含有蛋白的水性液体制剂
阅读说明：本技术 含有蛋白的水性液体制剂 (Aqueous liquid preparation containing protein ) 是由 安川秀仁 花田崇 谷纯也 冈部真二 浅野友香 于 2019-06-25 设计创作，主要内容包括：课题是提供在溶液状态下储存稳定且注射时的疼痛减轻的、含有蛋白作为有效成分的水性液体制剂。解决手段为含有浓度为1～20mM的磷酸缓冲剂和作为有效成分的蛋白的水性液体制剂。例如,一种水性液体制剂,含有作为缓冲剂的浓度为1～20mM的磷酸缓冲剂和作为有效成分的人生长激素,还含有作为非离子性表面活性剂的泊洛沙姆和作为等渗剂的苯酚。(The object is to provide an aqueous liquid preparation containing a protein as an active ingredient, which is stable in storage in a solution state and reduces pain upon injection. The solution is an aqueous liquid preparation containing a phosphate buffer at a concentration of 1 to 20mM and a protein as an active ingredient. For example, an aqueous liquid preparation contains a phosphate buffer at a concentration of 1 to 20mM as a buffer, human growth hormone as an active ingredient, poloxamer as a nonionic surfactant, and phenol as an isotonic agent.)
技术领域
本发明涉及在溶液状态下储存稳定且注射时的疼痛减轻的、含有蛋白作为有效成分的水性液体制剂，详细而言，涉及含有浓度为1～20mM的磷酸缓冲剂作为缓冲剂的、有效成分为蛋白的水性液体制剂。
背景技术
人们正在开发有效成分为蛋白的各种制剂。这些蛋白中的多数是利用基因重组技术制作的重组蛋白。作为高分子的蛋白制剂通过口服给药不被吸收，因此通过皮下注射、肌肉内注射或静脉注射等进行专门给药。因此，在其给药时伴有因注射针刺入而产生的疼痛。制剂中所含的成分会给其疼痛程度带来影响。
人生长激素(hGH)中，野生型是由191个氨基酸残基构成的单链多肽激素。hGH被用作生长激素缺乏性侏儒症(growth hormone deficiency dwarfism)、Turner综合征中的侏儒症、成人生长激素缺乏症(adult growth hormone deficiency)等的治疗药(非专利文献1)。
基于hGH的治疗通常需要以年为单位长期进行，并且在此期间需要将hGH每周分2～4次进行肌肉内注射、或者分6～7次进行皮下注射。因此，为了减轻患者出入医院的负担，基于hGH的治疗通常是在家自己进行注射。另外，以往hGH的制剂是冻干制剂，而冻干制剂在使用时需要用溶解液溶解，因此为了提高患者的便利性，正在开发预先溶解有hGH的水性液体制剂(非专利文献1)。
hGH是向患者的肌肉内或皮下进行注射而给药的。而且，利用hGH的治疗对象多为儿童。因此，更强烈希望hGH制剂的注射所伴随的疼痛少。
现有技术文献
非专利文献
非专利文献1：Growject皮下注射剂6mg/Growject皮下注射剂12mg包装说明书(2017)。
发明内容
发明所要解决的课题
提供在溶液状态下储存稳定且注射时的疼痛减轻的、有效成分为蛋白的水性液体制剂，特别是有效成分为生长激素的水性液体制剂。
用于解决课题的手段
在针对上述目的的研究中，本发明人发现：通过以浓度为1～20mM的磷酸缓冲剂作为水性液体制剂中所含的缓冲剂，在维持生长激素在水性液体制剂中的稳定性的同时可减轻注射时的疼痛，从而完成了本发明。即，本发明包括以下内容。
1. 一种水性液体制剂，含有浓度为1～20mM的磷酸缓冲剂和作为有效成分的蛋白。
2. 上述1的水性液体制剂，其中，该磷酸缓冲剂的浓度为5～16mM。
3. 上述2的水性液体制剂，其中，该磷酸缓冲剂的浓度为8～12mM。
4. 上述1～3中任一项的水性液体制剂，其中，该蛋白的浓度为1～50mg/mL。
5. 上述1～4中任一项的水性液体制剂，该水性液体制剂还含有非离子性表面活性剂。
6. 上述5的水性液体制剂，其中，该非离子性表面活性剂为聚山梨醇酯或泊洛沙姆。
7. 上述5的水性液体制剂，其中，该非离子性表面活性剂选自聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80和泊洛沙姆188。
8. 上述5～7中任一项的水性液体制剂，其中，该非离子性表面活性剂的浓度为1～10mg/mL。
9. 上述1～8中任一项的水性液体制剂，该水性液体制剂还含有防腐剂。
10. 上述9所述的水性液体制剂，其中，该防腐剂为苄醇或苯酚。
11. 上述9的水性液体制剂，其中，该防腐剂为苄醇，该苄醇的浓度为2～20mg/mL。
12. 上述9的水性液体制剂，其中，该防腐剂为苯酚，该苯酚的浓度为1～10mg/mL。
13. 上述1～12中任一项的水性液体制剂，该水性液体制剂还含有等渗剂。
14. 上述13的水性液体制剂，其中，该等渗剂为中性盐或糖醇。
15. 上述13的水性液体制剂，其中，该等渗剂为氯化钠或D-甘露醇。
16. 上述1～15中任一项的水性液体制剂，该水性液体制剂的pH为5.5～7.2。
17. 上述1的水性液体制剂，该水性液体制剂含有1～50mg/mL的蛋白、5～16mM的磷酸缓冲剂、1.8～2.2mg/mL的泊洛沙姆188、2.8～3.8mg/mL的苯酚和35～45mg/mL的D-甘露醇，且pH为6.0～6.4。
18. 上述1～17的水性液体制剂，其中，该蛋白为选自生长激素、生长调节素、胰岛素、胰高血糖素、溶酶体酶、细胞因子、淋巴因子、凝血因子、抗体、抗体与其他蛋白的融合蛋白、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、促红细胞生成素、达贝泊汀、组织纤溶酶原激活剂(t-PA)、血栓调节蛋白、促卵泡激素(FSH)、促性腺激素释放激素(GnRH)、促性腺激素、DNasel、促甲状腺激素(TSH)、神经生长因子(NGF)、睫状神经营养因子(CNTF)、胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)、神经营养蛋白3、神经营养蛋白4/5、神经营养蛋白6、神经调节蛋白1、激活素、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、成纤维细胞生长因子2(FGF2)、上皮细胞生长因子(EGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、干扰素α、干扰素β、干扰素γ、白细胞介素6、PD-1、PD-1配体、肿瘤坏死因子α受体(TNF-α受体)、具有分解β淀粉状蛋白的活性的酶、依那西普、培维索孟、美曲普汀、阿巴西普、Asfotase和GLP-1受体激动剂的物质。
19. 上述1～17的水性液体制剂，其中，该蛋白为选自小鼠抗体、人源化抗体、人/小鼠嵌合抗体和人抗体的物质。
20. 上述1～17的水性液体制剂，其中，该蛋白为选自抗IL-6抗体、抗β淀粉状蛋白抗体、抗BACE抗体、抗EGFR抗体、抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗HER2抗体、抗PCSK9抗体和抗TNF-α抗体的物质。
21. 上述1～17的水性液体制剂，其中，该蛋白为溶酶体酶，该溶酶体酶为选自α-L-艾杜糖醛酸酶、艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶、葡糖脑苷酯酶、β-半乳糖苷酶、GM2活化蛋白、β-氨基己糖苷酶A、β-氨基己糖苷酶B、N-乙酰葡糖胺-1-磷酸转移酶、α-甘露糖苷酶、β-甘露糖苷酶、半乳糖神经酰胺酶、皂化蛋白C、芳基硫酸酯酶A、α-L-岩藻糖苷酶、天冬氨酰葡糖胺酶、α-N-乙酰半乳糖胺酶、酸性鞘磷脂酶、α-半乳糖苷酶A、β-葡萄糖醛酸苷酶、乙酰肝素N-硫酸酯酶、α-N-乙酰氨基葡糖苷酶、乙酰CoAα-氨基葡糖苷N-乙酰转移酶、N-乙酰葡糖胺-6-硫酸盐硫酸酯酶、酸性神经酰胺酶、淀粉-1,6-葡糖苷酶、唾液酸酶、棕榈酰蛋白硫酯酶-1、三肽基肽酶-1和透明质酸酶-1的物质。
22. 上述1～17的水性液体制剂，其中，该蛋白为抗体与其他蛋白的融合蛋白，该其他蛋白为选自生长激素、溶酶体酶、细胞因子、淋巴因子、凝血因子、抗体、抗体与其他蛋白的融合蛋白、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、促红细胞生成素、达贝泊汀、组织纤溶酶原激活剂(t-PA)、血栓调节蛋白、促卵泡激素、DNasel、促甲状腺激素(TSH)、神经生长因子(NGF)、睫状神经营养因子(CNTF)、胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)、神经营养蛋白3、神经营养蛋白4/5、神经营养蛋白6、神经调节蛋白1、激活素、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、成纤维细胞生长因子 2(FGF2)、上皮细胞生长因子(EGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、干扰素α、干扰素β、干扰素γ、白细胞介素6、PD-1、PD-1配体、肿瘤坏死因子α受体(TNF-α受体)和具有分解β淀粉状蛋白的活性的酶的物质。
23. 上述1～17的水性液体制剂，其中，该蛋白为抗体与溶酶体酶的融合蛋白，该溶酶体酶为选自α-L-艾杜糖醛酸酶、艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶、葡糖脑苷酯酶、β-半乳糖苷酶、GM2活化蛋白、β-氨基己糖苷酶A、β-氨基己糖苷酶B、N-乙酰葡糖胺-1-磷酸转移酶、α-甘露糖苷酶、β-甘露糖苷酶、半乳糖神经酰胺酶、皂化蛋白C、芳基硫酸酯酶A、α-L-岩藻糖苷酶、天冬氨酰葡糖胺酶、α-N-乙酰半乳糖胺酶、酸性鞘磷脂酶、α-半乳糖苷酶A、β-葡萄糖醛酸苷酶、乙酰肝素N-硫酸酯酶、α-N-乙酰氨基葡糖苷酶、乙酰CoAα-氨基葡糖苷N-乙酰转移酶、N-乙酰葡糖胺-6-硫酸盐硫酸酯酶、酸性神经酰胺酶、淀粉-1,6-葡糖苷酶、唾液酸酶、棕榈酰蛋白硫酯酶-1、三肽基肽酶-1和透明质酸酶-1的物质。
24. 上述1～23的水性液体制剂，其是通过皮下注射或肌肉内注射进行给药的制剂。
发明效果
根据本发明，可减轻有效成分为蛋白的制剂在注射时的疼痛。
附图说明
[图1]是在实施例1和2中用于让受试者表达疼痛的量规。
具体实施方式
本发明涉及有效成分为蛋白的水性液体制剂。这里，对有效成分的蛋白的种类没有特别限定，例如是：生长激素、生长调节素(包括生长调节素A、B和C)、胰岛素、胰高血糖素、溶酶体酶、细胞因子、淋巴因子、凝血因子(包括凝血因子VII、凝血因子VIII和凝血因子IX)、抗体、抗体与其他蛋白的融合蛋白、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、促红细胞生成素、达贝泊汀(darbepoetin)、组织纤溶酶原激活剂(t-PA)、血栓调节蛋白、促卵泡激素(FSH)、促性腺激素释放激素(GnRH)、促性腺激素、DNasel、促甲状腺激素(TSH)、神经生长因子(NGF)、睫状神经营养因子(CNTF)、胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)、神经营养蛋白3、神经营养蛋白4/5、神经营养蛋白6、神经调节蛋白1、激活素、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、成纤维细胞生长因子 2(FGF2)、上皮细胞生长因子(EGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、干扰素α、干扰素β、干扰素γ、白细胞介素6、PD-1、PD-1配体、肿瘤坏死因子α受体(TNF-α受体)、或具有分解β淀粉状蛋白的活性的酶、依那西普(etanercept)、培维索孟(pegvisomant)、美曲普汀(metreleptin)、阿巴西普(abatacept)、Asfotase、胰高血糖素样肽-1受体激动剂。
在有效成分为抗体的情况下，对抗体的生物种没有特别限定，例如是小鼠抗体、人源化抗体、人/小鼠嵌合抗体、或人抗体。另外，对抗体特异性地结合的抗原没有特别限定，例如是抗IL-6抗体、抗β淀粉状蛋白抗体、抗BACE抗体、抗EGFR抗体、抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗HER2抗体、抗PCSK9抗体、或抗TNF-α抗体。另外，抗体并不限于具有由2条免疫球蛋白轻链和2条免疫球蛋白重链共计4条多肽链构成的基本结构的抗体，只要是保持对特定抗原的特异性的抗体即可，可以是单链抗体、Fab、F(ab’)、F(ab’)2、或抗原结合性片段。
在有效成分为溶酶体酶的情况下，对溶酶体酶的种类没有特别限定，例如是：α-L-艾杜糖醛酸酶、艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶、葡糖脑苷酯酶、β-半乳糖苷酶、GM2活化蛋白、β-氨基己糖苷酶A、β-氨基己糖苷酶B、N-乙酰葡糖胺-1-磷酸转移酶、α-甘露糖苷酶、β-甘露糖苷酶、半乳糖神经酰胺酶、皂化蛋白C(saposin C，鞘脂激活蛋白C)、烯丙基硫酸酯酶A(allylsulfatase A)、α-L-岩藻糖苷酶、天冬氨酰葡糖胺酶、α-N-乙酰半乳糖胺酶、酸性鞘磷脂酶、α-半乳糖苷酶A、β-葡萄糖醛酸苷酶、乙酰肝素N-硫酸酯酶、α-N-乙酰氨基葡糖苷酶、乙酰CoAα-氨基葡糖苷N-乙酰转移酶、N-乙酰葡糖胺-6-硫酸盐硫酸酯酶、酸性神经酰胺酶、淀粉-1,6-葡糖苷酶、唾液酸酶、棕榈酰蛋白硫酯酶-1、三肽基肽酶-1、或透明质酸酶-1。
在有效成分为抗体与其他蛋白的融合蛋白的情况下，对其他蛋白的种类没有特别限定，例如是：生长激素、溶酶体酶、细胞因子、淋巴因子、凝血因子、抗体、抗体与其他蛋白的融合蛋白、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、促红细胞生成素、达贝泊汀、组织纤溶酶原激活剂(t-PA)、血栓调节蛋白、促卵泡激素、DNasel、促甲状腺激素(TSH)、神经生长因子(NGF)、睫状神经营养因子(CNTF)、胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)、神经营养蛋白3、神经营养蛋白4/5、神经营养蛋白6、神经调节蛋白1、激活素、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、成纤维细胞生长因子2(FGF2)、上皮细胞生长因子(EGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、干扰素α、干扰素β、干扰素γ、白细胞介素6、PD-1、PD-1配体、肿瘤坏死因子α受体(TNF-α受体)、或具有分解β淀粉状蛋白的活性的酶。
在其他蛋白为溶酶体酶的情况下，对溶酶体酶的种类没有特别限定，例如是：α-L-艾杜糖醛酸酶、艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶、葡糖脑苷酯酶、β-半乳糖苷酶、GM2活化蛋白、β-氨基己糖苷酶A、β-氨基己糖苷酶B、N-乙酰葡糖胺-1-磷酸转移酶、α-甘露糖苷酶、β-甘露糖苷酶、半乳糖神经酰胺酶、皂化蛋白C、芳基硫酸酯酶A、α-L-岩藻糖苷酶、天冬氨酰葡糖胺酶、α-N-乙酰半乳糖胺酶、酸性鞘磷脂酶、α-半乳糖苷酶A、β-葡萄糖醛酸苷酶、乙酰肝素N-硫酸酯酶、α-N-乙酰氨基葡糖苷酶、乙酰CoAα-氨基葡糖苷N-乙酰转移酶、N-乙酰葡糖胺-6-硫酸盐硫酸酯酶、酸性神经酰胺酶、淀粉-1,6-葡糖苷酶、唾液酸酶、棕榈酰蛋白硫酯酶-1、三肽基肽酶-1、或透明质酸酶-1。
对作为有效成分包含在水性液体制剂中的蛋白的生物种没有特别限定，优选为人蛋白。该蛋白可利用基因重组技术以重组蛋白的形式生产。重组蛋白例如可通过如下制造：将编码该蛋白的基因并入到表达载体中，使用其来转化哺乳动物细胞(例如源自中国仓鼠卵巢的CHO细胞)、大肠杆菌等，并培养转化细胞。
本发明中，在谈及“生长激素”时，特别是指人生长激素，但并不限于此，还包含包括牛、马等家畜和狗、猫等宠物在内的哺乳动物的生长激素。“生长激素”还包括：对构成生长激素的1个或多个氨基酸残基进行取代、缺失、插入而得到的生长激素的类似物。
本发明中，生长激素可利用基因重组技术来制造。将生长激素基因并入到表达载体中，使用其转化哺乳动物细胞(例如源自中国仓鼠卵巢的CHO细胞)或大肠杆菌，并培养转化细胞，从而制造具有生物学活性的生长激素的方法，为本领域技术人员所公知(US2010/0227819、US4342832等)。
本发明中，对水性液体制剂中所含的蛋白的浓度没有特别限定。但是，其浓度优选为1～50mg/mL，更优选为1～10mg/mL，进一步优选为2～8mg/mL。适合的蛋白浓度例如是4mg/mL或8mg/mL。在蛋白为生长激素的情况下，特别优选这些的浓度。
本发明的蛋白的水性液体制剂是含有磷酸缓冲剂作为缓冲剂而形成的。水性液体制剂中所含的磷酸缓冲剂的浓度优选为1～20mM，更优选为5～16mM，进一步优选为8～15mM，更进一步优选为8～12mM。例如，水性液体制剂中的最终浓度调整成10mM、11mM或12mM。含有缓冲剂的水性液体制剂的pH优选为5.5～7.2，更优选为6.0～6.4，进一步优选为6.0～6.3，特别优选为6.2。
本发明的蛋白的水性液体制剂进一步含有非离子性表面活性剂。水性液体制剂中所含的非离子性表面活性剂可单独使用聚山梨醇酯或泊洛沙姆等，或者将它们组合使用。作为聚山梨醇酯，聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80特别适合，作为泊洛沙姆，泊洛沙姆188(聚氧乙烯(160)聚氧丙烯(30)二醇)特别适合。另外，水性液体制剂中所含的非离子性表面活性剂的浓度优选为1～10mg/mL，更优选为1～5mg/mL，进一步优选为1～3mg/mL，更进一步优选为1.5～2.5mg/mL，更进一步优选为1.8～2.2mg/mL，例如调整至2mg/mL。在使用泊洛沙姆188(聚氧乙烯(160)聚氧丙烯(30)二醇)作为非离子性表面活性剂的情况下，其在水性液体制剂中的浓度优选为1～10mg/mL，更优选为1～5mg/mL，进一步优选为1～3mg/mL，更进一步优选为1.5～2.5mg/mL，更进一步优选为1.8～2.2mg/mL，例如调整至2mg/mL。
还设想蛋白的水性液体制剂不是一次性的，在开封后不是单次、而是反复使用。这种情况下，希望可防止在反复使用中因细菌的混入而导致品质劣化。因此，本发明的蛋白的水性液体制剂可含有防腐剂。水性液体制剂中所含的防腐剂只要是药剂学上可接受的物质即可，没有特别限定，可适合地使用苄醇、苯酚、苯甲酸、或它们的混合物。
在使用苯酚作为防腐剂的情况下，其在水性液体制剂中的浓度优选为1～10mg/mL，更优选为2.5～4.0mg/mL，进一步优选为2.8～3.8mg/mL，例如是3.3mg/mL。在使用苄醇作为防腐剂的情况下，其在水性液体制剂中的浓度优选为2～20mg/mL，更优选为7～12mg/mL，进一步优选为8～10mg/mL，例如是9mg/mL。在使用苯甲酸作为防腐剂的情况下，其在水性液体制剂中的浓度优选为1～20mg/mL。
本发明的蛋白的水性液体制剂中还可含有等渗剂。水性液体制剂中所含的等渗剂只要是药剂学上可接受的物质即可，没有特别限定，可适合地使用糖醇、中性盐、或它们的混合物。作为糖醇，可列举D-甘露醇作为适合的糖醇，作为中性盐，可列举氯化钠作为适合的中性盐。在使用D-甘露醇作为等渗剂的情况下，其在水性液体制剂中的浓度优选为35～70mg/mL，更优选为35～45mg/mL，例如是40mg/mL。在使用氯化钠作为等渗剂的情况下，其在水性液体制剂中的浓度优选为5.5～11.5mg/mL，更优选为5.5～7.5mg/mL，例如是6.5mg/mL。然而，等渗剂的浓度并不限于这些，应根据其与水性液体制剂中的其他成分的浓度的关系而适当调整。通常，等渗剂的浓度调整成，使水性液体制剂的渗透压以生理盐水为对照时的渗透压比达到0.9～1.6、更优选0.9～1.1。需要说明的是，本发明中，在谈及渗透压比时，是指相对于生理盐水的渗透压比。
以下示出本发明的蛋白的水性液体制剂的适合例。
(适合例1) 含有1～50mg/mL的蛋白、5～16mM的磷酸缓冲剂、1.8～2.2mg/mL的泊洛沙姆188、2.8～3.8mg/mL的苯酚和35～45mg/mL的D-甘露醇，且pH为6.0～6.4的水性液体制剂。但是，可以是为了调节pH而进一步添加有磷酸或/和氢氧化钠的水性液体制剂，且D-甘露醇的浓度可增减以使渗透压比达到0.9～1.1。另外，可代替苯酚，添加8～10mg/mL的苄醇。
(适合例2) 含有1～10mg/mL的蛋白、8～15mM的磷酸缓冲剂、1.8～2.2mg/mL的泊洛沙姆188、2.8～3.8mg/mL的苯酚和35～45mg/mL的D-甘露醇，且pH为6.0～6.4的水性液体制剂。但是，可以是为了调节pH而进一步添加有磷酸或/和氢氧化钠的水性液体制剂，且D-甘露醇的浓度可增减以使渗透压比达到0.9～1.1。另外，可代替苯酚，添加8～10mg/mL的苄醇。
(适合例3) 含有2～8mg/mL的蛋白、10mM的磷酸缓冲剂、2mg/mL的泊洛沙姆188、3.3mg/mL的苯酚和40mg/mL的D-甘露醇，且pH为6.2的水性液体制剂。但是，可以是为了调节pH而进一步添加有磷酸或/和氢氧化钠的水性液体制剂，且D-甘露醇的浓度可增减以使渗透压比达到0.9～1.1。另外，可代替苯酚，添加8～10mg/mL的苄醇。
本发明的蛋白的水性液体制剂即使在2～8℃下长期保存，蛋白也不会劣化。这里，蛋白劣化是指，与将水性液体制剂作为制剂刚刚填充至小瓶或注射器后相比，蛋白的定量值变为98%以下、例如95%以下。另外，与将水性液体制剂作为制剂刚刚填充至小瓶或注射器后相比，蛋白本来具有的活性变为98%以下、例如95%以下，这种情况也视为蛋白劣化。
可进行保存而不使蛋白劣化的期限优选为至少18个月，更优选为24个月，进一步优选为30个月，更进一步优选为36个月。
本发明的蛋白的水性液体制剂通过肌肉内注射、皮下注射等对患者给药。若注射时伴有疼痛，则患者的用药依从性降低，有可能导致得不到充分的治疗效果的结果。若根据本发明的水性液体制剂，则由于患者在注射时感受的疼痛减轻，所以患者的用药依从性上升，而且患者不会逃避用药。
虽然注射时感受的疼痛是主观性的，但作为客观地评价疼痛的方法，通常采用视觉模拟量表(VAS：Visual Analogue Scale)。VAS是大致包括以下步骤的方法。(1)向受试者出示左端显示无痛、右端显示可想象的最高疼痛的100mm的直线，(2)在该直线上显示受试者自身所感受的疼痛，(3)将受试者所显示的疼痛数值化并总计。
此外，作为客观地评价疼痛的方法，已知还有数字评价量表(NRS：NumericalRating Scale)。数字评价量表是大致包括以下步骤的方法。(1)向受试者出示将疼痛划分为从无痛至最剧烈的疼痛的11个等级的直线，(2)代用该直线上所示的数值来表达受试者自身所感受的疼痛，(3)总计该数值。
此外，作为客观地评价疼痛的方法，已知还有Faces Pain Scale (面部表情量表：Face scale)。VAS和NRS是受试者代用量规上所示的数值来表达自身所感受的疼痛的方法，而面部表情量表是代用与量规上所示的疼痛相对应的人的表情来表达受试者自身所感受的疼痛的方法。
作为客观地评价疼痛的方法，还可采用将VAS、NRS和面部表情量表适当组合而成的方法或进行改变而得到的方法，另外，并不限于这些。
本发明的水性液体制剂，在利用上述的客观地评价疼痛的方法评价将其皮下注射时受试者所感受的疼痛时，例如，该疼痛与皮下注射生理盐水时同等、或者在其以下。
以下，对水性液体制剂中所含的蛋白为生长激素的情况进行详述。
本发明中，对水性液体制剂中所含的生长激素的浓度没有特别限定。但是，其浓度优选为1～12mg/mL，更优选为2～8mg/mL。适合的生长激素的浓度例如是4mg/mL或8mg/mL。
本发明的生长激素的水性液体制剂是含有磷酸缓冲剂作为缓冲剂而形成的。水性液体制剂中所含的磷酸缓冲剂的浓度优选为1～20mM，更优选为5～16mM，进一步优选为8～15mM，更进一步优选为8～12mM。例如，磷酸缓冲剂在水性液体制剂中的最终浓度调整成10mM、11mM或12mM。含有缓冲剂的水性液体制剂的pH优选为5.5～7.2，更优选为6.0～6.4，进一步优选为6.0～6.3，更进一步优选为6.0～6.2，特别是6.2。
本发明的生长激素的水性液体制剂进一步含有非离子性表面活性剂。水性液体制剂中所含的非离子性表面活性剂可单独使用聚山梨醇酯或泊洛沙姆等，或者将它们组合使用。作为聚山梨醇酯，聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80特别适合，作为泊洛沙姆，泊洛沙姆188(聚氧乙烯(160)聚氧丙烯(30)二醇)特别适合。另外，水性液体制剂中所含的非离子性表面活性剂的浓度优选为1～10mg/mL，更优选为1～5mg/mL，进一步优选为1～3mg/mL，更进一步优选为1.5～2.5mg/mL，更进一步优选为1.8～2.2mg/mL，例如调整至2mg/mL。在使用泊洛沙姆188(聚氧乙烯(160)聚氧丙烯(30)二醇)作为非离子性表面活性剂的情况下，其在水性液体制剂中的浓度优选为1～5mg/mL，更优选为1～3mg/mL，进一步优选为1.5～2.5mg/mL，更进一步优选为1.8～2.2mg/mL，例如调整至2mg/mL。
还设想生长激素的水性液体制剂不是一次性的，在开封后不是单次、而是反复使用。这种情况下，希望可防止在反复使用中因细菌的混入而导致品质劣化。因此，本发明的生长激素的水性液体制剂可含有防腐剂。水性液体制剂中所含的防腐剂只要是药剂学上可接受的物质，则没有特别限定，可适合地使用苄醇、苯酚、苯甲酸、或它们的混合物。
在使用苯酚作为防腐剂的情况下，其在水性液体制剂中的浓度优选为1～10mg/mL，进一步优选为2.5～4.0mg/mL，进一步优选为2.8～3.8mg/mL，例如是3.3mg/mL。在使用苄醇作为防腐剂的情况下，其在水性液体制剂中的浓度优选为2～20mg/mL，进一步优选为7～12mg/mL，进一步优选为8～10mg/mL，例如是9mg/mL。在使用苯甲酸作为防腐剂的情况下，其在水性液体制剂中的浓度优选为1～20mg/mL。
本发明的生长激素的水性液体制剂中，还可含有等渗剂。水性液体制剂中所含的等渗剂只要是药剂学上可接受的物质，则没有特别限定，可适合地使用糖醇、中性盐、或它们的混合物。作为糖醇，可列举D-甘露醇作为适合的糖醇，作为中性盐，可列举氯化钠作为适合的中性盐。在使用D-甘露醇作为等渗剂的情况下，其在水性液体制剂中的浓度优选为35～70mg/mL，更优选为35～45mg/mL，例如是40mg/mL。在使用氯化钠作为等渗剂的情况下，其在水性液体制剂中的浓度优选为25～35mg/mL，更优选为5.5～7.5mg/mL，例如是6.5mg/mL。但是，等渗剂的浓度并不限于这些，应根据其与水性液体制剂中的其他成分的浓度的关系而适当调整。通常，等渗剂的浓度调整成，使水性液体制剂的渗透压以生理盐水为对照时的渗透压比为0.9～1.6、更优选0.9～1.1。
以下示出本发明的生长激素的水性液体制剂的适合例。
(适合例1’) 含有1～12mg/mL的生长激素、5～16mM的磷酸缓冲剂、1.8～2.2mg/mL的泊洛沙姆188、2.8～3.8mg/mL的苯酚和35～45mg/mL的D-甘露醇，且pH为6.0～6.3的水性液体制剂。但是，可以是为了调节pH而进一步添加有磷酸或/和氢氧化钠的水性液体制剂，另外，D-甘露醇的浓度可增减以使渗透压比达到0.9～1.1。另外，可代替苯酚，添加8～10mg/mL的苄醇。
(适合例2’) 含有4～8mg/mL的生长激素、5～16mM的磷酸缓冲剂、1.8～2.2mg/mL的泊洛沙姆188、2.8～3.8mg/mL的苯酚和35～45mg/mL的D-甘露醇，且pH为6.0～6.3的水性液体制剂。但是，可以是为了调节pH而进一步添加有磷酸或/和氢氧化钠的水性液体制剂，另外，D-甘露醇的浓度可增减以使渗透压比达到0.9～1.1。另外，可代替苯酚，添加8～10mg/mL的苄醇。
(适合例3’) 含有4～8mg/mL的生长激素、8～12mM的磷酸缓冲剂、2mg/mL的泊洛沙姆188、3.3mg/mL的苯酚和40mg/mL的D-甘露醇，且pH为6.2的水性液体制剂。但是，可以是为了调节pH而进一步添加有磷酸或/和氢氧化钠的水性液体制剂，另外，D-甘露醇的浓度可增减以使渗透压比达到0.9～1.1。另外，可代替苯酚，添加9mg/mL的苄醇。
(适合例4’) 含有4mg/mL或8mg/mL的生长激素、10mM的磷酸缓冲剂、2mg/mL的泊洛沙姆188、3.3mg/mL的苯酚和40mg/mL的D-甘露醇，且pH为6.2的水性液体制剂。但是，可以是为了调节pH而进一步添加有磷酸或/和氢氧化钠的水性液体制剂，另外，D-甘露醇的浓度可增减以使渗透压比达到0.9～1.1。另外，可代替苯酚，添加9mg/mL的苄醇。
(适合例5’) 含有4mg/mL或8mg/mL的生长激素、10mM的磷酸缓冲剂、2mg/mL的泊洛沙姆188、3.3mg/mL的苯酚和40mg/mL的D-甘露醇，且pH为6.2的水性液体制剂。但是，可以是为了调节pH而进一步添加有磷酸或/和氢氧化钠的水性液体制剂，另外，D-甘露醇的浓度可增减以使渗透压比达到0.9～1.1。另外，可代替苯酚，添加9mg/mL的苄醇。
本发明的生长激素的水性液体制剂可作为填充在小瓶中的制剂，也可作为预先填充在注射器中的制剂即预填充注射器型或药筒型制剂。在制成预填充注射器型或药筒型制剂的情况下，通常将1支注射器中填充的液量调整至1～2mL，例如，在1支注射器中以表示量达到1.5mL的方式进行填充。
生长激素在刚刚调制成水性液体制剂后，其大部分在水溶液中以单体形式存在。然而，若以水性液体制剂的形式保存，则随着时间的流逝而产生二聚体，以单体形式存在的生长激素的比率减少。另外，生长激素的定量值也随着时间的流逝而减少。
本发明的生长激素的水性液体制剂即使在2～8℃下长期保存，生长激素也不会劣化。这里，生长激素劣化是指，与将水性液体制剂作为制剂刚刚填充至小瓶或注射器后相比，以单体形式存在的生长激素的比率变为98%以下、例如95%以下。另外，与将水性液体制剂作为制剂刚刚填充至小瓶或注射器后相比，生长激素的定量值变为98%以下、例如95%以下，这种情况也视为生长激素劣化。
可进行保存而不使生长激素劣化的期限优选为至少18个月，更优选为24个月，进一步优选为30个月，更进一步优选为36个月。
本发明的生长激素的水性液体制剂通过肌肉内注射或皮下注射对患者进行给药。对患者给药由医生进行，除此以外还设想由患者自身或患者的监护人进行。所述类型的药剂要求患者自身或患者的监护人遵守给药时间表，若注射时伴有疼痛，则患者的用药依从性降低，有可能导致得不到充分的治疗效果的结果。若根据本发明的生长激素的水性液体制剂，则由于患者在注射时感受的疼痛减轻，所以患者的用药依从性不会降低，所有患者均可享受本来的治疗效果。
虽然注射时感受的疼痛是主观性的，但作为客观地评价疼痛的方法，通常采用视觉模拟量表(VAS)。VAS是大致包括以下步骤的方法。(1)向受试者出示左端显示无痛、右端显示可想象的最高疼痛的、沿水平方向画出的直线，(2)在该直线上显示受试者自身所感受的疼痛，(3)将受试者所示的疼痛数值化并总计。直线的长度通常为100mm。
此外，作为客观地评价疼痛的方法，已知有数字评价量表(NRS)。数字评价量表是大致包括以下步骤的方法。(1)向受试者出示将疼痛划分为从无痛至最剧烈的疼痛的11个等级的直线，(2)代用该直线上所示的数值来表达受试者自身所感受的疼痛，(3)总计该数值。
此外，作为客观地评价疼痛的方法，已知还有Faces Pain Scale (面部表情量表：Face scale)。VAS和NRS是受试者代用量规上所示的数值来表达自身感受的疼痛的方法，而面部表情量表是代用与量规上所示的疼痛相对应的人的表情来表达受试者自身感受的疼痛的方法。
作为客观地评价疼痛的方法，还可采用将VAS、NRS和面部表情量表适当组合而成的方法或者进行改变而得到的方法，且并不限于这些。
本发明的生长激素的水性液体制剂，在利用上述的客观地评价疼痛的方法评价将其皮下注射时受试者所感受的疼痛时，该疼痛与皮下注射生理盐水时同等、或者在其以下。
实施例
以下，参照实施例来进一步详细说明本发明，但并非旨在本发明受到实施例的限定。
[实施例1] 水性液体制剂的疼痛评价(1)
调制了表1所示的含有磷酸缓冲剂和D-甘露醇的配方1和配方2的水性液体制剂(表1)。配方1和配方2的磷酸缓冲剂浓度分别为20mM和50mM。任一配方的渗透压比均为1.0～1.1。
[表1]
(表1) 水性液体制剂(配方1和配方2)的组成
疼痛的评价使用图1所示的量规来实施，该量规上显示有表达疼痛的示意性的表情。使用该量规，按照以“没有感觉到疼痛”为1、以“认为最剧烈的疼痛”为10的10个等级将疼痛数值化。试验采用3名受试者来进行。对于受试者(20多岁、40多岁和50多岁的男性)，将磷酸缓冲剂浓度为20mM的配方1、磷酸缓冲剂浓度为50mM的配方2和生理盐水避开相同的给药部位各给予1次。以受试者无法辨别所给予的溶液的方式实施给药。给药量均设为125μL，使用注射针(BD micro-fine plus 31G×5mm，Becton, Dickinson and Company)，对受试者的大腿或上臂部的皮下进行给药。向刚刚给药后的受试者出示图1所示的量规，从量规上显示的示意性的表情中选择最适合表现注射时的疼痛的表情。总计所选择的疼痛的数值，求出其平均值作为疼痛的评分。其结果，配方1的疼痛评分为3.0，配方2的疼痛评分为3.7，生理盐水的疼痛评分为2.0。这些结果显示：通过减少磷酸缓冲剂的浓度，可减轻水性液体制剂的注射时的疼痛。需要说明的是，考虑到受试者的安全，使用不含蛋白成分的水性液体制剂进行试验。
[实施例2] 水性液体制剂的疼痛评价(2)
调制了表2所示的含有磷酸缓冲剂、D-甘露醇、泊洛沙姆188和苯酚的配方3～配方5的水性液体制剂(表2)。但是，只有配方5为了调节pH而加入了适量的氢氧化钠。配方3、配方4和配方5的磷酸缓冲剂浓度分别为10mM、20mM和50mM。任一配方的渗透压比均为1.0～1.1。
[表2]
(表2) 水性液体制剂(配方3～配方5)的组成
试验采用3名受试者来进行。对于受试者(20多岁、40多岁和50多岁的男性)，将磷酸缓冲剂浓度为10mM的配方3、磷酸缓冲剂浓度为15mM的配方4、磷酸缓冲剂浓度为50mM的配方5和生理盐水避开相同的给药部位各给予1次。以受试者无法辨别所给予的溶液的方式实施给药。任一给药量均设为125μL，使用注射针(BD micro-fine plus 31Gx5mm，Becton,Dickinson and Company)，对受试者的大腿或上臂部的皮下进行给药。然后，利用与实施例1同样的方法，求出各配方的疼痛评分。其结果，配方3的疼痛评分为2.0，配方4的疼痛评分为2.0，配方5的疼痛评分为4.3，生理盐水的疼痛评分为2.7。这些结果显示：通过将磷酸缓冲剂的浓度设为15mM以下的浓度，可鲜明地减轻水性液体制剂的注射时的疼痛。令人惊讶的是，特别是通过将磷酸缓冲剂的浓度设为15mM以下的浓度，即使与生理盐水相比也可减轻注射时的疼痛。需要说明的是，考虑到受试者的安全，使用不含蛋白成分的水性液体制剂进行试验。
[实施例3] 水性液体制剂的疼痛评价(3)
调制了表3所示的含有磷酸缓冲剂、D-甘露醇、泊洛沙姆188和苯酚的配方6～配方7的水性液体制剂(表3)。但是，只有配方6为了调节pH而加入了适量的氢氧化钠。配方6和配方7的磷酸缓冲剂浓度分别为10mM和50mM。任一配方的渗透压比均为1.0～1.1。
[表3]
(表3) 水性液体制剂(配方6～配方7)的组成
利用31名受试者对磷酸缓冲剂浓度为10mM的配方6、磷酸缓冲剂浓度为50mM的配方7和生理盐水的疼痛进行比较。对于受试者(包括年龄20～70多岁的男女)，避开相同的给药部位，最初给予生理盐水，然后给予配方6和配方7。以受试者无法辨别所给予的溶液的方式实施给药。给药量均设为125μL，使用注射针(BD micro-fine plus 31G×5mm，Becton,Dickinson and Company)，对受试者的大腿或上臂部的皮下进行给药。然后，利用与实施例1同样的方法，求出各配方的疼痛评分。其结果，配方6的疼痛评分为2.6，配方7的疼痛评分为4.9，生理盐水的疼痛评分为2.7。仍然显示：通过降低磷酸缓冲剂的浓度，可减轻注射时的疼痛；以及在磷酸缓冲剂的浓度为10mM的情况下，即使与生理盐水相比也可减轻注射时的疼痛。需要说明的是，考虑到受试者的安全，使用不含蛋白成分的水性液体制剂进行试验。
[实施例4] 人生长激素的水性液体制剂的稳定性评价(1)
调制了表4所示的GH配方1～GH配方4的4种生长激素的水性液体制剂。GH配方1和GH配方2的磷酸缓冲剂的浓度分别为50mM和16mM。GH配方3和GH配方4的组成仅生长激素的浓度不同，磷酸缓冲剂的浓度均为10mM。
[表4]
(表4) 生长激素的水性液体制剂(GH配方1～GH配方4)的组成
分别将 GH配方1～GH配方4的水性液体制剂在玻璃制药筒中各填充1.5mL，在2～8℃的温度下于暗处保存(长期保存试验)，或者在25℃的温度下于暗处保存(加速试验)。在保存期间，相继地，求出溶液的pH、单体(%)和定量(%)。单体(%)和定量(%)通过实施例6所记载的方法来计算。
表5显示磷酸缓冲剂的浓度为50mM的GH配方1的稳定性评价结果。长期保存试验中，在保存开始时、保存开始3个月后、6个月后、9个月后、12个月后、18个月后和24个月后测定pH、单体(%)和定量(%)。在长期保存试验的保存期间中，pH和定量(%)几乎没有变化，单体(%)也保持在99%以上。加速试验中，在保存开始1个月后、2个月后、3个月后测定pH、单体(%)和定量(%)。在加速试验中的保存期间，pH和定量(%)几乎没有变化，单体(%)也保持在98%以上。这些结果显示：GH配方1在2～8℃的温度下于暗处至少24个月期间稳定。另外，在单体量(%)和定量(%)的标准值分别设为98%以上、100%以上的情况下，由通过长期保存试验得到的值预测：即使在保存开始36个月后，在2～8℃的温度下于暗处保存的情况下，GH配方1也满足标准值。
[表5]
(表5) 水性液体制剂(GH配方1)的稳定性(参考例)
表6显示磷酸缓冲剂的浓度为16mM的GH配方2的稳定性评价结果。长期保存试验中，在保存开始时、保存开始1个月后和3个月后测定pH、单体(%)和定量(%)。在长期保存试验的保存期间，pH、单体(%)和定量(%)几乎没有变化，显示与GH配方1同等的值。加速试验中，在保存开始1个月后、2个月后、3个月后测定pH、单体(%)和定量(%)。在加速试验中的保存期间，pH、单体(%)和定量(%)几乎没有变化，显示与GH配方1同等的值。这些结果显示：GH配方2具有与GH配方1同等的稳定性，预测GH配方2在2～8℃的温度下于暗处至少24个月期间稳定。还显示：在单体量(%)和定量(%)的标准值分别设为98%以上、100%以上的情况下，预测GH配方2在2～8℃的温度下于暗处保存的情况下即使36个月后也满足标准值。
[表6]
(表6) 水性液体制剂(GH配方2)的稳定性
表7和表8分别显示磷酸缓冲剂的浓度为10mM的GH配方3和GH配方4的稳定性评价结果。长期保存试验中，在保存开始时、保存开始约1个月后(4周后)测定pH、单体(%)和定量(%)。所有配方中，在长期保存试验的保存期间，pH、单体(%)和定量(%)几乎没有变化，显示与GH配方1同样的值。加速试验中，在保存开始约1个月后(4周后)测定pH、单体(%)和定量(%)。所有配方中，在加速试验中的保存期间，pH、单体(%)和定量(%)几乎没有变化，显示与GH配方1同样的值。这些结果显示：GH配方3和4具有与GH配方1同等的稳定性，预测GH配方3和4在2～8℃的温度下于暗处至少24个月期间稳定。还显示：在单体量(%)和定量(%)的标准值分别设为98%以上、100%以上的情况下，预测GH配方3和4在2～8℃的温度下于暗处保存的情况下即使36个月后也满足标准值。
[表7]
(表7) 水性液体制剂(GH配方3)的稳定性
[表8]
(表8) 水性液体制剂(GH配方4)的稳定性
[实施例5] 人生长激素的水性液体制剂的稳定性评价(2)
对磷酸缓冲剂的浓度为10mM的GH配方3和GH配方4进行从保存开始到9个月的长期保存试验和从保存开始到3个月的加速试验。表9和表10分别显示GH配方3和GH配方4的稳定性评价结果。长期保存试验中，在保存开始时、保存开始1个月后、2个月后、3个月后、6个月后和9个月后测定pH、单体(%)和定量(%)。所有配方中，在长期保存试验的保存期间，pH、单体(%)和定量(%)几乎没有变化，显示与GH配方1同样的值。加速试验中，在保存开始1个月后、2个月后和3个月后测定pH、单体(%)和定量(%)。所有配方中，在加速试验的保存期间，pH、单体(%)和定量(%)几乎没有变化，显示与GH配方1同样的值。这些结果显示：GH配方3和4具有与GH配方1同等的稳定性，预测GH配方3和4在2～8℃的温度下于暗处至少24个月期间稳定。还显示：在单体量(%)和定量(%)的标准值分别设为98%以上、100%以上的情况下，预测GH配方3和4在2～8℃的温度下于暗处保存的情况下即使36个月后也满足标准值。
[表9]
(表9) 水性液体制剂(GH配方3)的稳定性
[表10]
(表10) 水性液体制剂(GH配方4)的稳定性
[实施例6] 生长激素的单体(%)的测定和生长激素的定量
单体(%)的测定通过利用尺寸排阻HPLC (SE-HPLC)对样品进行分析来进行。在高效液相色谱装置LC-20A (包括系统控制器CBM-20A、在线脱气单元DGU-20A5R、送液单元LC-20AB、自动采样器SIL-20AC、柱温箱CTO-20AC和紫外可见检测器SPD-20AV或SPD-20A，岛津制作所公司)上安装填充有排阻极限分子量为5×105、粒径为5μm的液相色谱用亲水性硅胶的柱即TSKgel G3000SWXL (内径7.8mm×30cm，Tosoh公司)。用流动相(将15.6g磷酸二氢钠二水合物、35.8g磷酸氢二钠十二水合物和11.7g氯化钠溶解于水，达到1000mL后，使用孔径为0.22μm的薄膜滤器进行过滤而得到的溶液)使柱达到平衡，在柱上应用由纯水稀释到生长激素浓度为1～2mg/mL的样品，监测215nm的吸光度，从而制作洗脱曲线。流速设为0.5mL/分钟。利用单体(%)=单体峰面积/(单体峰面积+二聚体峰面积)×100(%)的算式，由洗脱曲线上的对应于单体的峰的面积(单体峰面积)和对应于二聚体的峰的面积(二聚体峰面积)求出单体(%)。
另外，利用SE-HPLC分析浓度已知的生长激素来制作标准曲线，在其上内插单体面积，从而将样品中以单体形式存在的生长激素定量。求出由标准曲线求得的保存开始时溶液中所含的生长激素的理论值设为100%时的各样品的定量值，作为定量(%)。
产业实用性
根据本发明，可提供一种在溶液状态下储存稳定且注射时的疼痛减轻的、含有蛋白作为有效成分的水性液体制剂。