一种利用高效液相色谱波长切换技术同时检测杜仲中多种活性成分的方法
阅读说明：本技术 一种利用高效液相色谱波长切换技术同时检测杜仲中多种活性成分的方法 (Method for simultaneously detecting multiple active ingredients in eucommia ulmoides by utilizing high performance liquid chromatography wavelength switching technology ) 是由 王志宏 佘志刚 于 2020-10-27 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种利用高效液相色谱波长切换技术同时检测杜仲中多种活性成分的方法。该方法包括如下步骤：S1：将待测杜仲样品粉末处理制成样品溶液；S2：运用高效液相色谱技术,以对照品溶液为对照,对样品溶液中的活性成分进行洗脱,并利用波长切换技术进行分析。本发明提供的方法通过选用合适的流动相,并利用高效液相色谱波长切换技术可对杜仲中的活性成分的色谱峰型进行改善,可更准确、更全面的对杜仲样品中多种特征成分进行分析检测,具有较高的检测准确度与灵敏度,且检测效率高；能够对杜仲资源的品质更好的监管与控制,对中医药现代化与国际化具有重要的意义。(The invention relates to a method for simultaneously detecting multiple active ingredients in eucommia ulmoides by utilizing a high performance liquid chromatography wavelength switching technology. The method comprises the following steps: s1: processing eucommia ulmoides sample powder to be detected to prepare a sample solution; s2: and (3) eluting the active ingredients in the sample solution by using a high performance liquid chromatography technology and taking a reference substance solution as a reference, and analyzing by using a wavelength switching technology. The method provided by the invention can improve the chromatographic peak pattern of the active ingredients in the eucommia ulmoides by selecting a proper mobile phase and utilizing a high performance liquid chromatography wavelength switching technology, can more accurately and comprehensively analyze and detect various characteristic ingredients in the eucommia ulmoides sample, and has higher detection accuracy and sensitivity and high detection efficiency; can better monitor and control the quality of eucommia ulmoides resources, and has important significance for the modernization and internationalization of Chinese medicines.)
技术领域
本发明涉及植物活性成分检测领域，特别涉及一种利用高效液相色谱波长切换技术同时检测杜仲中多种活性成分的方法。
背景技术
杜仲(Eucommia ulmoides Oliv.)为杜仲科杜仲属多年生落叶乔木，属于我国特有资源，不仅是我国传统滋补药材，而且是名贵经济作物，栽培面积约300万亩，占世界总量的95％以上，资源非常丰富，主要分布于湖南、河南、陕西、贵州、湖北等地。《神农本草经》中将其列为上品，补肝益肾、强筋健骨、久服强身耐老。现代研究证明杜仲皮与叶化学成分组成基本类似，主要包含有环烯醚萜类、木脂素类、苯丙素类、多酚类、黄酮类等成分，具有三降六抗一增的功效：降血压、降血脂、降血糖、抗衰老、抗疲劳、抗肿瘤、抗炎、抗菌、抗病毒和增强免疫。以上活性成分的检测分析，通常采用薄层色谱法(TLC)、紫外-可见分光光度法(UV)和高效液相色谱法(HPLC)等。
2015版《中国药典》关于杜仲皮与叶中主要特征成分松脂醇二葡萄糖苷和绿原酸均有明确的规定。杜仲皮中松脂醇二葡萄糖苷的含量检测方法为高效液相色谱法，用十八烷基硅烷键合硅胶为固定相，以甲醇-水(25:75)为流动相，检测波长为277nm；杜仲叶中绿原酸含量的检测方法也为高效液相色谱法，以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相，以乙腈-0.4％磷酸水(13:87)为流动相，检测波长为327nm。
对于杜仲成分的分析，现有已报道的技术中，高效液相色谱法是较为常用且准确的分析方法。但是目前文献中涉及到同时检测的化合物种类有限，而且不同化合物的最大吸收波长也存在差异，在同时检测多种化合物成分时，检测波长的不合理往往又会直接导致化合物色谱峰的相应值；另外由于杜仲中有些特征化合物的极性也较为相近，所以使用常规的等度洗脱方法，色谱峰分离效果不佳。
因此，开发一种可同时检测杜仲中多种活性成分的方法以对原料及相关样品质量的真实性、优良性和稳定性进行综合评价，实现杜仲资源的高值化利用具有重要的意义。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中同时检测杜仲中的化合物种类有限的缺陷或不足，提供一种利用高效液相色谱波长切换技术同时检测杜仲中多种(9种)活性成分的方法。本发明通过选用合适的流动相，并利用高效液相色谱波长切换技术可对杜仲中的活性成分的色谱峰型进行改善，更准确、更全面的对杜仲样品中多种(9种)特征成分进行分析检测，具有较高的检测准确度与灵敏度；能够对杜仲资源的品质更好的监管与控制，对中医药现代化与国际化具有重要的意义。
为实现上述发明目的，本发明采用如下技术方案：
一种利用高效液相色谱波长切换技术同时检测杜仲中多种活性成分的方法，包括如下步骤：
S1：将待测杜仲样品粉末处理制成样品溶液；
S2：运用高效液相色谱技术，以对照品溶液为对照，对样品溶液中的活性成分进行洗脱，并利用波长切换技术进行分析；
其中，流动相A为甲醇溶液，流动相B为0.1％磷酸水溶液，进行梯度洗脱；波长切换技术分析的条件为：0.01～15min，207nm；15～23.5min，238nm；23.5～28.5min，326nm；28.5～32.00min，240nm；32.00～40.00min，226nm；40.00～43.00min，254nm；43～90min，370nm。
本发明通过选用合适的流动相，并利用高效液相色谱波长切换技术可对杜仲中的活性成分的色谱峰型进行改善，更准确、更全面的对杜仲样品中多种(9种)特征成分进行分析检测，具有较高的检测准确度与灵敏度，且检测效率高。
本发明提供的方法既可以较为全面的检测杜仲中主要的特征成分，又可以确保每种成分在对应的最大吸收波长处被检测，；能够对杜仲资源的品质更好的监管与控制，对中医药现代化与国际化具有重要的意义。
优选地，梯度洗脱条件为：0.00→6.00min，6.0％流动相A，94％流动相B；6.00→13.00min，6.0→13％流动相A，94→87％流动相B；13.00→14.50min，13→18％流动相A，87→82％流动相B；14.50→22.00min，18→20％流动相A，82→80％流动相B；22.00→30.00min，20→40％流动相A，80→60％流动相B；30.00→32.00min，40→45％流动相A，60→55％流动相B；32.00→45.00min，45％流动相A，55％流动相B；45.00→46.00min，45→63％流动相A，55→37％流动相B；46.00→66.00min，63％流动相A，37％流动相B；66.00→68.00min，63→30％流动相A，37→70％流动相B；68.00→70.00min，30→6.0％流动相A，70→94％流动相B；70.99→90.00min，6.0％流动相A，94％流动相B。
优选地，S1中所述样品溶液中杜仲样品粉末的质量浓度为1～50mg/mL。
更为优选地，S1中所述样品溶液中杜仲样品粉末的质量浓度为25mg/mL。
优选地，S1中所述样品溶液通过如下过程制备得到：将杜仲样品粉末溶于甲醇水溶液或乙醇水溶液中，超声处理，过滤，定容即得。
更为优选地，所述甲醇水溶液的质量分数为40～80％；所述乙醇水溶液的质量分数为40～80％。
优选地，S2中所述对照品溶液中含桃叶珊瑚苷、京尼平苷酸、绿原酸、京尼平苷、松脂醇二葡萄糖苷、京尼平、芦丁、槲皮素或山奈酚中的一种或多种。
优选地，S2中所述对照品溶液选用的溶剂为甲醇水溶液或乙醇水溶液。
优选地，色谱柱为ODS柱，十八烷基硅烷键合硅胶填料；流动相的流速为0.8mL/min，柱温为35℃，进样量为10μL。
优选地，所述活性成分为桃叶珊瑚苷、京尼平苷酸、绿原酸、京尼平苷、松脂醇二葡萄糖苷、京尼平、芦丁、槲皮素和山奈酚。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明通过选用合适的流动相，并利用高效液相色谱波长切换技术可对杜仲中的活性成分的色谱峰型进行改善，可更准确、更全面的对杜仲样品中多种(9种)特征成分进行分析检测，具有较高的检测准确度与灵敏度，且检测效率高。
本发明提供的方法既可以较为全面的检测杜仲中主要的特征成分，又可以确保每种成分在对应的最大吸收波长处被检测；能够对杜仲资源的品质更好的监管与控制，对中医药现代化与国际化具有重要的意义。
附图说明
图1为对照品溶液高效液相色谱图；
图2为样品溶液高效液相色谱图。
具体实施方式
下面结合实施例进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下例实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照本领域常规条件或按照制造厂商建议的条件；所使用的原料、试剂等，如无特殊说明，均为可从常规市场等商业途径得到的原料和试剂。本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。
实施例1
本实施例提供一种利用高效液相色谱波长切换技术同时检测杜仲中多种活性成分的方法，包括如下步骤：
1.对照品溶液的制备
依次准确称取对照品桃叶珊瑚苷、京尼平苷酸、绿原酸、京尼平苷、松脂醇二葡萄糖苷、京尼平、芦丁、槲皮素和山奈酚各2.23mg、4.27mg、4.10mg、1.33mg、1.68mg、1.44mg、1.58mg、1.07mg、1.00mg，溶于50％甲醇水溶液，充分溶解，定容至刻度(10mL)。所得溶液为对照品参照溶液，4℃保存，备用。
2.供试样品溶液的制备
称取杜仲待测样品粉末507mg，分别置于具塞锥形瓶中，用50％甲醇溶解，超声辅助溶解30min，充分溶解后，室温冷却，过滤，定容至25mL，即得供试样品溶液，4℃保存，备用。
3.高效液相色谱分析方法
准确移取2.0mL对照品溶液或供试品样品溶液，经0.45μm膜过滤，经高效液相色谱波长切换技术分析，得到对应的色谱图。具体条件如下：
固定相：十八烷基硅烷键合硅胶填料(ODS柱)。
流动相：A相为甲醇，B相为0.1％磷酸水溶液，进行梯度洗脱。
梯度洗脱程序为：0.00→6.00min，6.0％流动相A，94％流动相B；6.00→13.00min，6.0％→13％流动相A，94％→87％流动相B；13.00→14.50min，13％→18％流动相A，87％→82％流动相B；14.50→22.00min，18％→20％流动相A，82％→80％流动相B；22.00→30.00min，20％→40％流动相A，80％→60％流
动相B；30.00→32.00min，40％→45％流动相A，60％→55％流动相B；32.00→45.00min，45％流动相A，55％流动相B；45.00→46.00min，45％→63％流动相A，55％→37％流动相B；46.00→66.00min，63％流动相A，37％流动相B；
66.00→68.00min，63％→30％流动相A，37％→70％流动相B；68.00→70.00min，30％→6.0％流动相A，70％→94％流动相B；70.99→90.00min，6.0％流动相A，94％流动相B。
检测波长：0.01～15min，207nm；15～23.5min，238nm；23.5～28.5min，326nm；28.5～32.00min，240nm；32.00～40.00min，226nm；40.00～43.00min，254nm；43～90min，370nm。
高效液相色谱分析过程中，流动相为1.0mL/min，柱温为35℃，流速为0.8mL/min，进样量为10μL。
按照上述方法，图1为对照品溶液高效液相色谱图，其中化合物1为桃叶珊瑚苷，2为京尼平苷酸，3为绿原酸，4为京尼平苷，5松脂醇二葡萄糖苷，6为京尼平，7为芦丁，8为槲皮素，9为山奈酚。检测结果进行积分处理，杜仲中不同活性成分标准曲线的相关参数如表1所示。
表1杜仲中不同活性成分标准曲线相关参数
对样品溶液进行检测分析，得到样品溶液高效液相色谱图，如图2。可知，杜仲样品中9种特征成分的色谱峰分离度较高，峰形好。本发明的方法可对杜仲样品中活性成分进行定性或定量分析，具有较高的检测准确度与灵敏度，且检测效率高。
综上所述，本发明成功建立了一种利用高效液相色谱波长切换技术同时检测杜仲中多种(9种)成分的方法，不仅可以简便、快速、且高效准确的同时检测杜仲中的多种活性成分，而且可以更加全面的监控不同杜仲样品的天然功效成分的方法，更加准确真实的反映样品的品质，为以杜仲为开发原料的质量控制提供有效保障。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。