用于检测ak4基因多态性的探针、引物、试剂盒
阅读说明：本技术 用于检测ak4基因多态性的探针、引物、试剂盒 (Probe, primer and kit for detecting AK4 gene polymorphism ) 是由 傅咏南 沈勋章 张奕 毛丹丹 于 2019-10-12 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种用于检测AK4基因多态性的探针、引物、试剂盒,其中探针的序列如SEQ ID NO.:1、SEQ ID NO.:4、或SEQ ID NO.:7所示,或者在SEQ ID NO.:1、SEQ ID NO.:4、SEQ ID NO.:7的序列两端加以基团修饰。本发明的用于检测AK4基因多态性的探针、引物、试剂盒,在检测AK4基因多态性时,具有灵敏度高、特异性好、快速、高通量检测等优点。(The invention discloses a probe, a primer and a kit for detecting AK4 gene polymorphism, wherein the sequence of the probe is shown in SEQ ID NO. 1, SEQ ID NO. 4 or SEQ ID NO. 7, or both ends of the sequence of the SEQ ID NO. 1, SEQ ID NO. 4 or SEQ ID NO. 7 are modified by groups. The probe, the primer and the kit for detecting the AK4 gene polymorphism have the advantages of high sensitivity, good specificity, rapidness, high-throughput detection and the like when detecting the AK4 gene polymorphism.)
技术领域
本发明涉及分子生物学领域，具体的说涉及用于检测AK4基因多态性的探针、引物、试剂盒。
背景技术
腺苷酸激酶（AK）家族同工酶广泛存在于生物体内，是细胞内核苷酸合成的机器，参与细胞内能量和核苷酸代谢。它们可逆的催化ATP和AMP之间磷酸基团的转移，并释放2分子ADP。AK4基因定位于1p31，该酶主要在富含线粒体的组织中表达，如脑，心脏，肾脏和肝脏。AK4既可以以ATP或GTP作为磷酸供体催化dAMP、CMP和dCMP的磷酸化，又可以以UTP作为磷酸供体磷酸化AMP。有研究表明AK4可以调节腺苷酸平衡，从而影响细胞的存活和增殖。AK4 基因在低氧环境下培养的人肝癌细胞系（HepG2）和人胚胎肾细胞（HEK293）中的表达呈相反的趋势，提示AK4基因的表达对于低氧应激细胞具有保护作用。
虽然已知AKs缺陷能够引起一些特殊疾病，但关于AK活性低下而引起的复杂疾病，如退行性疾病却知之甚少。ATP是最重要的携带高能量的分子，细胞在发挥不同功能时，产生ATP的量也不同，整体能量缺乏会导致各种器官衰竭。通过研究能量代谢相关酶，更好的理解磷酸基团转移机制，可以为将来发展治疗由能量代谢紊乱引起的疾病提供坚实的理论基础。
基因多态性构成了不同个体对疾病的易感性、对药物与环境因素不同反应的遗传学基础，选择合适的基因多态性，对从基因水平上认识表型的本质是十分重要。
目前普遍应用的基因多态性检测方法为DNA直接测序法，PCR产物直接进行DNA序列分析，可以明确突变位点，但存在费时费力，成本较昂贵，不适用于对大量样本进行检测等缺点。因此，需要开发一种适合大批量样本检测的方法。
发明内容
本发明的目的首先在于提供3组用于检测AK4基因多态性的探针，该探针的序列如SEQ ID NO.:1、SEQ ID NO.:4、或SEQ ID NO.:7所示；或者在SEQ ID NO.:1、SEQ ID NO.:4、SEQ ID NO.:7的序列两端加以基团修饰；
其中修饰基团为：5′的修饰基团为荧光基团，如FAM、HEX、CY5；3′的修饰基团为淬灭基团，如BHQ1、BHQ2；
具体的说，本发明提供的用于检测AK4（rs17853973）基因多态性的探针为：SEQ IDNO.:1 HEX-CGGGCAAGGGCACCGTGNGCCAGAGGATCGCCCG -BHQ1；
其中N为变异碱基，具体为T>A；
所述的探针包括环序列和茎序列，其中环序列为第6~26bp（5′-AAGGGCACCGTGNGCCAGAGGATC-3′），其两侧是两个反向互补的茎序列，茎序列为（5′-CGGGC……GCCCG-3）。
本发明提供的用于检测AK4（rs12074520）基因多态性的探针为：SEQ ID NO.:4FAM- CCATTTTTANTTTTGAAATGG -BHQ1；
其中N为变异碱基，具体为C>A；
所述的探针包括环序列和茎序列，其中环序列为第6~16bp（5′- TTANTTTTG-3′），其两侧是两个反向互补的茎序列，茎序列为（5′-CCATTT……AAATGG -3）。
本发明提供的用于检测AK4（rs4915685）基因多态性的探针为：SEQ ID NO.:7CY5- CCTGGTGAACCNTTAGTCCAGG-BHQ2；
其中N为变异碱基，具体为G>A；
所述的探针包括环序列和茎序列，其中环序列为第6~18bp（5′- TGAACCNTTAGT-3′），其两侧是两个反向互补的茎序列，茎序列为（5′-CCTGG……CCAGG-3）。
探针的设计原理为：根据AK4基因多态性rs17853973、rs12074520和rs4915685，分别设计探针和引物，需要保证在退火温度下DNA模板不存在时，探针呈茎环状态。探针所采用的淬灭基团为BHQ1或BHQ2，其淬灭空间范围很小，搭配短发射波长的荧光基团，如HEX，只有当分子信标呈茎环结构时，荧光才会被很好地淬灭。环序列与靶DNA序列互补时，确定最佳PCR引物为40-45bp大小，PCR产物长度100-150bp。
本发明还提供了3组用于检测AK4基因多态性的的引物，该引物的序列如SEQ IDNO.:2、5、8（引物1）和SEQ ID NO.:3、6、9（引物2）所示：
AK4（rs17853973）
SEQ ID NO.:2 5′- AGGTGACACTATAGAATAATCAATGGCTTCCAAACTCCTG-3′
SEQ ID NO.:3 5′- GCAAGCCCTCACGTAGCGAAATGTTCTCCCGCAAGAAGTG -3′。
AK4（rs12074520）
SEQ ID NO.:5 5′- AGGTGACACTATAGAATAATCAATGTGTCATCTAGTATTTTCCAA-3′
SEQ ID NO.:6 5′-GCAAGCCCTCACGTAGCGAAGGATAGGCATGAAACTTTCCAC-3′。
AK4（rs4915685）
SEQ ID NO.:8 5′- AGGTGACACTATAGAATAATGAAATGGCCCAACTGTTGTC -3′
SEQ ID NO.:9 5′- GCAAGCCCTCACGTAGCGAAACTGTCTTAGCCTGGCAGCA-3′。
本发明还提供了一种用于检测AK4基因多态性的试剂盒，该试剂盒包含如上所述的探针和/或引物；
该试剂盒还包含还有Taq酶、dNTP、和/或Mg2+，以及使用说明书。
本发明还提供一种了用于检测AK4基因多态性的方法，该方法包括如下步骤：
（1）采集样本，抽提DNA；
（2）应用上述探针和引物进行荧光定量PCR反应；
（3）应用PCR仪配套软件分析结果，根据扩增曲线，规定合适基线和阈值， 基于形成的杂交峰所显示的Tm值差异展现不同的基因型。
其中PCR反应的总体系为15ul（包括PCR Mix 7.5ul、三组正向引物溶液各0.5ul及三组反向引物溶液各0.5ul，3组探针各0.1ul，样本DNA 2ul，灭菌重蒸馏水2.2ul）；在荧光定量PCR仪上进行反应，PCR反应条件为92-97℃预变性5-15分钟；92-97℃变性10-30秒，57-65℃退火10-30秒，70-75℃延伸10-30秒，40-50个循环； 72℃延伸10分钟；92-97℃变性1分钟，40℃复性1分钟，熔解温度45-80℃过程中实时监测荧光信号，每升温1℃记录5次。
本发明对AK4基因多态性进行检测，可实现对AK4基因多态性的快速筛查，进行大样本量的基因型与表型（如运动表现、能量代谢等）之间的研究。
虽然已知AKs缺陷能够引起一些特殊疾病，但关于AK活性低下而引起的复杂疾病，如退行性疾病却知之甚少。ATP是最重要的携带高能量的分子，细胞在发挥不同功能时，产生ATP的量也不同，整体能量缺乏会导致各种器官衰竭。通过研究能量代谢相关酶，更好的理解磷酸基团转移机制，可以为将来发展治疗由能量代谢紊乱引起的疾病提供坚实的理论基础。
基因多态性构成了不同个体对疾病的易感性、对药物与环境因素不同反应的遗传学基础，选择合适的基因多态性，对从基因水平上认识表型的本质是十分重要。
本发明利用一种可以特异识别核酸序列的荧光探针，通过与靶序列进行杂交后发生构象的变化而释放荧光染料，根据杂交后产生不同温度的峰图判定分型结果。在没有靶DNA存在的情况下，荧光基团与淬灭基团可以稳定地结合在一起，检测不到荧光信号；当有靶DNA存在时，荧光标记探针结构被破坏，荧光基团与淬灭基团相互分离，即可检测到荧光信号。该方法与其他遗传分型技术相比，操作简单，2-3小时可以完成96例检测，具有灵敏度高、特异性好、快速、高通量检测等优点，且荧光标记探针可以在不同位点使用不同的荧光基团，可实现多重检测，通过直接探测PCR过程中荧光信号获得检测结果，基因分型清晰，不需要PCR后处理或电泳检测，可实现真正的闭管操作。
附图说明
图1、rs17853973位点的三种峰型（TT型、AA型、AT型）；
图2、rs12074520位点的三种峰型（CC型、AA型、AC型）；
图3、rs4915685位点的三种峰型（GG型、AA型、AG型）；
图4、多样本的熔解曲线图。
具体实施方式
实施例1：探针及引物设计
本发明是针对AK4基因三个SNP位点设计探针及引物序列。具体原理是利用荧光探针与靶序列进行杂交后发生构象的变化而释放荧光染料，根据杂交后产生不同温度的峰图及Tm值判断基因分型结果。在没有靶DNA存在的情况下，荧光基团与淬灭基团可以稳定地结合在一起，检测不到荧光信号；当有靶DNA存在时，荧光标记探针结构被破坏，荧光基团与淬灭基团相互分离，即可检测到荧光信号。
设计探针和引物，实现在退火温度下模板不存在时，探针呈茎环状态。以AK4rs17853973为例，包括环序列及其两侧呈反向互补的茎序列，总长度为34bp，其中环序列为24bp（5′- AAGGGCACCGTGNGCCAGAGGATC -3′），两端各5个碱基构成茎序列；且两端的茎序列正好形成互补；采用的淬灭基团为BHQ1，配短发射波长的荧光基团HEX。环序列与靶DNA序列互补，确定PCR引物为38-40bp大小，PCR产物长度133bp。
AK4（rs17853973）引物和探针序列如下：
引物1的序列：5′- AGGTGACACTATAGAATAATCAATGGCTTCCAAACTCCTG -3′；
引物2的序列：5′- GCAAGCCCTCACGTAGCGAAATGTTCTCCCGCAAGAAGTG -3′；
探针的序列：5′-HEX- CGGGCAAGGGCACCGTGNGCCAGAGGATCGCCCG -3′BHQ1。
其中N为变异碱基，具体为T>A；
AK4（rs12074520）引物和探针序列如下：
引物1的序列：5′- AGGTGACACTATAGAATAATCAATGTGTCATCTAGTATTTTCCAA -3′；
引物2的序列：5′- GCAAGCCCTCACGTAGCGAAGGATAGGCATGAAACTTTCCAC -3′；
探针的序列：5′-FAM- CCATTTTTANTTTTGAAATGG -3′BHQ1。
其中N为变异碱基，具体为C>A
AK4（rs4915685）引物和探针序列如下：
引物1的序列：5′- AGGTGACACTATAGAATAATGAAATGGCCCAACTGTTGTC -3′
引物2的序列：5′- GCAAGCCCTCACGTAGCGAAACTGTCTTAGCCTGGCAGCA -3′；
探针的序列：5′-CY5- CCTGGTGAACCNTTAGTCCAGG -3′BHQ2。
其中N为变异碱基，具体为G>A。
上述探针和引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。
实施例2：检测不同基因型标准品
1、用质粒构建并制备含有目的基因AK4 rs17853973、rs12074520、rs4915685位点的野生型标准品质粒和突变型标准品质粒（质粒来源，以及含目的基因质粒的合成由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。通过sanger测序确定序列的准确性，野生型标准品质粒rs17853973基因型为TT、rs12074520基因型为CC、rs4915685基因型为GG；突变型标准品质粒rs17853973基因型为AA、rs12074520基因型为AA、rs4915685基因型为AA。标准品质粒DNA浓度标化到10ng/ul。
2、采用实施例1中的探针及引物。
3、PCR反应体系：
1)在每一个PCR反应孔中依次加入PCR Mix 7.5ul，3组正向引物溶液0.5uM及3组反向引物溶液各0.5uM，3组探针个0.1uM，然后在3个不同的PCR反应孔中分别加入野生型标准品质粒DNA、突变型标准品质粒DNA、混合型DNA（野生型标准品质粒和突变型标准品质粒按照1:1比例混合）各2ul，用灭菌重蒸馏水补足15ul；
2) 在荧光定量PCR仪上进行反应，PCR反应条件为95℃预变性5分钟；95℃变性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸30秒，45个循环；72℃延伸10分钟； 95℃变性1分钟，40℃复性1分钟，熔解温度45-80℃过程中实时监测荧光信号，每升温1℃记录5次。
4、应用PCR仪配套软件SLAN分析结果，基于不同通道形成的杂交峰所显示的Tm值差异展现不同的基因型。rs17853973位点峰出现在58℃为TT基因型，出现在63℃为AA基因型，两个位置都有峰为AT基因型（图1）。rs12074520位点峰出现在54℃为AA基因型，出现在59℃为CC基因型，两个位置都有峰为AC基因型（图2）。rs4915685位点峰出现在55℃为GG基因型，出现在48℃为AA基因型，两个位置都有峰为AG基因型（图3）。
实施例3：使用AK4基因多态性检测试剂盒双盲实验考察
1、采用硅胶吸附法抽提100例上海地区健康志愿者口腔上皮细胞基因组DNA，电泳凝胶成像法对DNA的浓度和纯度作检测，待测样本DNA浓度标化到10ng/ul。
2、检测方法如下：在每一个PCR反应孔中依次加入PCR Mix 7.5ul，正向引物溶液各0.5uM及反向引物溶液各0.5uM，探针各0.1uM，同时进行弱阳性对照（rs17853973基因型为AT、rs12074520基因型为AC、rs4915685基因型为AG）、阴性对照 （rs17853973基因型为TT、rs12074520基因型为CC、rs4915685基因型为GG）和待测样本的检测，每个反应孔加入DNA 2ul，用灭菌重蒸馏水补足15ul；在荧光定量PCR检测仪上进行反应，PCR反应条件为95℃预变性5分钟；95℃变性30秒， 60℃退火30秒，72℃延伸30秒，45个循环；72℃延伸10分钟； 95℃变性1分钟，40℃复性1分钟，熔解温度45-80℃过程中实时监测荧光信号，每升温1℃记录5次。
3、应用配套软件分析结果，基于不同通道形成的杂交峰所显示的Tm值差异展现不同的基因型。rs17853973位点峰出现在58℃为TT基因型，出现在63℃为AA基因型，两个位置都有峰为AT基因型（图1）。rs12074520位点峰出现在54℃为AA基因型，出现在59℃为CC基因型，两个位置都有峰为AC基因型（图2）。rs4915685位点峰出现在55℃为GG基因型，出现在48℃为AA基因型，两个位置都有峰为AG基因型（图3）。
如图4所示为多样本的熔解曲线图，分型成功率达到100%。
4、将100例口腔上皮细胞基因组DNA同时进行sanger测序，检测结果与本发明的检测结果完全相符，由此说明，本发明的方法用于AK4基因多态性结果准确度高。
序列表
<110> 上海中优精准医疗科技股份有限公司
<120> 用于检测AK4基因多态性的探针、引物、试剂盒
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (17)..(16)
<223> n=t或a
<220>
<221> misc_feature
<222> (18)..(18)
<223> n is a, c, g, t or u
<400> 1
cgggcaaggg caccgtgngc cagaggatcg cccg 34
<210> 2
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
aggtgacact atagaataat caatggcttc caaactcctg 40
<210> 3
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gcaagccctc acgtagcgaa atgttctccc gcaagaagtg 40
<210> 4
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (12)..(11)
<223> n=c或a
<220>
<221> misc_feature
<222> (13)..(13)
<223> n is a, c, g, t or u
<400> 4
aagggcaccg tgngccagag gatc 24
<210> 5
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
aggtgacact atagaataat caatgtgtca tctagtattt tccaa 45
<210> 6
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gcaagccctc acgtagcgaa ggataggcat agggctttcc ac 42
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (9)..(11)
<223> n=g或a
<400> 7
ccatttttan ttttgaaatg g 21
<210> 8
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
aggtgacact atagaatatg gaaatggccc aactgttgtc 40
<210> 9
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
gcaagccctc acgtagcgaa actgtcttag cctggcagca 40