Rna文库的制备方法、测序方法和试剂盒
阅读说明：本技术 Rna文库的制备方法、测序方法和试剂盒 (Preparation method, sequencing method and kit of RNA library ) 是由 甘广丽 张萌 李改玲 李妍 张娟 曾立董 沈丽婉 骆明杰 于 2019-09-16 设计创作，主要内容包括：本发明涉及生物技术领域,具体涉及一种RNA文库的制备方法、测序方法和试剂盒。本发明公开了一种制备RNA文库的方法,该方法包括以RNA为模板反转录生成第一链cDNA,获得RNA/cDNA杂合体；在RNA/cDNA杂合体的至少一个末端添加第一预设序列形成RNA/DNA杂合体,所述RNA/DNA杂合体为RNA文库,所述第一预设序列位于cDNA链的至少一个末端。利用此方法制备RNA文库操作简单快捷,构建的RNA文库可以直接用于测序,因该方法无二链cDNA合成过程,即无cDNA扩增富集过程,可以避免因PCR扩增富集产生的bias及错误。同时本发明公开了一种RNA测序方法用于直接测定cDNA序列信息获得RNA序列信息。本发明还公开了一种用于RAN测试试剂盒,利用此试剂盒,可构建RNA文库和RNA文库的测序。(The invention relates to the technical field of biology, in particular to a preparation method, a sequencing method and a kit of an RNA library. The invention discloses a method for preparing an RNA library, which comprises the steps of carrying out reverse transcription by taking RNA as a template to generate first-strand cDNA, and obtaining an RNA/cDNA hybrid; adding a first preset sequence to at least one end of an RNA/cDNA hybrid to form the RNA/DNA hybrid, wherein the RNA/DNA hybrid is an RNA library, and the first preset sequence is positioned at least one end of a cDNA chain. The method for preparing the RNA library is simple and quick to operate, the constructed RNA library can be directly used for sequencing, and the method has no two-chain cDNA synthesis process, namely no cDNA amplification and enrichment process, so that bias and errors generated by PCR amplification and enrichment can be avoided. Meanwhile, the invention discloses an RNA sequencing method for directly determining cDNA sequence information to obtain RNA sequence information. The invention also discloses a RAN test kit, and RNA libraries and sequencing of the RNA libraries can be constructed by using the kit.)
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种RNA文库的制备方法、测序方法和试剂盒。
背景技术
RNA测序研究是基因功能及结构研究的基础，能够从整体水平研究基因功能及其结构，对着测序技术的发展，能够通过RNA测序对转录组进行更深度更完整的研究。
为了实现对RNA测序，通常需要将RNA转化为cDNA，然后再进行测序，即先构建cDNA文库，然后再进行测序。RNA测序前的文库构建不仅直接影响RNA检测时间，而且影响测序结果。目前，对RNA建库一般分为总RNA建库，mRNA建库，small RNA建库等。目前常用的RNA建库流程主要步骤有：将RNA高温打断，将打断后的RNA反转成cDNA，合成双链DNA，磁珠纯化双链DNA，末端修复，加A碱基，加接头，纯化，PCR(可选)，文库质控。建库流程一般需要一天时间，耗时长，建库步骤多，试剂成本高。同时基于常规建库操作构建的RNA测序文库在进行测序时，测序结果中含有两条cDNA的数据，且因建库过程中引入了PCR合成双链DNA的过程，导致数据重复率高、扩增bias及错误。
为了提高数据利用率及对基因的覆盖度，降低数据分析负担，对RNA建库、RNA测序方法的优化势在必行。
发明内容
本发明提供了一种新的RNA文库的制备方法，通过定量添加接头构建RNA/DNA杂合体文库，操作简单快捷，构建的文库可以直接用于测序、因该方法无二链cDNA合成过程，即无cDNA扩增富集过程，可以避免因PCR扩增富集产生的bias及错误。同时，本发明提供的RNA测序方法可以实对第一链cDNA的测序，提高测序数据的基因组覆盖度，同时因测序数据中无第二链cDNA的测序数据的干扰，提高测序数据的有效使用率(重复率低)，减轻数据分析负担。
本发明一方面提供了一种制备RNA文库的方法，该方法包括如下步骤：
以RNA为模板，反转录生成第一链cDNA，获得RNA/cDNA杂合体；
在RNA/cDNA杂合体的至少一个末端添加第一预设序列形成RNA/DNA杂合体，所述RNA/DNA杂合体为RNA文库，并且所述第一预设序列位于cDNA链的至少一个末端。其中预设序列为序列已知的序列。
在本发明的一个示例中，在上述方法中反转录在第一反应体系中进行，第一反应体系包含反转录酶和引物，且反转录酶不具有RNA降解功能。保证反转录酶具有转录活性而不具有RNA降解活性，目的是保证在反转录后形成RNA/cDNA杂合体用于后续反应。
在本发明的一个示例中，在上述方法中第一反应体系中反转录酶选自M-MμLV酶和其工程酶中的至少一种，其中M-MμLV酶为M-MμLV野生型的酶；M-MμLV工程酶为M-MμLV突变酶，但仍具有M-MμLV反转录活性的酶，在反转录产物cDNA的末端添加C碱基。M-MμLV酶以RNA为模板进行反转录时，cDNA3’端会多出3个C碱基。进行反转录时，所用的酶不局限于M-MμLV酶及其工程酶，当所用转录酶可以实现cDNA 3’端加尾功能即可，这样可以保证RNA/cDNA实现单端加接头的目的。所谓加尾指的是扩增链的3’无配对模板，为单链。
在本发明的一个示例中，在上述方法中反转录使用的引物可以为随机引物，利用随机引物进行反转录，对模板RNA无选择性，可尽可能保证所有模板RNA被反转录。可以理解，基于实验目的不同，可以采用不用的引物进行反转录，如mRNA，可以采用polyT引物和随机引物。不论是polyT引物还是随机引物，引物的5’端可选择性地添加第二预设序列，第二预设序列可用于文库双向测序，也可用于与序列互补添加接头。
在本发明的一个示例中，引物的5’端的核苷酸为封闭核苷酸，封闭核苷酸不能通过连接反应在引物的5’添加核苷酸序列，封闭的核苷酸的种类有核苷酸的磷酸基团被封闭、或核苷酸末端有生物素(biotin)、spacer C18(18个)、spacer C9、spacer C3或NH2 C12等修饰增加空间位阻阻止核苷酸之间的连接的反应，引物的5’端的核苷酸为封闭核苷酸可以阻止引物的5’端通过连接反应添加第一预设序列，从而保证第一预设序列添加的方向性，即第一预设序列添加在cDNA的3’端。
在本发明的一个示例中，上述方法中添加第一预设序列反应与反转录反应在第一反应体系中同步进行，即RNA反转录和添加第一预设序列反应与在一个反应体系中同步进行，省去了RNA反转录后纯化步骤。
需要说明的是，RNA反转录和添加第一预设序列反应之间可选择性加入纯化步骤，是否加入纯化步骤不影响接头添加效果。在一个示例中，RNA反转录和添加第一预设序列反应，将将两步反应所需的试剂(如接头连接反应所需的试剂连接酶、反转录反应所需的试剂反转录酶等)混在一起形成一个反应体系进行反应。本领域的技术人员可以理解不同的酶所需的最适缓冲液可能不同，两种酶混合在一起是否能正常发挥作用是不确定的，因为两种酶可能互相影响。将RNA反转录和添加第一预设序列反应同步进行操作是在经过多次尝试之后得到的简化操作步骤。利用此RNA文库制备方法构建的RNA文库成功加上接头，如图3Th-2检测结果所示。RNA反转录和添加第一预设序列反应同步进行，可减少实验过程的操作步骤，简化实验操作，同时不影响实验结果。
上述方法中第一预设序列位于cDNA链的至少一个末端有三种情况，分别为：第一种情况为第一预设序列位于所述cDNA链的3’端，构建的RNA文库中只有cDNA链的3’端含有第一预设序列；第二种情况为，第一预设序列位于所述cDNA链的5’端，构建的RNA文库中只有cDNA链的5’端含有第一预设序列；第三种情况为，第一预设序列位于所述cDNA链的5’端和3’端，构建的RNA文库中只有cDNA链的3’端含有第一预设序列。
在本发明的一个示例中，可采用两种方法在cDNA链的至少一个末端添第一预设序列，第一种方法为：通过连接反应或聚合反应在cDNA链的至少一个末端添第一预设序列。当通过连接反应在cDNA链的至少一个末端添加第一预设序列时，第一反应体系中包含连接酶。进一步，第一反应体系还包括接头，接头为包含第一链和第二链的双链DNA，接头与RNA/cDNA杂合体连接以获得cDNA链的至少一个末端具有第一预设序列的RNA-DNA杂合体。当第二链的5’与cDNA的3’连接，优选第二链的长度的大于第一链，在利用探针捕获cDNA链时，选择合适的探针捕获温度，如高于接头退火的温度，可降低第一链对探针捕获第二链的影响，如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示序列。另一优选方案为，第二链的5’与cDNA的3’连接，第一链和第二链的3’端无羟基修饰或3’端的羟基作封闭处理，第一链不能通过连接反应添加至cDNA的5’端或第二链反向添加至cDNA的5’端，此方案可以保证只有cDNA3’端添加第一预设序列。
第二种方法为：通过聚合反应在cDNA链的至少一个末端添加第一预设序列。当通过聚合反应添加第一预设序列时，聚合反应所使用的酶与反转录反应使用的酶相同。利用相同的酶进行扩增，在反转录生成第一链cDNA后不需要进行纯化，加入单链接头即可进行扩增反应，这样可减少酶的使用量和纯化试剂，从而简化操作步骤、降低成本。进一步，当RNA/cDNA杂合体中cDNA链的3’为单链末端时，第一反应体系包括单链DNA接头，接头和所述cDNA链的3’为单链末端互补，且接头比该互补单链末端长。进一步，接头比所述cDNA链的3'末端的单链末端长10bp～60bp，优选的，长20bp～50bp，如SEQ ID NO:3所示接头。单链DNA接头的3’末端与第一链cDNA 3’末端互补配对，第一链cDNA延伸扩增，扩增产物中第一链cDNA的3’端添加已知序列。
上述多种RNA建库方法，因反转录反应和加接头反应同步进行，操作简单快捷；反转录反应和扩增反应所使用的酶相同，可减少酶的使用量，节省成本；构建的文库为RNA/DNA杂合体，可以直接用于测序、因该方法无二链cDNA合成过程，即无cDNA扩增富集过程，可以避免因PCR扩增富集产生的bias及错误；可以实现有方向性的添加接头，如仅在第一链cDNA的3’添加已知序列，这样的文库用于测序时，测序数据具有方向性，便于分析测序数据。
本发明第二方面提供了一种RNA文库，所述RNA文库通过权利要求上述任一所述方法制备获得。该RNA文库直接用于测序。
本发明第三发明提供了一种RNA测序方法，包括如下步骤：
探针捕获上面所述的RNA文库中的DNA，形成探针/DNA杂合体；
对探针/DNA杂合体进行测序，获得所述DNA序列信息；
根据DNA序列信息以确定至少一部分所述RNA序列信息；
所述探针与第一预设序列互补配对。
可以理解，已知序列与探针互补配对的目的是为了探针捕获，所以已知序列与探针互补配对并不要求已知序列中所有序列都与探针互补配对，在示例中也可看出，已知序列的3’端有两个碱基不与探针互补配对，同时探针中也存在多个碱基在已知序列中无配对碱基。当已知序列的3’端的碱基不与探针互补配对时，在进行扩增测序时捕获的第一链cDNA不会以探针为模板进行扩增，从而减少测序信号的干扰。
在一个示例中，上述测序方法中，在固相基质上进行所述测序，固相基质上带有探针。探针捕获DNA后直接进行测序，探针作为测序引物，此时的第一预设序列位于cDNA的3’端，与探针互补配对。
在一个示例中，上述步骤包含对所述RNA文库进行变性处理的步骤，RNA文库进行变性处理后获得单链DNA后，探针捕获DNA。RNA文库含有RNA和cDNA且是双链，进行探针捕获时，双链变成单链更有利于探针与第一链cDNA的3’端的已知序列杂交互补，形成杂交复合体。
在一个示例中，捕获的DNA序列进行双向测序，通过加入测序引物进行测序，测序引物的序列与第二预设序列一致。
利用上述多种RNA测序方法可以实现对第一链cDNA的直接测序，测序数据具有方向性，从示例中的测序结果可看出，利用上述测序方法可提高测序数据的基因组覆盖度，同时因测序数据中无第二链cDNA的测序数据的干扰，提高测序数据的有效使用率(重复率低)，减轻数据分析负担。
本发明第四方面提供了一种RNA测序试剂盒，试剂盒用于实施上述RNA文库的制备方法或用于实施上述RNA测序方法，试剂盒包含所述探针、反转录酶、接头；其中接头为单链DNA或双链DNA，探针与第一预设序列互补配对。
进一步，上述试剂盒还包含连接酶，连接酶用于双链DNA与RNA/DNA杂合双链的连接。
在一个示例中，试剂盒中的反转录酶为M-MμLV酶及其工程酶，用于反转录，生成RNA的第一链cDNA。
在一个示例中，上述接头为双链DNA，如Seq ID NO.1和Seq ID NO.2所示序列。
在一个示例中，上述接头为单链DNA；如Seq ID NO.3所示序列。
在一个示例中，上述探针为Seq ID NO.4所示序列。
利用上述RNA测序试剂盒可用于构建上述RNA文库及用于上述的RNA文库测序。
附图说明
图1示意本发明实施例1中文库labchip法检测结果；
图2示意本发明实施例2中文库labchip法检测结果；
图3示意本发明实施例3中文库labchip法检测结果；
图4示意本发明实施例4中文库labchip法检测结果；
图5示意本发明实施例5中文库labchip法检测结果。
术语解释：
本文中所称的“核酸”、“核酸分子”和“核酸片段”，包括DNA、RNA、RNA-DNA和/或者cDNA，双链或者单链，是由核苷酸和/或核苷酸类似物(衍生物)组成的序列。
本文中所称的“双链核酸”包括DNA、RNA、RNA-DNA和/或者cDNA形成的还有两条链的核酸。
本文中所称的“接头”，“第一预设序列”，“第二预设序列”指的是序列已知的核酸片段。
本文中所称“RNA文库”为以RNA模板反转录生成含有RNA的文库。
具体实施方式
除非特殊说明，本发明所用术语具有本发明所属领域中的一般含义。
下面参考具体实施例和附图，对本发明进行说明，需要说明的是，这些实施例仅仅是说明性的，而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件的，均按照常规实验条件，或按照制造厂商说明书建议的条件。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例中RNA均来自同一批DH5a空载菌株(生工货号：B528411-0001)。利用天根DP430细菌总RNA试剂盒的试剂及操作方法提取DH5a菌株总RNA。
实施例中使用的双链接头、单链接头和探针的具体序列如下：
D9TS-ad接头由两条单链核酸(第一链和第二链)形成的双链核酸：
第一链:5’-AGATGTGTATAAGAGACAGTGGG-3’(Seq ID NO.1)
第二链:5’-ACTGTCTCTTATACACATCTGAGTGGAACTGGATGGTCGCAGGTATCAAGGATT-3’(Seq ID NO.2)
D9-TSO接头：单链核酸
5’-GGTCCTTGATACCTGCGACCATCCAGTTCCACTCAGATGTGTATAAGAGACAGTGGG-3’(SeqID NO.3)
探针：
5’-TTTTTTTTTTTCCTTGATACCTGCGACCATCCAGTTCCACTCAGATGTGTATAAGAGACAG-3’(Seq ID NO.4)
实施例1
1.RNA高温打断
将100ng的RNA打断到100-300bp RNA片段，打断步骤如下：
1)将5xFS buffer(Thermo Fisher货号：18064014)解冻后颠倒混匀，按照表1配制反应体系：
表1
对照A
实验B
RNA(50ng/μL)
2μL
2μL
5xFS buffer
4μL
4μL
ddH<sub>2</sub>O
2μL
2μL
Total
8μL
8μL
2)在PCR仪中进行高温打断反应：lid(PCR热盖)105℃，94℃ 7min,立即置于冰上冷却；
3)冷却反应结束后立刻进行下一步反转反应。
2.第一链cDNA合成
1)在打断后的反应管中，按照表2配制反应体系：
表2
2)反应条件：25℃10min，42℃15min，反应结束后得到RNA/cDNA杂合片段。
3.加接头
在实验B第一链cDNA合成管中加入2μL D9TS-ad(11uM)接头，22μL Blunt/TALigase Master Mix(货号NEB M0367)，室温放置15min，连接产物即为文库B。
4.纯化
将对照A第一链cDNA合成产物用1.8x Ampure XP beads纯化一次，洗脱得到10μL含RNA/cDNA杂合片段A的上清，用作实验文库B的片段对照；
用0.8x Ampure XP beads纯化实验B加接头后的产物一次，洗脱得到10μL上清1，再将上清用1.2x Ampure XP beads纯化一次，洗脱得到10μL上清2。将上清2通过labchip法检测，检测结果如图1所示，文库B(实验B文库)比杂合片段A(对照A片段)大约70bp，说明文库B成功加上单端接头。
5.杂交捕获
利用公开专利申请CN201510501968.7说明书中公开的方法在芯片上固定探针(SEQ ID NO:4)，制备的文库1和文库2用3*SSC杂交液稀释，然后与芯片上固定的探针进行杂交。然后根据Cy3的信号来判断接头序列与探针杂交的数目。
文库芯片杂交的流程如下：
(1)芯片选择：所用的芯片的基地玻璃为SCHOTT公司的环氧基修饰的玻璃芯片，通过探针上的氨基和芯片表面的环氧基团反应的方法，例如，可参看公开专利申请号CN201811191589.2披露的方法来固定Seq ID NO.4所示的探针，在110×110μM区域内固定的探针密度约为18000Dot/FOV即在110×110μM视野内有18000个亮点。
(2)杂交液配置：杂交液配置体系如表3所示，所用缓冲液为20×SSC缓冲液(西格玛，#S6639-1L)，终浓度为成3×SSC，文库的终浓度为1nM，总体积为40μL。将配置好的杂交液95℃变性2min，迅速至冰上冷却。
表3
20×SSC缓冲液
6μL
文库1或文库2
终浓度为1nM
去核酸水
补足至40μL
(3)将上述变性后的杂交液迅速加载至芯片上，再将芯片放置55℃30min，使文库与芯片表面的探针进行杂交。
(4)依次用3×SSC、1×SSC、0.1×SSC冲洗芯片。
利用GenoCare第三代测序平台对杂交捕获的文库进行测序，测序结果见表15。
实施例2
1.RNA高温打断
将100ng的RNA打断到100-300bp片段,打断步骤如下：
1)将试剂解冻后颠倒混匀，按照表4配制反应体系：
表4
T1(对照)
T2(实验)
RNA(50ng/μL)
2μL
2μL
Frag/1st strand buffer(天根NG308)
5μL
5μL
ddH<sub>2</sub>O
3μL
3μL
Total
10μL
10μL
2)在PCR仪中进行高温打断反应：天根：94℃ 10min,lid 105℃，立即置于冰上冷却；
3)冷却反应结束后立刻进行下一步反转反应。
2.第一链cDNA合成
1)在打断后的反应管中，按照表5配制反应体系：
表5
2)反应条件：25℃10min，42℃15min，反应结束后得到RNA/cDNA杂合片段。
3.加接头
在T2的反转产物中加入2μL D9TS-ad(11uM)接头，22μL Blunt/TA Ligase MasterMix(货号NEB M0367)，室温放置15min，连接产物即为文库T2。
4.纯化
对照T1第一链cDNA合成产物用1.8x(36μL)Ampure XP beads纯化一次，洗脱得到10μL含RNA/cDNA杂合片段T1上清，用作实验文库T2的片段对照；
用0.8x Ampure XP beads纯化实验T2加接头后的产物一次，洗脱得到10μL上清1，再将上清1用1.2x Ampure XP beads纯化一次，洗脱得到10μL上清2，将上清2l通过labchip法检测，检测结果如图2所示，文库T2(T2实验)比杂合片段T1(T1对照片段)大约70bp，说明文库T2成功加上单端接头。
5.杂交捕获
杂交捕获步骤与实施例1步骤5“杂交捕获”操作步骤相同。
利用GenoCare第三代测序平台对杂交捕获的文库进行测序，测序结果见表15。
实施例3
1.RNA高温打断
将100ng的RNA打断到100-300bp片段，打断步骤如下：
1)将5xFS buffer(Thermo Fisher货号：18064014)解冻后颠倒混匀，按照表6配制反应体系：
表6
2)在PCR仪中进行高温打断反应：94℃ 7min,lid 105℃，立即置于冰上冷却；
3)冷却反应结束后立刻进行下一步反转反应。
2.第一链cDNA合成、加接头反应
1)在打断后的反应管中，按照表7配制反应体系：
表7
2)25℃10min，42℃15min，室温15min，反应结束后得到RNA/cDNA杂合片段加接头产物，分别得到产物杂合片段Th-1、文库Th-2。
3.纯化
对照Th-1用1.8x(36μL)Ampure XP beads纯化一次，洗脱得到10μL含RNA/cDNA杂合片段Th-1的上清，用作实验Th-2文库的片段对照；
实验Th-2用0.8x Ampure XP beads纯化一次，洗脱得到10μL上清1，再将上清1用1.2x Ampure XP beads纯化一次，洗脱得到10μL上清2。将上清2通过labchip法检测，检测结果如图3所示，文库Th-2(实验Th-2文库)比杂合片段Th-1(对照Th-1片段)大约70bp，说明文库Th-2成功加上单端接头。
4.杂交捕获
杂交捕获步骤与实施例1步骤5“杂交捕获”操作步骤相同。
利用GenoCare第三代测序平台对杂交捕获的文库进行测序，测序结果见表15。
实施例4
1.RNA高温打断
将100ng的RNA打断到100-300bp RNA片段，打断步骤如下：
1)将5xFS buffer(Thermo Fisher货号：18064014)解冻后颠倒混匀，按照表1配制反应体系：
表8
2)在PCR仪中进行高温打断反应：lid(PCR热盖)105℃，94℃ 7min,立即置于冰上冷却；
3)冷却反应结束后立刻进行下一步反转反应。
2.第一链cDNA合成
1)在打断后的反应管中，按照表2配制反应体系：
表9
2)反应条件：25℃10min，42℃15min，反应结束后得到RNA/cDNA杂合片段。
3.加接头
在实验Y2第一链cDNA合成管中加入2μL D9-TSO(10uM)接头，42℃5min，连接产物即为文库Y2。
4.纯化
将对照Y1第一链cDNA合成产物用1.8x Ampure XP beads纯化一次，洗脱得到10μL含RNA/cDNA杂合片段A的上清，用作实验文库Y2的片段对照；
用0.8x Ampure XP beads纯化实验B加接头后的产物一次，洗脱得到10μL上清1，再将上清用1.2x Ampure XP beads纯化一次，洗脱得到10μL上清2。将上清2通过labchip法检测，检测结果如图4所示，文库Y2(实验Y2文库)比杂合片段Y1(对照Y1片段)大约70bp，说明文库Y2成功加上单端接头。
5.杂交捕获
杂交捕获步骤与实施例1步骤5“杂交捕获”操作步骤相同。
利用GenoCare第三代测序平台对杂交捕获的文库进行测序，测序结果见表15。
实施例5
该实施例为现有技术所用的RNA建库测序流程。共平行做3个实验，样品名称分别为C1、C2和C3，每个样品取100ng的RNA用于后续实验。建库过程中使用天根RNA快速文库构建试剂盒(货号为NR102)。
1.RNA高温打断
将100ng的RNA打断到100-300bp片段，打断步骤如下：
1)将试剂盒中的Frag/1st strand buffer解冻后颠倒混匀，按照表10配制反应体系：
表10
2)在PCR仪中进行高温打断反应：94℃ 7min,lid 105℃，立即置于冰上冷却；
3)冷却反应结束后立刻进行下一步反转反应。
2.第一链cDNA合成
1)在打断后的反应管中，按照表11配制反应体系：
表11
2)反应条件：25℃10min，42℃15min，反应结束后得到RNA/cDNA杂合片段，立即进行第二链cDNA的合成。
3.第二链cDNA合成
在打断管中按照表12配置第二链cDNA合成反应体系：
表12
组分名称
体积μL
RNA片段
20
2st Strand Buffer
8.5
2st Strand Enzyme Mix
3.5
Nuclease-Free ddH2O
48
Total
80
反应条件：16℃60min，4℃hold，反应结束后即开始纯化操作。
4.纯化
用1.8x Ampure XP beads纯化一次二链合成后的产物，洗脱得到35μL上清，即得双链cDNA样本。
5.末端修复/dA添加
按照表13所示体系配置端修复/dA添加反应体系：
表13
组分名称
体积(μl)
cDNA样本
35
10×ERA buffer
5
5×ERA Enzyme Mix
10
Total
50
反应条件：在4℃预冷的PCR仪中进行如下反应，PCR热盖温度设置为70℃，设定反应流程20℃30min，65℃30min，4℃hold。反应程序结束后，得到末端修复/dA添加产物，将反应产物置于冰上，立即进入接头连接步骤。
6.接头连接
按照表14所示体系配置接头连接反应体系：
表14
组分名称
体积(μl)
末端修复/dA添加产物
50
D9TS-ad(11uM)接头
5
5×Ligase Buffer
20
TIANSeq DNA Ligase
10
Nuclease-Free ddH2O
15
Total
100
反应条件：在PCR仪中进行如下反应，PCR热盖温度设置为≤40℃，设定反应流程20℃15min，4℃hold。反应程序结束后，得到接头连接产物。
7.纯化步骤
用0.8x Ampure XP beads纯化接头连接产物，洗脱得到35μL上清1，再将上清1用1.2x Ampure XP beads纯化一次，洗脱得到35μL上清2，即得文库C1、C2、C3。将上清2通过labchip法检测，检测结果如图5所示，文库C1、C2、C3的大小与图1-4中加上接头的文库的主带峰值一致，说明文库C1、C2、C3成功加上接头。
8.杂交捕获
杂交捕获步骤与实施例1步骤5“杂交捕获”操作步骤相同。
利用GenoCare第三代测序平台对杂交捕获的文库进行测序，测序结果见表15。
表15
备注：Count_all：测序数据经过质控过滤后得到的所有reads数；Count_map：质控后的数据，能够比对上基因组的reads数；Count_unmap：质控后的数据，未能比对上基因组的reads数；Count_unique：比对上基因组的reads中，能够比对到基因组上唯一位置的reads数；Meanlen下各个参数：表示各个参数下的平均reads长度；Coverage：指uniquereads进行拼接，去除重复，能覆盖到基因组上的总长度碱基数；Base：指unique reads中能比对到基因组上的总碱基数；Cover_depth:指有覆盖reads区域中的覆盖深度；Depth：用base数除以基因组总长的base数，得到平均测序深度；Coverag％：用coverage的长度碱基数除以基因组总长的碱基数，得到测序覆盖度。
取相同量的实施例1-5构建的RNA文库进行上机测序，具体测序结果如表15显示，从表15可看出：
1.RNA文库(B、T2、Th-2、Y2)测序数据(count_all)比对比文库(C1、C2、C3)的测序数据量(count_all)少约一半。因RNA文库(B、T2、Th-2、Y2)为单端添加了已知序列，进行序列捕获时只能捕获文库中的第一链cDNA进行测序，而比对比文库(C1、C2、C3)为双端加接头进行测序，捕获的核酸链为互补的两条链，所以，以相同的文库量上机测序，测序数据量会有倍数差异。反过来亦成立，当两种文库获得相同的数据量时，RNA文库(B、T2、Th-2、Y2)上机文库的量约为比对比文库(C1、C2、C3)量的一半；
2.RNA文库(B、T2、Th-2、Y2)测序数据coverage％远高于对比文库(C1、C2、C3)测序数据coverage％，即测序数据基因组覆盖度差异很大，用本发明RNA文库构建、测序方法获得得测序数据基因组的覆盖度远高于对比文库。因在Count_unique中，duplication(重复率)率约为40％，而对比文库(C1、C2、C3)约为90％(数据未显示)，同时因对比文库构建过程中经过二链cDNA扩增富集，导致bias的存在即有些片段在扩增过程中所占的比列越来越少，以至于在测序数据进行初步过滤时作为无效数据被过滤掉或者根本未被有效测序，从而导致对比文库测序数据基因组覆盖率明显低于利用本发明方法构建的RNA文库(B、T2、Th-2、Y2)测序数据基因组覆盖率。
同时可得出结论，当获得相同的测序量(count_all)时，RNA文库(B、T2、Th-2、Y2)测序数据coverage％远高于对比文库(C1、C2、C3)测序数据coverage％。
以上内容是结合具体的实施方式对本申请所作的进一步详细说明，不能认定本申请的具体实施只局限于这些说明。对于本申请所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本申请的保护范围。
序列表
<110> 深圳市真迈生物科技有限公司
<120> RNA文库的制备方法、 测序方法和试剂盒
<130> PI2019004
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(23)
<223> 接头序列
<400> 1
agatgtgtat aagagacagt ggg 23
<210> 2
<211> 54
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(54)
<223> 接头序列
<400> 2
actgtctctt atacacatct gagtggaact ggatggtcgc aggtatcaag gatt 54
<210> 3
<211> 57
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(57)
<223> 接头序列
<400> 3
ggtccttgat acctgcgacc atccagttcc actcagatgt gtataagaga cagtggg 57
<210> 4
<211> 61
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(61)
<223> 探针序列
<400> 4
tttttttttt tccttgatac ctgcgaccat ccagttccac tcagatgtgt ataagagaca 60
g 61
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