一种抑制人腺病毒增殖药物的高通量筛选方法及其应用
阅读说明：本技术 一种抑制人腺病毒增殖药物的高通量筛选方法及其应用 (High-throughput screening method for human adenovirus proliferation inhibition drug and application thereof ) 是由 谷峰 商璐 于 2020-12-21 设计创作，主要内容包括：本发明公开一种抑制人腺病毒增殖药物的高通量筛选方法及其应用。该专利中为标记GFP的人腺病毒在感染HEK-293细胞后能表达绿色荧光蛋白,使感染的细胞在荧光显微镜下呈绿色。抗人腺病毒的药物活性通过以下实现,利用流式细胞术检测HEK-293细胞在添加抗腺病毒药物和人腺病毒后,培养基上清中的腺病毒含量的变化。具体操作为,取适量的病毒上清重新加入一定量的HEK-293细胞中,用流式细胞术测定细胞中被腺病毒感染的细胞的比率(带有绿色荧光的细胞),以此来评估添加药物对腺病毒增殖是否有明显的抑制作用。此方法,可以在体外快速、简便,低廉,有效,高通量的筛选候选药物分子是否具有抑制人腺病毒的作用。本专利将加速新型抗人腺病毒药物的研发。(The invention discloses a high-throughput screening method of a medicament for inhibiting human adenovirus proliferation and application thereof. The human adenovirus marked with GFP in the patent can express green fluorescent protein after infecting HEK-293 cells, so that the infected cells are green under a fluorescent microscope. The medicinal activity of anti-human adenovirus is realized by detecting the change of the adenovirus content in the supernatant of the culture medium after adding the anti-adenovirus medicament and the human adenovirus to HEK-293 cells by using flow cytometry. Specifically, a proper amount of virus supernatant is added into a certain amount of HEK-293 cells again, and the ratio of cells infected by adenovirus (cells with green fluorescence) in the cells is determined by flow cytometry, so as to evaluate whether the added medicine has obvious inhibition effect on the proliferation of adenovirus. The method can be used for screening whether the candidate drug molecules have the effect of inhibiting the human adenovirus or not in vitro quickly, simply, conveniently, cheaply, effectively and at high flux. The patent can accelerate the research and development of novel anti-human adenovirus drugs.)
技术领域
本发明涉及一种药物抑制人腺病毒增殖的高通量筛选方法及其应用，可以在体外快速、简便、有效、高通量的对药物是否具有抑制人腺病毒增殖作用进行筛选，有助于新型抗腺病毒药物的研发。
背景技术
人腺病毒是线性、双链、二十面体的DNA病毒，至今有70种人类腺病毒被确认，根据其遗传亲缘关系分为7种（A-G）。不同的腺病毒种类有特定的器官偏好性，C、E、B类病毒感染呼吸道；一些B类病毒感染尿道；A和F的感染靶器官是胃肠道；D类主要感染眼睛，这可能和不同腺病毒的受体不同有关。C（血清学1、2、5）类 主要引起幼儿轻微感染；B（血清学3、7、14、21）类和E类主要引起成年人感染。大多数腺病毒感染可能是亚临床的，但感染可以表现相对温和的上呼吸道疾病，以及更严重的细支气管炎和肺炎，以及腹泻和结膜炎。目前，没有批准的抗病毒药物用于特异的治疗腺病毒感染。虽然西多福韦（Cidofovir，C）和Brincidofovir被用于腺病毒治疗。西多福韦有严重的肾毒性。Brincidofovir (B)是西多福韦的磷脂偶联物，临床上主要用于治疗腺病毒感染引起的疾病。Brincidofovir毒副作用小，优于西多福韦，但部分病人也可能发生肠道毒性。因此，开发新的，高效的，毒副作用低的抗腺病毒药物仍是目前治疗腺病毒疾病的临床重大需求。目前，关于测定抗病毒药物对腺病毒抑制作用的试验主要包括测定病毒含量的免疫荧光定量、免疫荧光、病毒TCID50滴度、病毒空斑减少分析、IC50（半抑制浓度）。用以上方法进行高通量筛选抗腺病毒药物时，耗时长，工作量大，费用高。如何在体外、低廉、高效、快速、高通量的筛选出候选的具有抗腺病毒作用的化合物是抗腺病毒药物研发的关键。而建立快速、简便、有效、高通量的筛选平台对药物是否具有抑制腺病毒增殖作用进行筛选，有助于新的抗腺病毒药物的筛选，为新的抗腺病毒药物的研发提供一个有效的筛选平台。本发明利用抗人腺病毒药物Cidofovir和Brincidofovir作为阳性药物，来评价被筛选药物的效果。
发明内容
本发明的目的是建立一种测定药物抑制腺病毒增殖的高通量筛选方法，以解决用现有常规方法高通量检测药物对腺病毒的抑制作用时的工作量大，耗时长，费用高的问题，有助于新的抗腺病毒药物的筛选，为新的抗腺病毒药物的研发提供一个有效的筛选平台。
具体地，本发明利用pAdTrack-CMV和pAdEasy-1质粒构建质粒pAd-YFP，将质粒pAd-YFP转染到293FT细胞获得整合GFP的人腺病毒，具体方法参考https://media.addgene.org/data/49/60/162ad396-af64-11e0-90fe-003048dd6500.pdf。简单而言，所述方法步骤为：利用PmeI限制性内切酶将质粒pAdTrack-CMV线性化。将线性化的pAdTrack-CMV和腺病毒骨架载体pAdEasy-1质粒共同电转到大肠杆菌BJ5183细胞中。用卡那霉素进行单克隆筛选，将获得的质粒进行酶切鉴定，将鉴定正确的质粒转化到DH10B感受态中，挑取单克隆，进行抽提，获得质粒pAd-YFP。将质粒pAd-YFP用限制性内切酶PacI进行线性化，并用Lipofactamine 转染到293FT细胞中，将获得的病毒感染细胞，获得较高浓度的腺病毒，用于后续试验研究。腺病毒感染后，感染的细胞在荧光显微镜下为绿色，这些显示获得的腺病毒为重组腺病毒。
该腺病毒感染细胞后能够表达绿色荧光蛋白，感染腺病毒细胞呈绿色，可以用于流式筛选。药物抑制腺病毒增殖的高通量筛选方法是将感染病毒后第4 d的病毒上清，重新加入已经铺好的HEK-293细胞中，在加病毒后第2 d进行流式细胞术检测绿色荧光细胞的比例，并设立不感染不加药组（NC），只感染且不加药组（PC），和感染且加药组（不同剂量）。
进一步的，本发明提供一种简便测定抗腺病毒药物抑制腺病毒增殖的高通量筛选方法，主要包括对腺病毒滴度的检测，阳性药物（Brincidofovir，Cidofovir）对HEK-293细胞的MTT试验，药物抑制腺病毒增殖的高通量筛选方法的建立。药物抑制腺病毒增殖的高通量筛选方法的建立主要对药物的不同添加时间点，不同剂量，不同取样点和细胞密度对腺病毒增殖的影响进行研究。
所述方法的步骤为：
1. 整合GFP的腺病毒的制备。
2. 对腺病毒滴度的检测，应用TCID50法进行检测。
3. 阳性药物（Brincidofovir，Cidofovir）对HEK-293细胞的MTT试验，使用MTT试剂盒，按照其说明书进行检测。
4. 药物抑制腺病毒增殖的高通量筛选方法
1）药物的不同添加时间点对腺病毒增殖的影响
主要设计了加病毒前8 h，6 h，4 h，2 h， 0 h，加病毒后2 h，4 h，6 h 添加药物Brincidofovir 1000 nM，测定病毒感染后4d，细胞中绿色细胞数量，和4d的培养基上清再次感染HEK-293细胞后，细胞中绿色细胞的数量。
2）不同剂量的药物对腺病毒增殖的影响
Brincidofovir 的药物浓度设置为5000 nM；1000 nM；500 nM；100 nM；Cidofovir的药物浓度设置为200 µM；100 µM；50 µM；25 µM。在添加药物和病毒后4d，以及4d取的病毒上清再次感染HEK-293细胞后，分别对细胞中绿色细胞的比例进行流式分析。初步选取阳性药物抑制腺病毒增殖的药物浓度。
3）采集病毒上清的时间点和第二次铺板的细胞密度的确定。
用24孔板，取添加药物和病毒后第2d和第4d的培养基上清，分别加入到提前1d铺好的HEK-293细胞中，细胞密度分别为5×104细胞/孔和1×105细胞/孔。上清感染细胞后2d进行流式分析。确定采集病毒上清的时间点和第二次铺板的细胞密度对腺病毒增殖的影响。
4）用48孔板进行不同剂量的药物对腺病毒增殖的影响
用48孔进行筛选时，每孔所铺细胞数为24孔板所铺细胞数的一半。选取病毒感染后3d，4d，5d的细胞上清再次感染HEK-293细胞2d进行流式分析。确定用48孔板进行筛选时，采集病毒上清的时间点。
有益效果
本发明提供的方法使对合成的上百种新的化合物进行同时筛选成为可能，能在短时间内对小分子库的上千种化合物进行筛选。
同时，本发明提供的方法可以实现每次同时筛选200个化合物，流式细胞术分析时在3h内可以完成，整个实验过程需要8 d。TCID50方法、病毒空斑减少分析、IC50（半抑制浓度）方法每次4-5d，只能检测几个化合物，如果需要检测多个化合物时则需要大量的人力物力。用荧光定量方法进行检测，可以实现高通量检测，但需要设计引物，合成探针，每个批次最多只能做96个样本，200个样本需要至少2次，才能做完。耗时多于3h，并且价格昂贵。
附图说明
图1：不同剂量的Brincidofovir 和Cidofovir对HEK-293细胞的MTT试验结果。
A：5-2000nM的 Brincidofovir对HEK-293细胞的MTT试验结果；
B：10-200µM的Cidofovir对HEK-293细胞的MTT试验结果。
图2：加病毒前后不同时间添加药物Brincidofovir 1000nM对腺病毒增殖的影响。
A：加病毒后第4d，不同时间点加药Brincidofovir 1000nM对腺病毒在HEK-293细胞中增殖的影响；
B：加病毒后第4d，不同时间点加药Brincidofovir 1000nM对腺病毒在HEK-293细胞中增殖抑制结果；
C：不同给药时间点添加药物Brincidofovir 1000nM，4d培养基上清中的病毒在HEK-293细胞中的增殖的情况；
D：不同给药时间点添加药物Brincidofovir 1000nM，4d培养基上清中的病毒在HEK-293细胞中的增殖抑制结果。
图3：不同剂量的药物抑制腺病毒增殖的结果。
A：不同剂量的Brincidofovir对腺病毒在HEK-293细胞中增殖（4d）的影响。
B：添加不同剂量的Brincidofovir，病毒上清中腺病毒在HEK-293细胞中增殖（2d）的影响。
C：添加不同剂量的Brincidofovir，病毒上清中腺病毒在HEK-293细胞中增殖抑制（2d）的结果。
D：不同剂量的Cidofovir对腺病毒在HEK-293细胞中增殖（4d）的影响。
E：添加不同剂量的Cidofovir，病毒上清中腺病毒在HEK-293细胞中增殖（2d）的影响。
F：添加不同剂量的Cidofovir，病毒上清中腺病毒在HEK-293细胞中增殖抑制（2d）的结果。
图4：不同采集病毒上清的时间点和第二次HEK-293细胞铺板的细胞密度对不同剂量药物对腺病素增殖的影响。
A：添加不同剂量的Brincidofovir和病毒感染细胞后， 取第2d的培养基上清100µL感染提前1d铺有5×104细胞HEK-293细胞，上清中腺病毒在HEK-293细胞中的增殖情况。
B：添加不同剂量的Brincidofovir和病毒感染细胞后， 取第2d的培养基上清100µL感染提前1d铺有1×105细胞HEK-293细胞，上清中腺病毒在HEK-293细胞中的增殖情况。
C：添加不同剂量的Brincidofovir和病毒感染细胞后， 取第4d的培养基上清100µL感染提前1d铺有5×104细胞HEK-293细胞，上清中腺病毒在HEK-293细胞中的增殖情况。
D：添加不同剂量的Brincidofovir和病毒感染细胞后， 取第4d的培养基上清100µL感染提前1d铺有1×105细胞HEK-293细胞，上清中腺病毒在HEK-293细胞中的增殖情况。
E：添加不同剂量的Cidofovir和病毒感染细胞后， 取第2d的培养基上清100µL感染提前1d铺有5×104细胞HEK-293细胞，上清中腺病毒在HEK-293细胞中的增殖情况。
F：添加不同剂量的Cidofovir和病毒感染细胞后， 取第2d的培养基上清100µL感染提前1d铺有1×105细胞HEK-293细胞，上清中腺病毒在HEK-293细胞中的增殖情况。
G：添加不同剂量的Cidofovir和病毒感染细胞后， 取第4d的培养基上清100µL感染提前1d铺有5×104细胞HEK-293细胞，上清中腺病毒在HEK-293细胞中的增殖情况。
H：添加不同剂量的Cidofovir和病毒感染细胞后， 取第4d的培养基上清100µL感染提前1d铺有1×105细胞HEK-293细胞，上清中腺病毒在HEK-293细胞中的增殖情况。
图5：用48孔板进行药物筛选，采集添加药物和病毒后3d，4d，5d的培养基上清50µL，再次感染HEK-293细胞（5×104）的增殖情况。
A：添加不同剂量的Brincidofovir，取病毒感染后3d的培养基上清再次感染HEK-293细胞2d，上清中腺病毒的增殖情况。
B：添加不同剂量的Brincidofovir，取病毒感染后4d的培养基上清再次感染HEK-293细胞2d，上清中腺病毒的增殖情况。
C：添加不同剂量的Brincidofovir，取病毒感染后5d的培养基上清再次感染HEK-293细胞2d，上清中腺病毒的增殖情况。
D：添加不同剂量的Cidofovir，取病毒感染后3d的培养基上清再次感染HEK-293细胞2d，上清中腺病毒的增殖情况。
E：添加不同剂量的Cidofovir，取病毒感染后4d的培养基上清再次感染HEK-293细胞2d，上清中腺病毒的增殖情况。
F：添加不同剂量的Cidofovir，取病毒感染后5d的培养基上清再次感染HEK-293细胞2d，上清中腺病毒的增殖情况。
图6：用48孔板进行药物筛选时，添加不同剂量的药物和病毒后4d和培养基上清中病毒再次感染HEK-293细胞的荧光图。
A: 添加不同剂量的药物和病毒后4d的荧光图；
B: 第4d的培养基上清（50µL）中病毒再次感染HEK-293细胞的荧光图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。现结合实施例和附图，对本发明做进一步描述。
下例实施例所用如无特殊说明所用方法均为常规方法。
实施例1 一种测定药物抑制人腺病毒增殖的高通量筛选方法的建立
1. 整合GFP的人腺病毒的制备
利用pAdTrack-CMV（https://www.addgene.org/16405/）和pAdEasy-1（https://www.addgene.org/16400/）质粒构建质粒pAd-YFP(SEQ ID NO.1)，将质粒pAd-YFP转染到293FT细胞获得整合GFP的人腺病毒，具体方法参考https://media.addgene.org/data/49/60/162ad396-af64-11e0-90fe-003048dd6500.pdf。简单而言，所述方法为：
1）利用PmeI限制性内切酶将质粒pAdTrack-CMV线性化。
2）将线性化的pAdTrack-CMV和腺病毒骨架载体pAdEasy-1质粒共同电转到大肠杆菌BJ5183细胞中。用卡那霉素进行单克隆筛选，将获得的质粒进行酶切鉴定，将鉴定正确的质粒转化到DH10B感受态中，挑取单克隆，进行抽提，获得质粒pAd-YFP。
3）将质粒pAd-YFP用限制性内切酶PacI进行线性化，并用Lipofactamine 转染到293FT细胞中，将获得的病毒反复感染细胞，获得较高浓度的腺病毒，用于后续试验研究。
4）感染细胞后，在荧光显微镜下，细胞显示为绿色，这些确定腺病毒为重组腺病毒。
2. 腺病毒滴度检测
1) 用胰蛋白酶消化对数生长期的HEK-293细胞，细胞计数后接种于96孔板，细胞密度为1×104细胞/孔。用含有10%FBS的DMEM培养。
2）24 h 后， 每孔加入将原病毒用含2%FBS的DMEM培养基10倍连续稀释后，每孔加入100µL，每个浓度6个重复。原病毒稀释梯度为10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6，10-7，10-8，10-9，10-10。加病毒后2d，在荧光显微镜下记录含有绿色荧光细胞的孔数，计算病毒的TCID50。统计结果见表1， 经计算病毒的TCID50为10 7.3 TCID50/mL。
表1 腺病毒病毒滴度检测的结果统计
3. 抗病毒药物Brincidofovir (B)和Cidofovir（C）对HEK-293的毒性试验
1）用胰蛋白酶消化对数生长期的HEK-293细胞，细胞计数后接种于96孔板，细胞密度为1×104细胞/孔。用含有10%FBS的DMEM培养。
2）24 h 后，加入Brincidofovir的药物浓度分别为10 nM， 50 nM，100 nM，250nM， 500 nM，750 nM，1000 nM，1500 nM，2000 nM。 加入Cidofovir的药物浓度分别为 10 µM， 25 µM， 50 µM，75 µM， 100 µM， 150 µM， 200 µM。每个浓度3个重复孔，同时设只加培养基不加细胞的调零孔3个，和试验组相同细胞数目，相同培养基但不加药物组的对照组3个孔。
3） 48 h时按照MTT试剂盒说明书每孔添加10 µL的MTT溶液，37℃孵育4 h后，添加100 µL Formazan溶解液，孵育4 h 后，在570 nm下测定吸光度，统计添加药物对HEK-293细胞是否具有毒性。,
4）MTT试验结果见图1，由以上结果可知，Brincidofovir在浓度10 nM - 2000 nM的范围内对HEK-293细胞没有毒性。Cidofovir在10 µM - 200 µM范围内对HEK-293细胞没有毒性。
4. 药物抑制腺病毒增殖的高通量筛选方法的建立
1）不同加药时间点的确定。
第1 d，用胰蛋白酶消化对数生长期的HEK-293细胞，细胞计数后接种于24孔板，细胞密度为5×104细胞/孔。用含有10%FBS的DMEM培养。
第2 d，按照不同时间点添加抗病毒药物Brincidofovir 1000 nM。添加时间点为加病毒前8 h，6 h，4 h，2 h， 0 h，加病毒后2 h，4 h，6 h。病毒添加量为MOI=0.1。设置不加病毒不加药物组（NC），加病毒不加药物组（PC），试验组：加病毒，加Brincidofovir 1000nM，不同时间点加药组。
第6 d，即加病毒后第4d，每孔吸取上清100 µL至已经铺好HEK-293细胞的24孔板里（5×104细胞/孔 ，第5 d 天铺板）。将第一次铺板的细胞进行流式分析，结果见图2A，抑制率见图2B。
加病毒上清后的细胞，培养48 h后进行流式检测。结果见图2C，抑制率结果见图2D。
该试验结果表明：不同时间点加药对腺病毒感染细胞和病毒增殖影响不大，但是，加药后，培养基上清中的病毒含量变化明显，再次感染HEK-293细胞时，病毒含量明显减少。
2）阳性对照药物添加浓度的初步确定。
第1 d，用胰蛋白酶消化对数生长期的HEK-293细胞，细胞计数后接种于24孔板，细胞密度为5×104细胞/孔。用含有10%FBS的DMEM培养。
第2 d，设置不加病毒不加药物组（NC），加病毒不加药物组（PC），试验组：加病毒，加不同浓度的药物组；Brincidofovir 的药物浓度设置为5000 nM；1000 nM；500 nM；100nM；Cidofovir 的药物浓度设置为200 µM；100 µM；50 µM；25 µM。按照试验设计添加药物和病毒，添加腺病毒的MOI=0.1。
第6 d, 即加病毒后第4d，每孔吸取上清100 µL至已经铺好HEK-293细胞的24孔板里（5×104细胞/孔 ，第5 d 天铺板）。将第一次铺板的细胞进行流式分析，结果见图3A，3D。
加病毒上清后的细胞，培养48 h后进行流式检测。结果见图3B，3E；抑制率结果见图3C，3F。
该试验结果表明： 添加不同剂量的药物，在病毒第一次感染HEK-293细胞后，流式细胞术，不能明显的区分不同剂量的药物对病毒的抑制作用。在添加药物和病毒4d后，培养基上清再次感染HEK-293细胞能明显区分出不同剂量的抗病毒药物对腺病毒是否具有抑制作用。此外，该试验明确确定了Brincidofovir作为阳性对照药物使用剂量小于等于500nM， Cidofovir作为阳性对照药物的使用剂量小于等于50 µM。
3）添加药物和病毒后，采集病毒上清的时间点和24孔板铺板的细胞密度的确定。
第1 d，用胰蛋白酶消化对数生长期的HEK-293细胞，细胞计数后接种于24孔板，细胞密度为5×104细胞/孔。用含有10%FBS的DMEM培养。
第2 d，设置不加病毒不加药物组（NC），加病毒不加药物组（PC），试验组：加病毒，加不同浓度的药物组；Brincidofovir 的药物浓度设置为500 nM；100 nM；50 nM；10 nM，Cidofovir 的药物浓度设置为100 µM；50 µM；25 µM；10 µM。按照试验设计添加药物和病毒，添加药物2h后加病毒，添加腺病毒的MOI=0.1。
第4 d，即加病毒后第2 d，每孔吸取上清100 µL至提前1天铺好HEK-293细胞的24孔板里。铺板时细胞密度分5×104细胞/孔和1×105细胞/孔两种。
第6 d，即加病毒后第4d，每孔吸取上清100 µL至提前1天铺好HEK-293细胞的24孔板里。铺板时细胞密度分5×104细胞/孔和1×105细胞/孔两种。
加病毒上清后的细胞培养48 h后进行流式检测。结果见图4。
该试验结果表明：加腺病毒后第4 d取病毒上清和第二次铺板细胞密度为1×105细胞/孔能较好的展示不同浓度药物对腺病毒的抑制作用。
4）用48孔板进行药物抑制腺病毒增殖的高通量筛选。
第1 d，用胰蛋白酶消化对数生长期的HEK-293细胞，细胞计数后接种于48孔板，细胞密度为2.5×104细胞/孔。用含有10%FBS的DMEM培养。
第2 d，设置不加病毒不加药物组（NC），加病毒不加药物组（PC），试验组：加病毒，加不同浓度的药物组；Brincidofovir 的药物浓度设置为500 nM；250 nM；100nM；50 nM；25nM；10 nM；5 nM，Cidofovir 的药物浓度设置为200µM；100 µM；50 µM；25 µM；10 µM。按照试验设计添加药物和病毒，添加药物2 h后加病毒，添加腺病毒的MOI=0.1。
第5 d，即加病毒后第3 d，每孔吸取上清100 µL至提前1天铺好HEK-293细胞的48孔板里。铺板时细胞密度分5×104细胞/孔。
第6 d，即加病毒后第4d，每孔吸取上清100 µL至提前1天铺好HEK-293细胞的48孔板里。铺板时细胞密度分5×104细胞/孔。
第7 d， 即加病毒后第5 d，每孔吸取上清100 µL至提前1天铺好HEK-293细胞的48孔板里。铺板时细胞密度分5×104细胞/孔。
加病毒上清后的细胞培养48 h后进行流式检测。结果见图5，HEK-293细胞感染腺病毒的荧光图见图6。
该试验结果表明：加腺病毒后第4 d和第5d取病毒上清进行第二次病毒扩增，能较好的展示不同浓度药物对腺病毒的抑制作用。根据耗时短的原则，选取采取第4 d 的病毒上清。
5）药物抑制腺病毒增殖的高通量筛选流式细胞术方法的具体步骤：
① 24孔板筛选方法
第 1 d，24孔板，每孔铺HEK-293细胞5×104（即用1mL培养基中含有5×104 cells/mL，吸取1mL到24孔板中）。
第2 d，铺板后24 h，加药。试验应有（1）空白对照组（不加药，不加病毒组），（2）阳性病毒对照组（只加病毒，不加药组），（3）阳性药物组（加病毒，加阳性药物，西多福韦Cidofovir (50 µM)和Brincidofovir (250 nM)），（4）试验组（加病毒，加需要筛选的药物）。
加药后2 h， 加病毒，每孔加2 µL腺病毒（MOI=0.1）。空白对照组不加病毒。
第5d，加病毒后，第3 d， 铺细胞：24孔板，每孔1×105 的 HEK-293细胞（即用1mL培养基中含有1×105 cells/mL，吸取1mL到24孔板中）。和第一次铺的细胞孔数一致。
第6 d，取第一次铺板每孔的病毒上清100 µL，到第二次铺板的细胞中，顺序和第一次一致。
第8 d，即加病毒后第2 d，对第2次铺的细胞板，弃上清，100 µL胰酶消化，加200 µL培养基进行中和，反复吹打后，吸入流式管中进行流式分析，并记录每个样品的检测结果。
将待测药物的流式结果和阳性药物组（西多福韦Cidofovir (50 µM)和Brincidofovir (250 nM)）进行比较，分析待测药物是否具有抑制腺病毒的作用。
②48孔板筛选方法
第 1 d，48孔板，每孔铺HEK-293细胞2.5×104（即用1mL培养基中含有5×104 cells/mL，吸取500 µL到48孔板中）。
第2 d，铺板后24 h，加药。试验应有（1）空白对照组（不加药，不加病毒组），（2）阳性病毒对照组（只加病毒，不加药组），（3）阳性药物组（加病毒，加阳性药物，西多福韦Cidofovir (50 µM)和Brincidofovir (250 nM)），（4）试验组（加病毒，加需要筛选的药物）。
加药后2 h， 加病毒，每孔加2 µL腺病毒（MOI=0.1）。空白对照组不加病毒。
第5d，加病毒后，第3 d， 铺细胞：48孔板，每孔5×104 的 HEK-293细胞（即用1mL培养基中含有1×105 cells/mL，吸取500 µL到48孔板中）。和第一次铺的细胞孔数一致。
第6 d , 取第一次铺板每孔的病毒上清50 µL，到第二次铺板的细胞中，顺序和第一次一致。
第8 d，即加病毒后第2d，对第2次铺的细胞板，弃上清，100 µL胰酶消化，加200 µL培养基进行中和，反复吹打后，吸入流式管中进行流式分析，并记录每个样品的检测结果。
将待测药物的流式结果和阳性药物组（西多福韦Cidofovir (50 µM)和Brincidofovir (250 nM)）进行比较，分析待测药物是否具有抑制腺病毒的作用。
利用该方法，我们对天然化合物库中的39个药物的检测结果见表2。
表2：对天然化合物库中的39个药物进行检测的流式结果
样品名称
GFP %
样品名称
GFP %
样品名称
GFP %
NC 1
0.0
6
27.9
23
17.6
NC 2
0.0
7
57.2
24
50.4
NC 3
0.0
8
44.6
25
61.1
PC 1
50.3
9
50.3
26
39.0
PC 2
56.2
10
17.6
27
30.6
PC 3
65.2
11
12.4
28
38.5
Brincidofovir (250 nM)
3.5
12
62.7
29
15.7
Brincidofovir (250 nM)
4.3
13
36.2
30
40.4
Brincidofovir (250 nM)
3.3
14
35.7
31
62.9
Cidofovir (50 µM)
1.0
15
48.5
32
54.2
Cidofovir (50 µM)
1.1
16
33.2
33
60.4
Cidofovir (50 µM)
1.3
17
41.8
34
59.3
1
45.1
18
36.8
35
2.1
2
30.9
19
39.1
36
40.7
3
19.3
20
1.2
37
42.6
4
7.0
21
13.9
38
4.9
5
20.2
22
14.2
39
1.9
GFP %：表示腺病毒感染HEK-293细胞的百分率。
从以上结果，相对于抗腺病毒阳性药物Cidofovir (50 µM)和Brincidofovir(250 nM)抑制腺病毒的效果，20、35、38、39号药物的GFP表达量低于或接近阳性对照药物，可能抑制腺病毒的增殖，后续需要对筛选的药物进行复筛和观察药物对细胞增殖的毒性，如果药物有明显的毒性抑制细胞增殖，可考虑降低药物浓度后能否继续检测。该方法可以高通量的初步筛选出对腺病毒增殖有明显的抑制作用的药物。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的一种抑制人腺病毒增殖药物的高通量筛选方法及其应用，但本发明并不局限于上述实施例，即不意味着本发明必须依赖上述实施例才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
序列表
<110>中国农业科学院上海兽医研究所（中国动物卫生与流行病学中心上海分中心）
〈120〉一种抑制人腺病毒增殖药物的高通量筛选方法及其应用
〈130〉
〈160〉1
〈170〉PatentInversion3.3
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 37387
<212> pAd-YFP
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
tcgtcactggtcccgccaccaaacgtttcggcgagaagcaggccattatcgccggcatggcggccgacgcgctgggctacgtcttgctggcgttcgcgacgcgaggctggatggccttccccattatgattcttctcgcttccggcggcatcgggatgcccgcgttgcaggccatgctgtccaggcaggtagatgacgaccatcagggacagcttcaaggatcgctcgcggctcttaccagcctaacttcgatcattggaccgctgatcgtcacggcgatttatgccgcctcggcgagcacatggaacgggttggcatggattgtaggcgccgccctataccttgtctgcctccccgcgttgcgtcgcggtgcatggagccgggccacctcgacctgaatggaagccggcggcacctcgctaacggattcaccactccaagaattggagccaatcaattcttgcggagaactgtgaatgcgcaaaccaacccttggcagaacatatccatcgcgtccgccatctccagcagccgcacgcggcgcatctcgggcagcgttgggtcctggccacgggtgcgcatgatcgtgctcctgtcgttgaggacccggctaggctggcggggttgccttactggttagcagaatgaatcaccgatacgcgagcgaacgtgaagcgactgctgctgcaaaacgtctgcgacctgagcaacaacatgaatggtcttcggtttccgtgtttcgtaaagtctggaaacgcggaagtcagcgccctgcaccattatgttccggatctgcatcgcaggatgctgctggctaccctgtggaacacctacatctgtattaacgaagcgctggcattgaccctgagtgatttttctctggtcccgccgcatccataccgccagttgtttaccctcacaacgttccagtaaccgggcatgttcatcatcagtaacccgtatcgtgagcatcctctctcgtttcatcggtatcattacccccatgaacagaaatcccccttacacggaggcatcagtgaccaaacaggaaaaaaccgcccttaacatggcccgctttatcagaagccagacattaacgcttctggagaaactcaacgagctggacgcggatgaacaggcagacatctgtgaatcgcttcacgaccacgctgatgagctttaccgcagctgcctcgcgcgtttcggtgatgacggtgaaaacctctgacacatgcagctcccggagacggtcacagcttgtctgtaagcggatgccgggagcagacaagcccgtcagggcgcgtcagcgggtgttggcgggtgtcggggcgcagccatgacccagtcacgtagcgatagcggagtgtatactggcttaactatgcggcatcagagcagattgtactgagagtgcaccatatgcggtgtgaaataccgcacagatgcgtaaggagaaaataccgcatcaggcgctcttccgcttcctcgctcactgactcgctgcgctcggtcgttcggctgcggcgagcggtatcagctcactcaaaggcggtaatacggttatccacagaatcaggggataacgcaggaaagaacatgtgagcaaaaggccagcaaaaggccaggaaccgtaaaaaggccgcgttgctggcgtttttccataggctccgcccccctgacgagcatcacaaaaatcgacgctcaagtcagaggtggcgaaacccgacaggactataaagataccaggcgtttccccctggaagctccctcgtgcgctctcctgttccgaccctgccgcttaccggatacctgtccgcctttctcccttcgggaagcgtggcgctttctcatagctcacgctgtaggtatctcagttcggtgtaggtcgttcgctccaagctgggctgtgtgcacgaaccccccgttcagcccgaccgctgcgccttatccggtaactatcgtcttgagtccaacccggtaagacacgacttatcgccactggcagcagccactggtaacaggattagcagagcgaggtatgtaggcggtgctacagagttcttgaagtggtggcctaactacggctacactagaaggacagtatttggtatctgcgctctgctgaagccagttaccttcggaaaaagagttggtagctcttgatccggcaaacaaaccaccgctggtagcggtggtttttttgtttgcaagcagcagattacgcgcagaaaaaaaggatctcaagaagatcctttgatcttttctacggggtctgacgctcagtggaacgaaaactcacgttaagggattttggtcatgagattatcaaaaaggatcttcacctagatccttttaaattaaaaatgaagttttaaatcaatctaaagtatatatgagtaaacttggtctgacagttaccaatgcttaatcagtgaggcacctatctcagcgatctgtctatttcgttcatccatagttgcctgactccccgtcgtgtagataactacgatacgggagggcttaccatctggccccagtgctgcaatgataccgcgagacccacgctcaccggctccagatttatcagcaataaaccagccagccggaagggccgagcgcagaagtggtcctgcaactttatccgcctccatccagtctattaattgttgccgggaagctagagtaagtagttcgccagttaatagtttgcgcaacgttgttgccattgctgcagccatgagattatcaaaaaggatcttcacctagatccttttcacgtagaaagccagtccgcagaaacggtgctgaccccggatgaatgtcagctactgggctatctggacaagggaaaacgcaagcgcaaagagaaagcaggtagcttgcagtgggcttacatggcgatagctagactgggcggttttatggacagcaagcgaaccggaattgccagctggggcgccctctggtaaggttgggaagccctgcaaagtaaactggatggctttcttgccgccaaggatctgatggcgcaggggatcaagctctgatcaagagacaggatgaggatcgtttcgcatgattgaacaagatggattgcacgcaggttctccggccgcttgggtggagaggctattcggctatgactgggcacaacagacaatcggctgctctgatgccgccgtgttccggctgtcagcgcaggggcgcccggttctttttgtcaagaccgacctgtccggtgccctgaatgaactgcaagacgaggcagcgcggctatcgtggctggccacgacgggcgttccttgcgcagctgtgctcgacgttgtcactgaagcgggaagggactggctgctattgggcgaagtgccggggcaggatctcctgtcatctcaccttgctcctgccgagaaagtatccatcatggctgatgcaatgcggcggctgcatacgcttgatccggctacctgcccattcgaccaccaagcgaaacatcgcatcgagcgagcacgtactcggatggaagccggtcttgtcgatcaggatgatctggacgaagagcatcaggggctcgcgccagccgaactgttcgccaggctcaaggcgagcatgcccgacggcgaggatctcgtcgtgacccatggcgatgcctgcttgccgaatatcatggtggaaaatggccgcttttctggattcatcgactgtggccggctgggtgtggcggaccgctatcaggacatagcgttggctacccgtgatattgctgaagagcttggcggcgaatgggctgaccgcttcctcgtgctttacggtatcgccgctcccgattcgcagcgcatcgccttctatcgccttcttgacgagttcttctgaattttgttaaaatttttgttaaatcagctcattttttaaccaataggccgaaatcggcaaaatcccttataaatcaaaagaatagaccgagatagggttgagtgttgttccagtttggaacaagagtccactattaaagaacgtggactccaacgtcaaagggcgaaaaaccgtctatcagggcgatggcccactacgtgaaccatcaccctaatcaagttttttggggtcgaggtgccgtaaagcactaaatcggaaccctaaagggagcccccgatttagagcttgacggggaaagccggcgaacgtggcgagaaaggaagggaagaaagcgaaaggagcgggcgctagggcgctggcaagtgtagcggtcacgctgcgcgtaaccaccacacccgccgcgcttaatgcgccgctacagggcgcgtccattcgccattcaggatcgaattaattcttaattaacatcatcaataatataccttattttggattgaagccaatatgataatgagggggtggagtttgtgacgtggcgcggggcgtgggaacggggcgggtgacgtagtagtgtggcggaagtgtgatgttgcaagtgtggcggaacacatgtaagcgacggatgtggcaaaagtgacgtttttggtgtgcgccggtgtacacaggaagtgacaattttcgcgcggttttaggcggatgttgtagtaaatttgggcgtaaccgagtaagatttggccattttcgcgggaaaactgaataagaggaagtgaaatctgaataattttgtgttactcatagcgcgtaatatttgtctagggccgcggggactttgaccgtttacgtggagactcgcccaggtgtttttctcaggtgttttccgcgttccgggtcaaagttggcgttttattattatagtcagtcgagtctagcaagctagcttgatcgcgttaagatacattgatgagtttggacaaaccacaactagaatgcagtgaaaaaaatgctttatttgtgaaatttgtgatgctattgctttatttgtaaccattataagctgcaataaacaagttaacaacaacaattgcattcattttatgtttcaggttcagggggaggtgtgggaggttttt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