载体放入混合液中，充分浸润；再利用冷冻干燥机对上述的无菌载体进行冷冻干燥处理(使LAMP反应体系/分体系被冻干在无菌载体上)，其中，所述无菌载体为无纺布/无毛纸；
3)最后将冷冻的无菌载体通过切割仪器进行等量切割，一管化分装，常温保存或运输(其实现LAMP反应体系/分体系的分割处理和常温运输，使用时，可加入水分使体积复原，用于LAMP扩增反应)。
进一步地，所述步骤1)中，每毫升的混合液中，海藻糖的含量为0～15g。
再进一步地，所述混合液为LAMP反应体系与海藻糖混合时，每毫升的混合液中，海藻糖的含量为10～15g。
再进一步地，所述LAMP反应体系为DNA扩增体系时，包括引物、dNTPs、Bst DNA聚合酶、核酸扩增的反应缓冲液；
或者，所述LAMP反应体系为RNA扩增体系时，包括引物、dNTPs、Bst DNA聚合酶、核酸扩增的反应缓冲液、逆转录酶/反转录酶。
再进一步地，所述混合液为LAMP反应分体系与海藻糖混合时，
若LAMP反应分体系为酶组分体系，每毫升的混合液中，海藻糖的含量为10～15g；
或者，若LAMP反应分体系为PCR反应液组分体系，海藻糖的含量为0～15g；PCR反应液组分体系包含引物、dNTPs。
再进一步地，所述酶组分体系为DNA酶组分体系，包括Bst DNA聚合酶、核酸扩增的反应缓冲液；
所述酶组分体系为RNA酶组分体系，包括Bst DNA聚合酶、dNTPs和逆转录酶或者Bst DNA聚合酶、核酸扩增的反应缓冲液和反转录酶。
再进一步地，所述d NTPs为d ATP、d TTP、d GTP和d CTP的混合物；所述Bst DNA聚合酶为同时具有5′→3′聚合酶活性和链替代活性的DNA聚合酶。
再进一步地，所述步骤2)中，冷冻干燥处理时间为2小时。
本发明还提供了一种上述LAMP反应体系/分体系的分割处理和常温运输方法得到的无菌载体的使用方法为：
a.向含有LAMP反应体系的无菌载体的反应管内加水，溶解得到LAMP反应体系，用于LAMP扩增反应；
或者，b.向含有多个LAMP反应分体系的无菌载体的反应管内加水，溶解得到LAMP反应体系，用于LAMP扩增反应。
本发明的有益效果：
本发明将酶组分和PCR反应液组分分别固定在不同的无菌载体(无纺布或无毛纸)上，等量切割后按需求放入反应管内，重新组合成一管式LAMP反应体系，既避免了常规一管式混合冻干法假阳性高的问题，又延长了LAMP反应体系的常温保存或运输期限。
附图说明
图1为乙型流感病毒LAMP反应体系的无菌载体复溶后的LAMP扩增反应的显示效果图；
图中，从左至右：第一管溶液显示为粉色，第二、三管溶液显示为黄色；
图2为乙型流感病毒LAMP反应分体系的无菌载体组合复溶后的LAMP扩增反应的显示效果图；
图中，从左至右：第一管溶液显示为深蓝色，第二、三管溶液显示为浅蓝色。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细描述，以便本领域技术人员理解。
实施例1
LAMP反应体系/分体系的分割处理和常温运输方法，可将除待测样品核酸(RNA)以外的各种LAMP反应试剂组分(包括引物、d NTP、Bst聚合酶、反应缓冲液等)配制成一管式预混液，现准备N人份的LAMP反应体系，且N＝100，其制备方法如下：
1)母液的制备
引物干粉用dd H2O溶解，配制成引物工作液，待用；
海藻糖用dd H2O溶解，配制成每毫升水中海藻糖的含量为70g的海藻糖母液，待用；
2)LAMP反应体系的制备
用于制备所述LAMP反应体系的试剂为New ENGLAND BioLabs的“WarmStart LAMP2×预混液”，包含d NTPs、Bst聚合酶、反应缓冲液、染料等试剂组分。
根据单人份LAMP反应体系中除待测样品核酸(RNA)以外的各种LAMP反应试剂各组分(包括引物、WarmStart LAMP 2×预混液)的用量配制100人份LAMP反应体系，总体积为1.75mL：
LAMP反应试剂组分
单人份用量(μL)
WarmStart LAMP 2×预混液
12.5
FIP(40pmol/μL)
1
BIP(40pmol/μL)
1
F3(10pmol/μL)
0.5
B3(10pmol/μL)
0.5
LF(20pmol/μL)
1
LB(20pmol/μL)
1
RNA模板
1
H<sub>2</sub>O
6.5
总体系
25
3)海藻糖的添加
将步骤1)中的海藻糖母液添加到步骤2)的LAMP反应体系(份数N＝100)中，加入535.71μL海藻糖母液，加无菌水定容至2.5mL，使每毫升定容的混合液中，海藻糖的含量为15g。
4)无菌载体(无纺布或无毛纸)的浸润与冻干
根据实际情况准备好无菌载体，将无菌载体浸润在上述已添加了海藻糖的LAMP反应体系里，混匀，利用冷冻干燥机对上述的无菌载体进行冷冻干燥处理2小时。
5)无菌载体的等量切割
取出冻干好的无菌载体，用切割仪器等量切割成100份。
6)体系的分装
取切割好的无菌载体分装到反应管里，每管放一份，常温保存或运输。
将上述方法分割的含有LAMP反应体系的无菌载体用于PCR反应：
1.样品准备：1拷贝/μL的乙型流感病毒样品，10拷贝/μL的乙型流感病毒样品
2.取出3管步骤6)的反应管，向每管内加入24μL的无菌水，振荡混匀后，第一管加入1μL无菌水作为模板，第二管加入1μL浓度为1拷贝/μL的乙型流感病毒样品作为模板，第三管加入1μL浓度为10拷贝/μL的乙型流感病毒样品作为模板，振荡混匀，于PCR仪上65℃反应30min。
反应结果如图1所示：第一管反应结果显示为粉色，为乙型流感病毒阴性，第二、三管反应结果显示为黄色，为乙型流感病毒阳性。反应结果准确，说明添加了海藻糖的LAMP反应体系经过冷冻干燥后，加水使体积复原进行扩增反应，仍具有良好的扩增效果。
实施例2
为了避免LAMP反应体系一管式预混物长期放置有可能会使体系受引物二聚体的影响造成假阳性的发生，及延长LAMP反应体系的常温保存或运输期限。现将除待测样品核酸(DNA)以外的各种LAMP反应试剂组分按LAMP反应分体系制备，所述LAMP反应分体系为酶组分体系或PCR反应液组分体系，将酶组分和PCR反应液组分分别固定在不同的无菌载体(无纺布或无毛纸)上，等量切割后按需求放入反应管内，重新组合成一管式LAMP反应体系。现准备N人份的LAMP反应分体系，且N＝100，其制备方法如下：
1)母液的制备
引物干粉用dd H2O溶解，配制成引物工作液，待用；
海藻糖用dd H2O溶解，配制成每毫升水中海藻糖的含量为70g的海藻糖母液，待用；
2)LAMP反应分体系的制备
a.酶组分体系的制备：根据单人份LAMP反应体系中Bst DNA聚合酶、AMV酶及dNTPs的用量，制备100人份酶组分体系，总体积为0.35mL：
LAMP反应试剂组分
单人份用量(μL)
100人份用量(μL)
Bst聚合酶(8U/μL)
0.75
75
AMV酶(8U/μL)
0.25
25
10×Bst Buffer
2.5
250
b.PCR反应液体系的制备：根据单人份LAMP反应体系中引物、核酸扩增的反应缓冲液等组分的用量，制备100人份PCR反应液体系，总体积为1.65mL：
LAMP反应试剂组分
单人份用量(μL)
100人份用量(μL)
dNTPs Mix(2.5mM each)
10
1000
MgSO<sub>4</sub>(100mM)
0.5
50
羟基萘酚蓝(0.3μmol/mL)
1
100
FIP(40pmol/μL)
1
100
BIP(40pmol/μL)
1
100
F3(10pmol/μL)
0.5
50
B3(10pmol/μL)
0.5
50
LF(20pmol/μL)
1
100
LB(20pmol/μL)
1
100
3)海藻糖的添加
将步骤1)中的海藻糖母液分别添加到步骤2)的酶组分体系或PCR反应液组分体系(份数N＝100)中，酶组分体系中加入160.71μL海藻糖母液，加无菌水定容至0.75mL；PCR反应液组分体系加入375μL海藻糖母液，加无菌水定容至2.05mL。
4)无菌载体(无纺布或无毛纸)的浸润与冻干
根据实际情况准备好两块无菌载体，将两块无菌载体分别浸润在上述已添加了海藻糖的酶组分体系和PCR反应液体系里，混匀，利用冷冻干燥机对上述的无菌载体分别进行冷冻干燥处理2小时。
5)无菌载体的等量切割
取出冻干好的无菌载体，用切割仪器分别将浸润有酶组分体系或PCR反应液体系等量切割成100份。
6)分体系的组合与分装
取切割好的无菌载体(酶组分体系及PCR反应液组分体系)分装到反应管里，每管各放一份分体系，组成一份完整的反应体系，常温保存或运输。
将上述方法分割的含有LAMP反应分体系的无菌载体用于PCR反应：
1.样品准备：1拷贝/μL的乙型流感病毒样品，10拷贝/μL的乙型流感病毒样品
2.取3管步骤6)的反应管，向每管内加入4μL的无菌水，振荡混匀后，第一管加入1μL无菌水作为模板，第二管加入1μL浓度为1拷贝/μL的乙型流感病毒样品作为模板，第三管加入1μL浓度为10拷贝/μL的乙型流感病毒样品作为模板，振荡混匀，于PCR仪上65℃反应30min。
反应结果如图2所示：第一管反应结果显示为深蓝色，为乙型流感病毒阴性，第二、三管反应结果显示为浅蓝色，为乙型流感病毒阳性。反应结果准确，说明添加了海藻糖的LAMP反应体系经过冷冻干燥后，加水使体积复原进行扩增反应，仍具有良好的扩增效果。
将上述实施例1～2的产品、现有的LAMP反应试剂(液态)和LAMP反应试剂(冻干粉)从以下方面进行比较：
1.保存及运输方式比较
产品
保存方法
有效期(70％酶活)
运输
LAMP反应试剂(液态)
-20℃
损失较小
冷冻
实施例1
室温
80天
室温
实施例2
室温
80天
室温
LAMP反应试剂(冻干粉)
室温
60天
室温
2.反应体系建立时间(min)
产品
试剂解冻
配制体系
LAMP反应试剂(液态)
60
30
实施例1
0
1
实施例2
0
1
LAMP反应试剂(冻干粉)
0
1
3.反应体系特异性
综上所述，与现有的LAMP反应试剂(液态)相比，冻干后的试剂可在常温条件下运输或保存，且本发明常温保存或运输的期限比其他冻干方法更长；与现有的LAMP反应试剂(液态)、其他冻干方法制备成的冻干粉试剂相比，本发明将酶组分和PCR反应液组分分别固定在不同的无菌载体上，等量切割后按需求放入反应管内，重新组合成一管式LAMP反应体系，避免了常规一管式混合冻干法假阳性率高的问题，检测正确率更高。
其它未详细说明的部分均为现有技术。尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。