大麻二酚在制备治疗急性b淋巴细胞白血病的药物中的应用
阅读说明：本技术 大麻二酚在制备治疗急性b淋巴细胞白血病的药物中的应用 (Application of cannabidiol in preparation of medicine for treating acute B lymphocyte leukemia ) 是由 冯敏 张寒 于 2020-12-30 设计创作，主要内容包括：本发明公开了大麻二酚在制备治疗急性B淋巴细胞白血病的药物中的应用。本发明提供了一种大麻二酚(CBD)的新的医药用途,它可以有效降低急性B淋巴细胞白血病细胞的存活率,并在对白血病细胞有效的剂量下不影响正常细胞的存活,为急性B淋巴细胞白血病的治疗提供了一种潜在的药物。(The invention discloses an application of cannabidiol in preparation of a medicine for treating acute B lymphocyte leukemia. The invention provides a new medical application of Cannabidiol (CBD), which can effectively reduce the survival rate of acute B lymphocyte leukemia cells, does not influence the survival of normal cells under the effective dose to the leukemia cells, and provides a potential medicine for treating the acute B lymphocyte leukemia.)
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体涉及大麻二酚(cannabidiol,CBD)在制备用于治疗急性B淋巴细胞白血病的产品中的应用。
背景技术
急性淋巴细胞白血病(acute lymphoblastic leukemia,ALL)是较为常见的一类白血病，主要由于淋巴系造血祖细胞分化障碍、增殖失控、凋亡受阻原因，使大量肿瘤细胞的非正常克隆抑制了正常造血系统，从而引发严重的临床症状及并发症。ALL较常见于儿童，是儿童期最常见的恶性肿瘤和主要死亡原因之一，我国儿童白血病发病率为4～6/10万，且发病率呈现逐年上升趋势，约占儿童白血病的75％以上。随着联合化疗及支持疗法的应用，目前在我国儿童ALL的无病生存率能大约能达到80％。成人ALL发病率较低，约占白血病的20％左右。但成人ALL的治疗效果不尽人意，即使进行造血干细胞移植，也仅有30-50％的成人ALL可达到无病生存，复发率可达到约50％，是目前白血病治疗的难点。此外，在治疗过程中，仍存在诸多尚待解决的问题，包括高剂量化疗可能会增加患者与治疗相关的死亡率和继发第二肿瘤；耐药和复发；以及病程和治疗中的疼痛控制；如何提高患者生存质量等。以上问题也成为影响白血病患儿康复，以及提高成人白血病患者治疗效果的关键因素，不仅给患者本身、而且给家庭和社会带来了不可弥补的严重伤害和沉重的经济负担。
化疗是多数ALL的可选的治疗方案，但化疗药物由于其细胞毒性，在其应用过程中在杀伤肿瘤细胞的同时也会对正常细胞产生毒性作用，使患者在接受化疗期间出现各种不同程度的副作用，导致患者生存质量普遍下降，甚至因不能耐受而被迫中断治疗，严重影响了疗效与疾病的转归。所以，仍需开发更优的用于ALL治疗的药物。
按照肿瘤细胞来源的不同可将ALL分为急性T淋巴细胞白血病(T-ALL)和急性B淋巴细胞白血病(B-ALL)。其中，B-ALL是ALL的主要类型，约占所有ALL的60-70％。在对T-ALL和B-ALL的临床治疗中，由于肿瘤细胞的来源、细胞免疫抗原、功能等方面存在诸多方面的差异，导致治疗药物及治疗方案也存在较大差异，对于T-ALL有效的药物通常对于B-ALL无效，反之亦然。例如目前用于治疗T-ALL的药物奈拉滨(Nelarabine)，在该药物进行临床实验期间发现T-ALL的患者用药后显著改善或缓解，而B-ALL的患者则几乎无效[1]。近年来，大麻二酚(CBD)显示出具有抗肿瘤的效果，Robert J.Mckallip等人[2]在2006年讨论了大麻二酚(CBD)对T-ALL细胞系Jurkat的抑制作用。但是，该文章仅限于大麻二酚(CBD)在T-ALL上的结果，并不能用于预测在B-ALL上的功效。
发明内容
本发明的目的是在现有技术的基础上，提供一种大麻二酚在医药方面的新用途。
本发明的目的可以通过以下措施达到：
大麻二酚(CBD)在制备治疗急性B淋巴细胞白血病的药物方面的应用。
本发明中的大麻二酚(CBD)为植物大麻中提取的纯天然成分，或者人工合成的与天然大麻二酚具有相同结构和化学分子式的物质。
本发明还提供了一种能够治疗急性B淋巴细胞白血病的药物组合物，它以大麻二酚(CBD)为活性成分，或主要活性成分，辅以药学上可接受的载体。
本发明的药物组合物可以用本领域已知的方式配制成临床上或药学上可接受的任一剂型，例如固体制剂或液体制剂，具体可包括但不限于片剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂、注射剂、喷雾剂、溶液剂、混悬剂、糖浆剂等。根据用药途径的不同，可以分别制成皮下注射制剂、静脉注射制剂、口服制剂、涂抹制剂等，例如用于口服给药时，可制成常规的固体制剂，如片剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂等；也可制成口服液体制剂，如口服溶液剂、口服混悬剂、糖浆剂等。
在制剂化的情况下，使用通常使用的填充剂、增量剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、表面活性剂等稀释剂或赋形剂而制造。用于口服给药的固态制剂可以混合所述化合物与一种以上的赋形剂，如淀粉、碳酸钙、蔗糖、乳糖或明胶等而调制。并且，除了简单的赋形剂以外，还使用硬脂酸镁、滑石等润滑剂。用于口服的液态制剂可以包括通常使用的作为简单稀释剂的水、液体石蜡以外的多种赋形剂，如润湿剂、甜味剂、芳香剂、防腐剂等。在用于非口服给药的制剂中，作为非水性溶剂、混悬剂可以使用丙二醇(propylene glycol)、聚乙二醇、橄榄油等植物油、油酸乙酯等可注射的酯类等。作为佐剂的基底可以使用witepsol、聚乙二醇，吐温61、可可脂、月桂酸甘油酯、甘油明胶等。
本发明中的药用组合物指的是在此描述的一种或多种化合物或者它们的药学上可接受的盐和前药与其它的化学成分，例如药学上可接受的载体和/或赋形剂的混合物。药用组合物的目的是促进化合物对生物体的给药。
本发明检测了不同剂量大麻二酚(CBD)的功效。将多种急性B淋巴细胞白血病细胞系，包括Nalm-6、Reh、RS4；11培养在含有10％FBS的RPMI-1640培养基中，采用不同浓度大麻二酚(CBD)处理48小时后，检测细胞存活率。并利用Compusyn软件计算药物的半抑制浓度IC50。大麻二酚(CBD)在不同白血病细胞上的IC50分别为11.77μM、12.22μM、17.10μM。
本发明进一步检测了大麻二酚(CBD)在剂量为15μM时的功效。大麻二酚在此剂量下可达到对多个急性B淋巴细胞白血病细胞系的半抑制。将急性B淋巴细胞白血病细胞和健康人外周血单核细胞培养在含有10％FBS的RPMI-1640培养基中，用15μM浓度的大麻二酚(CBD)处理48小时后，检测细胞存活率。健康人外周血单核细胞、人急性B淋巴细胞白血病细胞系Nalm-6、Reh、RS4；11的存活率分别为100％、42.39％、42.26％、50.40％。
本发明的有益效果：
本发明提供了一种大麻二酚(CBD)的新的医药用途，它可以有效降低急性B淋巴细胞白血病细胞的存活率，并在对白血病细胞有效的剂量下不影响正常细胞的存活，为急性B淋巴细胞白血病的治疗提供了一种潜在的药物。
附图说明
图1为不同浓度大麻二酚(CBD)处理48小时后的人急性B淋巴细胞白血病细胞Nalm-6的存活率及药物半抑制浓度的统计图；
图中，IC50数值为Nalm-6细胞的药物半抑制浓度。
图2为不同浓度大麻二酚(CBD)处理48小时后的人急性B淋巴细胞白血病细胞Reh的存活率及药物半抑制浓度的统计图；
图中，IC50数值为Reh细胞的药物半抑制浓度。
图3为不同浓度大麻二酚(CBD)处理48小时后的人急性B淋巴细胞白血病细胞RS4；11的存活率及药物半抑制浓度的统计图；
图中，IC50数值为RS4；11细胞的药物半抑制浓度。
图4为浓度15μM的大麻二酚(CBD)处理从健康人外周血单核细胞、多种人急性B淋巴细胞白血病细胞(Nalm-6，Reh，RS4；11)48小时后的细胞存活率；
图中，PBMC代表健康人外周血单核细胞，Nalm-6，Reh，RS分别代表不同的人急性B淋巴细胞白血病细胞，*表示p值小于0.001。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。
下述实施例中的实验均设置三次重复，结果取平均值±标准差。统计分析采用t检验。*表示p值小于0.001。
下述实施例中的人急性B淋巴细胞白血病细胞系Nalm-6是德国微生物菌种保藏中心(DSMZ)的产品。人急性B淋巴细胞白血病细胞系Reh、RS4；11是北京北纳创联生物技术研究院的产品。上述细胞系均通过细胞STR鉴定确认。
下述实施例中的大麻二酚为大麻类植物提取物经纯化重结晶后得到的纯度大于99％的化合物。
下述实施例中的RPMI-1640培养基是Thermo Fisher Scientific的产品，货号为C11875500BT。
下述实施例中的半抑制浓度(IC50)是指50％肿瘤细胞生长受到抑制时的药物浓度。
下述实施例中使用细胞存活率检测方法为：将供试细胞分别培养在1mL含有10％FBS的RPMI-1640培养基的24孔板中，细胞密度为4×104～1×105个/孔，分别加入不同药物浓度的大麻二酚(CBD)，48小时后收获细胞，采用美国Promega公司的CellTiter-Blue细胞活力测定试剂盒检测细胞存活率并计算药物的半抑制浓度(IC50)。
实施例1、大麻二酚(CBD)在体外对人急性B淋巴细胞白血病细胞Nalm-6生存的抑制作用
大麻二酚(CBD)溶解在DMSO中至浓度为50μM，在-20℃储存待用。使用之前将大麻二酚(CBD)进一步稀释至所需浓度，确定DMSO浓度低于0.001％。在此实验中使用的人急性B淋巴细胞白血病细胞Nalm-6作为供试细胞。该细胞置于37℃有5％CO2和95％空气的潮湿的气体中条件下培养，培养基为含有10％热灭活的胎牛血清的RPMI-1640。在不同大麻二酚(CBD)浓度下人急性B淋巴细胞白血病细胞Nalm-6的存活率被测试。
结果：图1描述了大麻二酚(CBD)使用时，人急性B淋巴细胞白血病细胞Nalm-6的存活率。可以看出随大麻二酚(CBD)的剂量增加，该白血病细胞的存活率显著减少。在该白血病细胞上，大麻二酚(CBD)的IC50为11.77μM，这显示了大麻二酚(CBD)可有效抑制该白血病细胞的存活。
实施例2、大麻二酚(CBD)在体外对人急性B淋巴细胞白血病细胞Reh生存的抑制作用
大麻二酚(CBD)溶解在DMSO中至浓度为50μM，在-20℃储存待用。使用之前将大麻二酚(CBD)进一步稀释至所需浓度，确定DMSO浓度低于0.001％。在此实验中使用的人急性B淋巴细胞白血病细胞系Reh作为供试细胞。该细胞置于37℃有5％CO2和95％空气的潮湿的气体中条件下培养，培养基为含有10％热灭活的胎牛血清的RPMI-1640。在多种大麻二酚(CBD)浓度下人急性B淋巴细胞白血病细胞Reh的存活率被测试。
结果：图2描述了大麻二酚(CBD)使用时，人急性B淋巴细胞白血病细胞Reh的存活率。可以看出随大麻二酚(CBD)的剂量增加，该白血病细胞的存活率显著减少。在该白血病细胞上，大麻二酚(CBD)的IC50为12.22μM，这显示了大麻二酚(CBD)可有效抑制该白血病细胞的存活。
实施例3、大麻二酚(CBD)在体外对人急性B淋巴细胞白血病细胞RS4；11生存的抑制作用
大麻二酚(CBD)溶解在DMSO中至浓度为50μM，在-20℃储存待用。使用之前将大麻二酚(CBD)进一步稀释至所需浓度，确定DMSO浓度低于0.001％。在此实验中使用的人急性B淋巴细胞白血病细胞系RS4；11作为供试细胞。该细胞置于37℃有5％CO2和95％空气的潮湿的气体中条件下培养，培养基为含有10％热灭活的胎牛血清的RPMI-1640。在多种大麻二酚(CBD)浓度下人急性B淋巴细胞白血病细胞RS4；11的存活率被测试。
结果：图3描述了大麻二酚(CBD)使用时，人急性B淋巴细胞白血病细胞RS4；11的生存能力。可以看出随大麻二酚(CBD)的剂量增加，该白血病细胞的生存能力显著减少。在该白血病细胞上，大麻二酚(CBD)的IC50为17.10μM，这显示了大麻二酚(CBD)可有效抑制该白血病细胞的存活。
实施例4、大麻二酚(CBD)在体外对从健康人外周血分离培养的单核细胞和人急性B淋巴细胞白血病细胞(Nalm-6，Jurkat，Reh，RS4；11)上的细胞毒性
在此实施例中使用的大麻二酚(CBD)浓度为15μM。在此实验例中使用不同人急性B淋巴细胞白血病细胞(Nalm-6，Reh，RS4；11)和健康人外周血分离培养的单核细胞作为供试细胞。从正常志愿者采集的外周血中提取单个核细胞具体操作步骤如下：(1)用等量的生理盐水稀释采集到的抗凝血液；(2)在15ml离心管内加入与血液等体积的Lymphoprep淋巴细胞分离液，并加入稀释好的血液，分离液应在下层，避免血液与分离液的混合；(3)室温下，在水平转子中800×g离心20分钟；(4)离心后用巴氏吸管吸取单细胞层；(5)用生理盐水稀释获得的细胞，250×g离心10分钟，弃上清，收集细胞。置于37℃有5％CO2和95％空气的潮湿的气体中条件下培养，培养基为含有10％热灭活的胎牛血清的RPMI-1640。48小时后，测试不同细胞的存活率。
结果：图4描述了浓度为15μM的大麻二酚(CBD)使用时，对健康人外周血单核细胞，不同人急性B淋巴细胞白血病细胞的细胞毒性。此剂量大麻二酚(CBD)对健康人外周单核细胞无影响，药物处理48小时后细胞存活率为100％；对多种人B淋巴细胞白血病细胞有显著杀伤作用，Nalm-6、Reh、RS4；11细胞系的存活率分别为42.39％、42.26％、50.40％。
以上结果表明，大麻二酚(CBD)可有效抑制多种人急性B淋巴细胞白血病细胞的生存率，并且在有效杀伤白血病细胞的药物浓度下对正常细胞无毒性，可用于人急性B淋巴细胞白血病治疗。
参考文献：
1.J.Kurtzberg,T.J.Ernst,M.J.Keating,V.Gandhi,J.P.Hodge,D.F.KisorJ.J.Lager,C.Stephens,J.Levin,T.Krenitsky,G.Elion,B.S.Mitchell.PhaseI study of 506U78administered on a consecutive 5-day schedule in children andadults with refractory hematologic malignancies.J Clin Oncol.2005May 20；23(15):3396-403.doi:10.1200/JCO.2005.03.199.
2.Robert J McKallip 1,Wentao Jia,Jerome Schlomer,James W Warren,Prakash S Nagarkatti,Mitzi Nagarkatti.Cannabidiol-induced apoptosis in humanleukemia cells:A novel role of cannabidiol in the regulation of p22phox andNox4 expression.Mol Pharmacol.2006Sep；70(3):897-908.doi:10.1124/mol.106.023937.