具体实施方式

在下面的详细描述中，参考构成所述详细描述的一部分的附图。在详细描述、附图和权利要求书中描述的说明性实施例并不意味着是限制性的。在不背离本文呈现的主题的精神或范围的情况下，可以利用其它实施例，并且可以做出其它改变。容易理解的是，如本文一般描述的，本公开的各方面可以以各种不同的配置进行布置、替换、组合和设计，所有这些均被明确地构想并且构成本公开的一部分。

功能化涂料组合物

在一些实施例中，提供了涂料组合物和用于使用酶作为涂料组合物组分的方法。更具体地说，提供了组合物和用于将酶掺入涂料组合物中的方法，其方式是在漆膜内保留由这种酶赋予的一种或多种酶活性。在一些实施例中，包埋的酶在与涂料组合物直接混合后保持活性。进一步地，在一些实施例中，在将涂料组合物施用于表面之后，包埋的酶保持活性。在一些此类实施例中，一种或多种酶在成膜发生之后保留活性(例如，保留膜内酶促活性)。在一些实施例中，包埋的酶的膜内活性使表面具有生物活性。在一些实施例中，本文提供了在成膜发生之后检测和测量本文公开的涂料组合物内的酶活性的方法。

在一些实施例中，涂料组合物包括建筑涂料(例如，木材涂料、砖石涂料、艺术家涂料)、工业涂料(例如，汽车涂料、罐头涂料、密封剂涂料、船舶涂料)、规格涂料(迷彩涂料、管道涂料、交通标志涂料、飞机涂料、核电站涂料)或其任何组合。在一些实施例中，涂料组合物包括油漆。在其它实施例中，涂料组合物包括透明涂料。在一些实施例中，透明涂料包括亮漆、清漆、虫胶、污渍、防水涂料或其任何组合。在一些实施例中，提供了分析本文公开的任何类型的涂料组合物内的酶活性的方法。

在一些实施例中，本文的组合物和方法可以产生具有生物活性的涂料组合物。在一些实施例中，本文提供了涂料组合物，其中通过将酶直接掺入涂料组合物中，向表面和/或涂料组合物赋予酶的活性。在一些此类实施例中，在施用于表面并随后形成膜之后，酶维持性质、改变性质和/或向表面和/或涂料组合物赋予性质。在一些实施例中，酶保留至少约2％(例如，2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、75％、100％及其之间的范围)的膜内活性。在一些实施例中，提供了酶作为涂料组合物的组分，其向与酶有关的涂料组合物赋予活性或其它优点。在一些实施例中，约0.001wt％到约70wt％(例如0.001％、0.005％、0.01％、0.03％、0.05％、0.07％，0.09％、0.1％、0.11％、0.13％、0.15％、0.17％、0.19％、0.2％、0.5％、0.7％、1％、2％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％及其之间的范围)的涂料组合物包括一种或多种酶。在一些实施例中，涂料组合物进一步包括酶的底物和/或辅因子。在一些实施例中，一种或多种酶包括氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂解酶、异构酶、连接酶或其任何组合。在一些实施例中，一种或多种酶包括甘露聚糖酶、纤维素酶、淀粉酶、脂肪酶、蛋白酶、漆酶、脲酶或其任何组合。在一些实施例中，本文提供的涂料组合物在表面上的施加赋予表面和/或涂料组合物以下性质中的一种或多种：自清洁、耐污性、防污性、防单宁性、木材粘附力、油漆加工助剂、甲醛消除、气味消除、耐腐蚀、抗微生物、抗生物膜脱脂、除冰、去污、可剥离涂料、更快固化和/或更低的VOC含量。在一些实施例中，一种或多种酶包括纤维素酶，并且纤维素酶活性赋予涂料组合物改善的木材粘附力。在一些实施例中，涂料组合物包括氧化酶，并且氧化酶活性赋予涂料组合物防单宁性、耐污性或防污性。在一些实施例中，涂料组合物包括漆酶，并且漆酶活性赋予涂料组合物防单宁性。在一些实施例中，涂料组合物包括赋予表面自脱脂性质的脂解酶。在一些实施例中，提供了在成膜发生之后分析本文公开的任何功能化涂料组合物内的酶活性的方法。

在一些实施例中，涂料组合物包括粘合剂、颜料、液体组分和一种或多种酶。在一些实施例中，涂料组合物进一步包括一种或多种添加剂。在一些实施例中，涂料组合物包括各种组合组和单独成分的组合。在一些实施例中，调配物包括以下成分的组中的几种或全部成分、基本上由所述成分组成或由所述成分组成：(1)聚合物(粘合剂)；(2)液体组分；(3)颜料；(4)酶；(5)分散剂；(6)聚结溶剂；(7)增塑剂；(8)消泡剂；(9)中和剂；(10)流变改性剂；(11)润湿剂；(12)染料；以及(13)杀菌剂。在一些实施例中，以上组(1)-(3)中的任何一个以约0.000001％到约40.0％的范围提供(例如，0.000001％、0.00001％、0.0001％、0.001％、0.001％、0.001％、0.005％、0.01％、0.03％、0.05％、0.07％、0.09％、0.1％、0.11％、0.13％、0.15％、0.17％、0.19％、0.2％、0.5％、1％、3％、4％、5％、10％、15％、20％、30％、40％及其之间的范围)。在一些实施例中，以上组(4)-(14)中的任何一个以约0.000001％到约20.0％的范围提供(例如，0.000001％、0.00001％、0.0001％、0.001％、0.001％、0.001％、0.005％、0.01％、0.03％、0.05％、0.07％、0.09％、0.1％、0.11％、0.13％、0.15％、0.17％、0.19％、0.2％、0.5％、1％、3％、4％、5％、10％、15％、20％及其之间的范围)。在一些实施例中，仅提供了以上组(1)-(4)。在一些实施例中，提供了以上组(1)-(4)，并且涂料组合物进一步包括选择组(5)-(13)中的择1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个或9个。在一些实施例中，仅提供了以上组(1)、(2)和(4)。在一些实施例中，提供了以上组(1)、(2)和(4)，并且涂料组合物进一步包括选择组(5)-(13)中的择1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个或9个。在一些实施例中，以上针对组(1)-(13)提供的百分比被提供为％m/m。在其它实施例中，以％w/w、％m/v、％v/v、％m/w或％w/v提供这些成分。在一些实施例中，提供了分析本文公开的任何涂料组合物调配物内的酶活性的方法，所述调配物包含成分组(1)-(13)的所有浓度和组合。

如本文所公开的，配制具有特定比率和/或数量的成分组(1)-(13)的涂料组合物可以导致增加膜内酶活性的累加效果和/或协同效果。在一些实施例中，并且如实例中所示，成分组(1)-(13)的存在/不存在、成分组(1)-(13)所采用的一种或多种成分的类型、成分组(1)-(13)的浓度和比率和/或成分组(1)-(13)之间的物理和/或功能相互作用可以显著影响膜内酶活性。考虑到当配制包括成分组(1)-(13)中的一种或多种成分的功能化涂料组合物时可能的数字排列，非常需要廉价、快速且准确的方法来分析涂料组合物内的酶活性。特别有利的是，此类方法可修改为自动化，以便能够筛选大量的油漆调配物，从而优化酶的相容性。进一步地，宝贵的是，此类测定方法与广泛的酶种类和涂料组合物类型相容。

本发明的若干实施例涉及测定功能化涂料组合物内的酶活性的独特方法。本文所述的测定方法特别有利于用于分析包埋在本文所公开的油漆调配物(包含建筑涂料和工业涂料)中的酶。在若干实施例中，本文所述的测定方法提供以下优点中的一个或多个：(i)定性、半定量和/或定量的读出；(iii)跨广泛种类的酶(例如，脲酶、甘露聚糖酶、纤维素酶、淀粉酶、脂肪酶、蛋白酶和/或漆酶)具有相容性；(iv)跨广泛范围的涂料组合物调配物(例如，不同的PVC水平、不同类型和浓度的填料、粘合剂和中和剂)具有相容性；(v)较少步骤；(vi)成本低；(vii)孵育期短；(viii)起始材料和试剂的量少，从而可以同时分析多个样品；(ix)简单机械步骤可修改为自动化；(x)跨广泛范围的酶浓度具有准确性；以及(xi)模拟半干燥状态下的油漆施加条件(而不是将膜完全浸入溶液中)。此外，有利地，在若干实施例中，这些方法采用先前未处理的干膜和半干膜，从而无需先对膜进行修饰或进行提取程序。在一些实施例中，这些方法能够筛选涂料组合物调配物的大库，以选择最佳候选物用于进一步开发。在一些实施例中，这些测定法可用作质量控制方法。

基于培养基的测定法

在一些实施例中，本文公开了涂料组合物内的酶活性的基于培养基的测定法。在一些实施例中，本文公开的方法提供了对涂料组合物中酶活性的定量或半定量确定。在一些实施例中，本发明的方法提供了对酶活性的定性确定。在一些实施例中，提供了检测涂料组合物中的酶活性的方法，所述包括以下步骤：(a)使所述涂料组合物与培养基的表面接触，其中所述涂料组合物包括酶，并且所述培养基包括所述酶的底物；(b)在允许所述酶与所述底物反应的条件下孵育与(a)的涂料组合物接触的所述培养基；以及(c)监测与所述涂料组合物接触的所述培养基的一种或多种物理性质。在一些实施例中，所述培养基的所述一种或多种物理性质中的至少一种物理性质的变化指示所述酶的活性。在一些实施例中，物理性质包括颜色性质和/或光学性质(例如，培养基的不透明度和/或透明度)。在一些实施例中，涂料组合物是膜。在一些实施例中，膜是干燥的。在一些实施例中，膜处于半干燥状态。在一些实施例中，在步骤(a)之前，所述膜不与液体接触。在一些实施例中，一种或多种物理性质的变化发生在膜下方的培养基中。在一些实施例中，一种或多种物理性质的变化发生在膜周围的培养基中。在一些实施例中，涂料组合物(例如，膜)周围的澄清区域(不透明度降低和/或透明度增加)指示酶的活性。在一些实施例中，培养基可以含有使所述培养基显得“浑浊”的底物，并且所述底物针对所述底物上的酶促活性产生澄清区域。在一些实施例中，通过将底物包含在琼脂板中并刻划水解透明区来测定涂料组合物内水解酶(例如，蛋白酶、淀粉酶)的酶促活性。在一些此类实施例中，指示剂染料用于检测酶作用的影响(例如，使用刚果红来检测纤维素和半纤维素的降解程度)。在一些实施例中，培养基中颜色的出现指示酶的活性。在一些实施例中，将底物翻转成产物可以产生或除去生色化合物、荧光化合物、发光化合物或其它可检测的化合物。在一些实施例中，培养基包括亮绿和/或若丹明红与橄榄油(脂肪酶的底物)和刚果红和羧甲基纤维素(CMC)(纤维素酶的底物)的组合。在一些实施例中，酶促活性与培养基的一种或多种物理性质的变化相关。

在一些实施例中，允许酶与底物反应的条件包括足以使酶与底物反应的时间段、适合酶活性的pH、合适的温度、适合酶活性的水分水平或其任何组合。在一些实施例中，培养基是基本上平坦的。在一些实施例中，培养基包括或衍生自琼脂、明胶、聚乙烯醇、聚醚二醇、聚乙二醇单硬脂酸酯、二甘醇二硬脂酸酯、酯蜡、聚酯蜡、硝化纤维素、石蜡及其衍生物和组合。在一些实施例中，培养基被容纳在容器中。在一些实施例中，容器是透明的。在一些实施例中，容器是琼脂培养基板、生物测定托盘或omni-tray。在一些实施例中，容器的尺寸被配置成允许同时监测多种涂料组合物。

如本文所使用的，术语“底物”或“酶底物”应被赋予其通常的含义，并且还应指酶在其上产生反应产物的材料的底物。在一些实施例中，所述底物是生色底物、荧光底物和/或发光底物。如本文所使用的，术语“生色底物”应被赋予其通常的含义，并且还应指能够被包括生色团或与生色团偶联的酶裂解或修饰的分子。如本文所使用的，术语“生色团”应被赋予其通常的含义，并且还应指分子内的一组原子，其负责该分子在紫外线、可见光或红外光领域的吸收性质和/或光发射。在一些实施例中，这些性质是由于在其余波长被传输或传播时吸收可见光谱范围内的光子能量的能力而产生的。在一些实施例中，生色底物是有色的。在一些实施例中，生色底物是无色的。在一些实施例中，生色底物在特定酶的作用下释放其生色团。在一些实施例中，生色底物在水解时不需要在培养基中存在额外的化学物质以产生颜色。如本文所使用的，术语“荧光底物”应被赋予其通常的含义，并且还应指能够被包括荧光团或与荧光团偶联的酶切割或修饰的分子。在一些实施例中，荧光底物在修饰后将产生荧光产物。在一些实施例中，荧光底物在特定酶的作用下释放其荧光团。如本文所使用的，术语“荧光团”应被赋予其通常的含义，并且还应指分子内的一组原子，其负责该分子在激发后发射荧光的能力。如本文所使用的，术语“发光底物”应被赋予其通常的含义，并且还应指在酶修饰后将产生发光的底物。如本文所使用的，术语“发光”应被赋予其通常的含义，并且还应指其中从材料以与吸收能量不同的波长发射能量的任何过程。在一些实施例中，可以通过强度和/或通过寿命衰减来测量发光。在一些实施例中，发光包含但不限于荧光、磷光、生物发光、化学发光、电化学发光、结晶发光、电致发光，、阴极发光、力致发光、摩擦发光、破裂力致发光、压致发光、光致发光、放射发光、声致发光和/或热致发光。在一些实施例中，酶促反应的产物是生色产物、荧光产物和/或发光产物。在一些实施例中，酶通过直接修饰底物的化学结构而使底物变成生色、荧光和/或发光的。

在一些实施例中，步骤(b)进行约20分钟到约7天的时间段(例如，20分钟、30分钟、40分钟、50分钟、1小时、2小时、4小时、8小时、10小时、12小时、14小时、16小时、18小时、20小时、22小时、24小时、2天、3天、4天、5天、6天、7天及其之间的范围)。在一些实施例中，步骤(b)在约4℃到约60℃的温度下进行(例如，4℃、7℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃及其之间的范围)。在一些实施例中，步骤(b)进一步包括在孵育完成之后从培养基中除去涂料组合物。在一些实施例中，通过目视检查来执行步骤(c)。在一些实施例中，步骤(c)包括用彩色、灰度、荧光和/或发光成像装置捕获所述容器的图像。在一些实施例中，以一个或多个间隔执行步骤(c)。在一些实施例中，通过自动化来辅助步骤(a)、(b)或(c)中的一个或多个步骤。在一些实施例中，在环境光下执行对培养基的监测。如本文所使用的，术语“在环境光下”应被赋予其通常的含义，并且还应指可见光谱，即，可以用肉眼看到和区分的颜色。然而，应当理解，如果需要的话，术语“在环境光下”包含使用放大装置。在一些实施例中，在UV辐射下进行培养基的监测。在一些实施例中，在任何辐射波长下执行监测。

在一些实施例中，底物是天然底物。在一些实施例中，底物是合成底物。在一些实施例中，底物包括牛奶、酪蛋白、偶氮-大麦葡聚糖、偶氮-角豆半乳甘露聚糖、对硝基苯基-B-D-吡喃乳糖苷、红色淀粉、丁香醛连氮、植物油、偶氮-木聚糖、偶氮-阿拉伯木聚糖或其任何组合。在一些实施例中，在涂料组合物内测定的一种或多种酶包含但不限于淀粉酶(例如，α淀粉酶、β淀粉酶)、脂肪酶、蛋白酶、漆酶、脲酶、甘露聚糖酶、纤维素酶、木聚糖酶、甲醛歧化酶、植酸酶、氨基肽酶、糖化酶、羧肽酶、过氧化氢酶、几丁质酶、角质酶、环糊精葡糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡萄糖苷酶、β-葡萄糖苷酶、卤代过氧化物酶、转化酶、异构酶、甘露糖苷酶、氧化酶、果胶酶、肽谷氨酰胺酶、过氧化物酶、多酚氧化酶、核酸酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶、木聚糖酶、支链淀粉酶、异淀粉酶、卡拉胶酶或其任何组合。在一些实施例中，在涂料组合物内测定的酶选自包括以下各项的组：甘露聚糖酶、淀粉酶、脂肪酶、蛋白酶、漆酶、木聚糖酶及其任何组合。在一些实施例中，酶是淀粉酶，并且底物是红色淀粉。在一些实施例中，酶是蛋白酶，并且底物是牛奶、酪蛋白或血红蛋白中的一种或多种。在一些实施例中，酶是甘露聚糖酶或纤维素酶，并且底物是偶氮-大麦葡聚糖、偶氮-角豆半乳甘露聚糖和/或对硝基苯基-B-D-吡喃乳糖苷。在一些实施例中，酶是脂肪酶，底物是植物油，并且指示剂染料是尼罗红。在一些实施例中，酶是漆酶，并且底物是丁香醛连氮。在一些实施例中，酶是木聚糖酶，并且底物是偶氮-木聚糖或偶氮-阿拉伯木聚糖

在一些实施例中，间接地检测酶促反应。例如，在一些实施例中，培养基可以包括pH指示剂，其对由底物的消耗诱导的pH变化敏感，并揭示靶微生物的代谢，所述指示剂包含但不限于生色团(例如，溴甲酚紫、溴百里酚蓝、中性红、苯胺蓝、溴甲酚蓝)或荧光团(例如，4-甲基伞形酮、羟基香豆素衍生物、荧光素衍生物或试卤灵衍生物)。在使用非生色底物的一些实施例中，将一种或多种指示剂染料添加至培养基中以检测酶活性。在一些实施例中，间接地检测酶活性。在一些实施例中，所述培养基进一步包括指示剂染料。在一些此类实施例中，指示剂染料结合底物。在一些实施例中，指示剂染料结合酶促反应的产物。在一些实施例中，指示剂染料对由酶的活性引起的培养基的pH变化作出响应。在一些实施例中，指示剂染料增强对比度以促进监测培养基的不透明度。在一些实施例中，指示剂染料选自包括以下各项的组：硫黄素、阿斯拉宗橙、阿斯拉宗蓝、甲苯胺蓝、亚甲基蓝、吖啶橙、派洛宁-G、原黄酮、天青A、荧光桃红B、甲酚紫、番红O、中性红、硫黄素T、耐晒红AL、亚甲基绿、若丹明B、若丹明6G、天蓝色B、吲哚蓝、亮甲酚蓝、4',6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐水合物、吖啶黄、吖啶黄素、派洛宁-Y、派洛宁-B、麦尔多拉蓝、尼罗蓝、尼罗红、新亚甲基蓝、甲基紫、三苯甲烷染料、甲基绿、结晶紫、维多利亚蓝、亮绿、碱性品红、新品红、乙基紫、孔雀绿草酸盐、喹哪啶红、频哪隐醇黄、频哪隐醇溴化物、频哪隐醇氯化物、2-[4-(二甲基氨基)苯乙烯基]-1-甲基喹啉鎓碘化物、2-[4-(二甲基氨基)苯乙烯基]-1-甲基吡啶鎓碘化物、全染料(stains-all)、苯并嘌呤、甲基绿、氯酚红、溴甲酚绿、溴甲酚紫、溴百里酚蓝、苯酚红、百里香酚蓝、甲酚红、茜素、媒染剂橙、甲基橙、甲基红、莱卡特染料(Reichardt's Dye)、刚果红、曙红蓝、脂肪棕B、橙G、间胺黄、萘酚绿B、亚甲基紫3RAX、苏丹橙G、桑色素、分散橙25、玫瑰酸，脂肪棕RR、氰胺氯化物、3,6-吖啶胺、6'-丁氧基-2,6-二氨基-3,3'-偶氮二吡啶、对品红碱、吖啶橙碱、甲醇碱或其任何组合。在一些实施例中，使用荧光指示剂染料监测pH变化，如例如：对于pH范围6-9，使用荧光素和半萘酚罗丹荧类及其衍生物；以及对于pH范围3-7，使用LysoSensor、俄勒冈绿和Rhodol及其衍生物。在一些实施例中，最大吸收波长随pH的变化而变化的指示剂染料还包含百里香酚蓝(有用的pH范围约为1.2-2.8和8.0-9.6)、甲基橙(pH为3.2-4.4)、溴甲酚绿(pH 3.8-5.4)、甲基红(pH4.2-6.2)、溴百里酚蓝(pH 6.0-7.6)和苯酚红(pH 6.8-8.2)。在一些实施例中，随着pH变得更碱性，酚酞(pH 8.2-10.0)从无色变为粉红色。

基于板的抗微生物/抗生物膜测定法

在一些实施例中，提供了包括一种或多种赋予涂料组合物和/或表面抗微生物和/或抗生物膜性质的酶的涂料组合物。抗微生物和/或抗生物膜性质可以作用于任何所关注的微生物。在一些实施例中，本文提供了用于测定这种功能化涂料组合物的抗微生物和/或抗生物膜性质的基于板的方法。

在一些实施例中，培养基是用所关注的微生物(例如，生长被包埋在涂料组合物内的酶抑制的微生物)的标准悬浮液接种(例如，擦拭)的固体或半固体生长培养基。在一些实施例中，将涂料组合物(例如，膜)放置在经接种的固体或半固体生长培养基上，并孵育合适的时间段，以使涂料组合物之下和/或周围存在/不存在生长可视化。在一些实施例中，在被配置成允许被测定的微生物生长的条件(例如，营养物的存在或不存在、pH、水分含量、氧化还原电位、温度、大气气体组成)下孵育板。在一些实施例中，固体或半固体生长培养基包括常规培养基、选择性培养基、鉴别培养基、选择性鉴别培养基、富集培养基、易感性培养基、厌氧培养基和真菌培养基中的一种或多种。在一些实施例中，常规培养基包括以下中的一种或多种：胰蛋白酶大豆血琼脂、胰蛋白酶大豆琼脂、胰蛋白酶大豆、BHI血琼脂、BHI琼脂、Casman血液、HBT双层培养基和标准方法琼脂。在一些实施例中，选择性培养基包括以下中的一种或多种：哥伦比亚CNA血液、叠氮化物血琼脂、chocolate选择性、布鲁氏菌血液，血液SxT、链球菌选择性I和II、PEA、胆汁七叶苷琼脂、艰难梭菌琼脂、skirrow、CCFA、CLED、洋葱假单胞菌琼脂、SxT血琼脂、TCBS琼脂、CIN、卡他莫拉菌培养基和木炭选择性。在一些实施例中，鉴别培养基包括以下中的一种或多种：亮绿、CYE-军团菌、西曲溴铵、DNA-se、hektoen肠杆菌琼脂、Jordans酒石酸盐、甘露醇盐、LIA、TSI、FLO-假单胞菌F、TECH-假单胞菌P、Sellers、淀粉琼脂、耐热核酸酶、Tinsdale琼脂、McCarthy、LSM、山梨醇-McConkey、MUG-McConkey。在一些实施例中，选择性和鉴别培养基包括以下中的一种或多种：MacConkey、EMB、Baird Parker、具有抗生素的BHI血液、BiGGY-真菌学、CIN、艰难梭菌琼脂、McBride、假单胞菌分离琼脂、S-S琼脂、turgitol 7和XLD琼脂。在一些实施例中，富集培养基包括以下中的一种或多种：chocolate、GC chocolate、BHI chocolate、Borget Gengou、心脏浸液琼脂、McCarthy、Regan-Lowe、Thayer-Martin、转化生长培养基、半胱氨酸亚碲酸盐血液、半胱氨酸碲酸盐心脏、BHT、心脏浸剂、Loefflers和血清亚碲酸盐。在一些实施例中，厌氧培养基包括以下中的一种或多种：哥伦比亚基础、PEA、CAN、LKV、BBE、布鲁氏杆菌、BHI血液基础、KBE、McClung-Toabe、牛胆汁(oxgall)、Schaedlers和Wilkens-Chalgren。在一些实施例中，真菌培养基包括以下中的一种或多种：BHI基础、BiGGY、鸟食、玉米粉、棉籽、DTM、沙氏葡萄糖、富士(Fuji)培养基、抑制霉菌、立脱曼牛胆汁(Littman oxgall)、真菌学、mycophil、Nickersons、SABHI和发癣菌素。

如本文所使用的，术语“微生物”应被赋予其通常的含义，并且还应指能够在培养基中生长和繁殖的任何原核或真核显微生物，包含但不限于一种或多种细菌(例如，运动性或营养性的，革兰氏阳性或革兰氏阴性)、细菌孢子或内生孢子和真菌(例如，酵母、丝状真菌、真菌孢子)。在一些实施例中，所测定的微生物是致病的。如本文所使用的，术语“病原体”应被赋予其通常的含义，并且还应指任何病原微生物，例如肠杆菌科的成员，或微球菌(Micrococcaceae)科的成员，或葡萄球菌(Staphylococcus)属、链球菌(Streptococcusspp)属、假单胞菌(Pseudomonas)属、肠球菌(Enterococcus)属、沙门氏菌(Salmonella)属、军团菌(Legionella)属、志贺氏菌(Shigella)属、耶尔森氏菌(Yersinia)属、肠杆菌(Enterobacter)属、埃希氏菌(Escherichia)属、芽孢杆菌(Bacillusspp)属、李斯特氏菌(Listeria)属、弯曲杆菌(Campylobacter)属、不动杆菌(Acinetobacter)属、弧形菌(Vibrio)属、梭菌(Clostridium)属和棒状杆菌(Corynebacteria)属。在一些实施例中，病原体可以包括但不限于：大肠杆菌(Escherichia coli)，包含肠出血性大肠杆菌(E.coli)，例如血清型O157:H7；铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)；蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)、炭疽杆菌(Bacillus anthracis)、卡他布兰汉氏菌(Branhamellacatarrhalis)、肠炎沙门氏菌(Salmonella enteritidis)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)、单核细胞增生性李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)、肉毒梭菌(Clostridium botulinum)、产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni)、小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersinia enterocolitica)、创伤弧形菌(Vibrio vulnificus)、艰难梭菌(Clostridium difficile)、耐万古霉素的肠杆菌(Enterococcus)、酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、粘质沙雷菌(Serratiamarcescens)和/或阪崎肠杆菌(Enterobacter sakazakii)。

生化测定法

在一些实施例中，提供了通过分光光度法对涂料组合物的生化分析。在一些实施例中，本文公开的方法提供了对涂料组合物中酶活性的定量或半定量确定。在一些实施例中，所述方法提供了酶活性的定性确定。在一些实施例中，用分光光度计进行生化测定法。在一些实施例中，用荧光计进行生化测定法。在一些实施例中，用发光计进行生化测定法。在一些实施例中，提供了测量涂料组合物中的酶活性的方法，所述包括以下步骤：(a)将所述涂料组合物配置成允许分光光度计检测光穿过所述涂料组合物；(b)将所述涂料组合物放置在分光光度计的样品孔中，其中所述涂料组合物包括酶，并且所述样品孔包括反应缓冲液和所述酶的底物；以及(c)在允许所述酶与所述底物反应的条件下，在一定波长下监测吸光度。在本文提供的方法的一些实施例中，步骤(a)被省略。在一些实施例中，在所述波长处所述吸光度的变化指示所述酶的活性。在一些实施例中，允许酶与底物反应的条件包括足以使酶与底物反应的时间段、适合酶活性的pH、适合酶活性的温度或其组合。在一些实施例中，波长介于约400nm和约700nm之间(例如，400nm、420nm、440nm、460nm、480nm、500nm、520nm、540nm、560nm、580nm、600nm、620nm、640nm、660nm、680nm、700nm及其之间的范围)。在一些实施例中，步骤(c)在约4℃到约80℃的温度下进行(例如，4℃、5℃、6℃、7℃、8℃、10℃、12℃、14℃、16℃、18℃、20℃、22℃、24℃、26℃、28℃、30℃、32℃、34℃、36℃、38℃、40℃、42℃、44℃、46℃、48℃、50℃、52℃、54℃、56℃、58℃、60℃、62℃、64℃、66℃、68℃、70℃、72℃、74℃、76℃、78℃、80℃及其之间的范围)。在一些实施例中，步骤(c)以一个或多个间隔进行，持续约2分钟到约48小时的时间段(例如，2分钟、4分钟、8分钟、10分钟、12分钟、14分钟、16分钟、18分钟、20分钟、22分钟、24分钟、26分钟、28分钟、30分钟、32分钟、34分钟、36分钟、38分钟、40分钟、45分钟、50分钟、55分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、8小时、10小时、15小时、20小时、25小时、30小时、35小时、40小时、45小时、48小时及其之间的范围)。在一些实施例中，通过自动化来辅助步骤(a)、(b)或(c)中的一个或多个步骤。

在一些实施例中，涂料组合物包括膜。在一些实施例中，膜重约1mg到约200mg(例如，1mg、2mg、3mg、4mg、5mg、6mg、7mg、8mg、9mg、10mg、12mg、14mg、16mg、18mg、20mg、40mg、60mg、80mg、100mg、120mg、140mg、160mg、180mg、200mg及其之间的范围)。在一些实施例中，基于孔板的形式选择膜的重量。在一些实施例中，基于膜的厚度选择膜的重量。在一些实施例中，所述膜是基本上圆形的。在一些实施例中，基于膜的厚度选择膜的几何形状。在一些实施例中，基于样品孔的形状选择膜的几何形状。在一些实施例中，膜的直径为约0.1cm到约3.0cm(例如，0.1cm、0.2cm、0.3cm、0.4cm、0.5cm、0.6cm、0.7cm、0.8cm、0.9cm、1.0cm、1.2cm、1.4cm、1.6cm、1.8cm、2.0cm、2.2cm、2.4cm、2.6cm、2.8cm、3.0cm及其之间的范围)。

在一些实施例中，在步骤(a)之前，膜是干燥的或处于半干燥状态。在一些实施例中，在步骤(a)之前，所述膜不与液体接触。在一些实施例中，本文提供的方法需要入射光路径穿过样品孔并测量所述光的吸光度。在一些实施例中，由于干漆膜阻挡了光路，因此测量包括未改变的干漆膜的样品孔内的吸光度是不可行的。在一些此类实施例中，光的阻挡会引起问题，所述问题包含但不限于酶活性的读数不正确、需要较长的测定法时间、需要较高的底物水平、需要较高的酶水平和/或特定油漆调配物与测定法不相容。本文提供了该问题的解决方案：将膜配置成允许入射光路径穿过，如例如，通过在将膜放置在样品孔中之前除去膜的内部部分。举例来说，在一些实施例中，使用两种不同尺寸的打孔器将含有酶的干漆膜切成“O形环形状”的片。在一个实施例中，打孔器(例如，直径为0.6cm)将干漆膜切割成圆形片，所述圆形片被配置成适配到96孔板的孔中。在仍另外的实施例中，用较小的打孔器(例如，直径＝0.31cm)在中心处进一步切割干漆膜的所述圆形片。在一些此类实施例中，最终结果是具有0.31cm空心中心(或“O形环形状”)的0.6cm圆盘，该圆盘允许入射光穿过每个孔的中心。在一些此类实施例中，漆膜的这种配置使得能够记录该光的吸光度，同时还允许漆膜的“O形环”部分中的酶与添加到孔中的底物溶液相互作用。重要的是，在一些实施例中，该方法允许检测从漆膜释放到溶液中的酶以及固定在干漆膜中的酶的酶活性。在一些实施例中，步骤(a)包括从膜中除去内部区域。在一些实施例中，内部区域是基本上圆形的。在一些实施例中，基于膜的厚度选择内部区域的几何形状。在一些实施例中，基于样品孔的形状选择内部区域的几何形状。在一些实施例中，内部区域具有允许光通过的任何几何形状。在一些实施例中，内部区域的直径为约0.05cm到约2.5cm(例如，0.05cm、0.075cm、0.1cm、0.2cm、0.3cm、0.4cm、0.5cm、0.6cm、0.7cm、0.8cm、0.9cm、1.0cm、1.2cm、1.4cm、1.6cm、1.8cm、2.0cm、2.2cm、2.4cm、2.5cm及其之间的范围)。在一些实施例中，所述样品孔被包含在包括多个样品孔的多孔板内。在一些实施例中，多孔板包括微板。本文提供的多孔板包含但不限于具有约6到约5,000个孔(优选地，约96到约4,000个孔，最优选地，96倍的孔)的板。在一些实施例中，多孔板选自包括以下各项的组：6孔微板、12孔微板、24孔微板、96孔微板和384孔微板。

在一些实施例中，选择在酶促反应后产生颜色变化的底物。在一些实施例中，所述底物是生色底物、荧光底物和/或发光底物。在一些实施例中，酶促反应的产物是生色产物、荧光产物和/或发光产物。在一些实施例中，酶通过直接修饰底物的化学结构而使底物变成生色、荧光和/或发光的。在一些实施例中，所述底物是天然底物。在一些实施例中，所述底物是合成底物。在一些实施例中，所述底物选自包括以下各项的组：丁香醛连氮、2,2'-联氮-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)、尿素、2-氯-4-硝基苯基-麦芽三糖苷、Ala-Ala-Pro-Phe-对硝基苯基、对硝基苯基-辛酸酯、4-硝基苯基-β-D-纤维二糖苷、甲醛、偶氮-角豆半乳甘露聚糖、对硝基苯基-B-D-吡喃乳糖苷、偶氮-角豆半乳甘露聚糖或对硝基苯基-B-D-吡喃乳糖苷或其任何组合。在一些实施例中，在涂料组合物内测定的一种或多种酶包含但不限于淀粉酶(例如，α淀粉酶、β淀粉酶)、脂肪酶、蛋白酶、漆酶、脲酶、甘露聚糖酶、纤维素酶、木聚糖酶、甲醛歧化酶、植酸酶、氨基肽酶、糖化酶、羧肽酶、过氧化氢酶、几丁质酶、角质酶、环糊精葡糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡萄糖苷酶、β-葡萄糖苷酶、卤代过氧化物酶、转化酶、异构酶、甘露糖苷酶、氧化酶、果胶酶、肽谷氨酰胺酶、过氧化物酶、多酚氧化酶、核酸酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶、木聚糖酶、支链淀粉酶、异淀粉酶、卡拉胶酶或其任何组合。在一些实施例中，在涂料组合物中测定的酶选自包括以下各项的组：甘露聚糖酶、淀粉酶、甲醛歧化酶、脂肪酶、蛋白酶、漆酶、木聚糖酶、脲酶及其任何组合。

在一些实施例中，酶是漆酶，底物是丁香醛连氮，并且波长介于约400nm和约600nm之间(例如，400nm、420nm、440nm、460nm、480nm、500nm、520nm、540nm、560nm、580nm、600nm及其之间的范围)。在一些此类实施例中，反应缓冲液包括约100mM K₂PO₄(pH 6-8)。

在一些实施例中，酶是α淀粉酶，底物是2-氯-4-硝基苯基-麦芽三糖苷，并且波长介于约350nm到约450nm之间(例如，350nm、360nm、380nm、400nm、420nm、440nm、450nm及其之间的范围)。在一些此类实施例中，反应缓冲液包括约1单位的β-葡萄糖苷酶。在一些此类实施例中，反应缓冲液进一步包括约50mM HEPES(pH 6-8)、约50mM磷酸钠(pH 6-8)或约50mMTRIS(pH 6-8)。

在一些实施例中，酶是脲酶，并且底物是尿素。在一些此类实施例中，底物的产物是氨。在一些此类实施例中，添加检测剂(例如，Berthelot试剂(具有苯酚和/或次氯酸盐的碱性溶液))与氨反应并产生蓝色。在一些此类实施例中，波长介于约600nm和约700nm之间(例如，600nm、620nm、640nm、660nm、680nm、700nm及其之间的范围)。在一些此类实施例中，反应缓冲液包括约10mM磷酸钠(pH 7)。

在一些实施例中，酶是蛋白酶，底物是Ala-Ala-Pro-Phe-对硝基苯基，并且波长介于约350nm到约450nm之间(例如，350nm、360nm、380nm、400nm、420nm、440nm、450nm及其之间的范围)。在一些此类实施例中，反应缓冲液包括约50mM HEPES(pH 6-8)、约50mM磷酸钠(pH6-8)或约50mM TRIS(pH 6-8)。

在一些实施例中，酶是脂肪酶，底物是对硝基苯基-辛酸酯，并且波长介于约350nm到约450nm之间(例如，350nm、360nm、380nm、400nm、420nm、440nm、450nm及其之间的范围)。在一些此类实施例中，反应缓冲液包括约50mM HEPES(pH 6-8)、约50mM磷酸钠(pH 6-8)或约50mM TRIS(pH 6-8)。在一些此类实施例中，反应缓冲液进一步包括约0.001％的Triton-X100、约100nM的NaCl和约20mM的CaCl₂。

在一些实施例中，酶是甘露聚糖酶或纤维素酶，底物是4-硝基苯基-β-D-纤维二糖苷，并且波长介于约350nm到约450nm之间(例如，350nm、360nm、380nm、400nm、420nm、440nm、450nm及其之间的范围)。在一些此类实施例中，反应缓冲液包括约50mM HEPES(pH 6-8)、约50mM磷酸钠(pH 6-8)或约50mM TRIS(pH 6-8)。

在一些实施例中，酶是甲醛歧化酶，并且底物是甲醛。在一些此类实施例中，产物改变测定溶液的pH，并且将pH敏感性荧光试剂(例如，荧光素)添加到反应缓冲液中。结果，在一些此类实施例中，荧光素的荧光根据pH的变化而变化，其中发射波长介于约500nm和约600nm之间(例如，500nm、520nm、540nm、560nm、580nm、600nm及其之间的范围)。在一些此类实施例中，反应缓冲液包括约0.35μg/mL的荧光素。在一些此类实施例中，反应缓冲液进一步包括约2mM HEPES(pH 7-8)、约2mM磷酸钠(pH 7-8)或约2mM TRIS(pH 7-8)。

实例

实例1：从液体油漆和干膜中提取酶的优化

在该实例中，开发了酶提取方法和最佳方案，以最大程度地从液体油漆和干膜中回收酶活性。测试了以下提取因素：pH：(7.5、8.5和10.0)；去污剂(Triton X-100)浓度(分别为0％、0.25％、0.5％和1.0％)；盐浓度(0、100、500和mM)；BSA浓度(0、0.1％和1.0％)；温度(RT，40℃、60℃和80℃)；以及孵育时间：(15、30、60和120分钟)。表1列出了提取优化研究中使用的油漆样品(湿漆和干膜)，所述油漆样品随PVC水平和填料化学性质的变化而变化。在油漆样品中加入指定浓度的纤维素酶/甘露聚糖酶Pyrolase

表1：用于提取优化的油漆样品

方法

对于样品提取，称取50mg的湿漆或膜，然后添加到500μL缓冲液中(提取率是10倍)。通过在指定的时间和温度下摇动1小时来搅拌样品。稀释液体对照样品，并以相同方式处理。离心样品，并通过酶活性测定法和蛋白质定量进一步分析上清液。所用的酶底物是试卤灵纤维二糖苷(反应中为0.1mM)。将所有提取的样品用包括50mM MES缓冲液，pH 6和0.5％Triton X-100的稀释缓冲液稀释50倍，以进行分析。在25℃的温度下进行所述测定，并且在550nm的激发波长和590nm的发射波长下检测酶活性。通过SDS-PAGE确定酶数量。通过酶活性:数量的比率计算相对比活性。

酶提取研究的结果和结论

对于从干膜样品中提取酶，发现高pH和高温可以改善提取，并且较高的去污剂(Triton X-100)浓度也可以改善提取。已发现使用NaCl和BSA不会增加从干膜中提取酶。虽然发现较高的温度会更快地从膜中提取酶，但随着时间的流逝，其也会导致活性损失。对于从湿漆样品中提取酶，发现很容易在很短的提取时间内就提取和回收全部酶活性。pH、温度、使用洗涤剂(Triton X100)、NaCl和BSA的影响很小。另外，发现较高的温度和较长的提取时间会导致较低的回收的比活性。这些研究提供了概念证明，即直接包埋在湿漆中的酶保留了其活性，而且在随后从膜中提取后仍保持活性。

基于这些研究，得出了以下优化的提取条件(用于“苛刻”提取)：1)包括50mM CAPS缓冲液，pH 10、0.5％Triton的提取溶液；2)提取率为10倍(将500μl提取液添加到50mg湿漆或干膜中)；3)摇动孵育时间为30分钟；以及4)干膜的孵育温度为60℃，湿漆的孵育温度为室温。将提取混合物以30,000g离心5分钟，然后分析上清液的酶活性和蛋白质数量。

用于从干膜中提取酶(“苛刻提取”)和从提取物中进行酶分析的程序

基于上述研究，开发了以下“苛刻”酶提取方案(具有较高的温度和pH)。在50mMCAPS缓冲液(具有0.5％Triton-X100，pH 10)中于60℃下孵育30分钟后，将酶溶液除去、稀释并进行活性和蛋白质定量测定。使用试卤灵纤维二糖苷作为底物(在具有0.25％Triton-X100，pH 6的50mM MES缓冲液中，于室温下)测定活性，同时通过SDS-PAGE进行蛋白质定量。图1描绘了根据本文公开的若干实施例的用于从干膜中进行“苛刻”酶提取的程序的示意图。实例2：使用具有不同成分矩阵的油漆样品来阐明油漆调配物对酶活性提取的影响

在该实例中，使用了不同的油漆调配物(例如PVC、填料、pH、乳胶化学性质、添加剂化学性质等)来了解酶回收率损失的机理，并确定与湿漆膜和干漆膜中的酶相容或不相容的组分。在油漆样品中加入指定浓度的纤维素酶/甘露聚糖酶Pyrolase

第1组

表2描绘了用于了解油漆成分对酶活性回收的影响的第1组样品。“集合1”和“集合3”样品分别负载了低水平的酶和高水平的酶。表2中列出的酶负载百分比和活性是湿漆样品的目标；由于干燥，预期相应的干膜样品中的这些目标水平将翻倍。

表2：油漆调配物-第1组油漆样品

酶负载量高的湿漆样品(集合3)显示出几乎完全的酶回收。另一方面，酶添加量高的干膜样品的总体回收率低于湿漆；然而，在集合3中，大多数样品的回收率仍超过50％(图2A)。酶添加量低的样品(集合1)中的回收率显示出样品之间的差异更大，而干膜样品中发现回收率较低。(图2B)。PVC水平似乎对酶活性回收没有任何明显的影响。有趣的是，填料化学性质会影响干膜样品的酶提取率，因为CaCO3(Duramite)–样品1和Al2Si2O5(OH)4(ASP172)–样品2展现出最低的回收率。

图2C示出了提取的集合3膜样品的蛋白质数量，并且图2D示出了这些样品的比活性(酶活性/酶定量)。在样品之间观察到的比活性没有明显差异，发现其值非常接近于对照酶样品，这表明从不同膜样品中提取的酶与对照酶一样有活性。样品集合“A”和“B”之间的差异(颜料体积浓度(PVC)分别为40％和20％)可能是由于实验差异所致。

第2组

表3描绘了第二组油漆调配物—第2组。第2组油漆样品包含17个不同的调配物：10个带有酶负载的样品(在湿漆中为0.1％，在干膜中为酶)和7个没有添加酶的对照样品。v1-v3样品类似于工业涂料调配物：它们的PVC水平低，并且含有不同的Joncryl乳胶，所述胶乳是刚性的，并且需要用于成膜的聚结剂(如DPnB和Texanol)。v6–v7样品类似于第1组油漆样品，并且包括CaCO₃(Duramite)填料、不同的VOC水平以及不同的中和剂类型(NaOH与NH₃)和浓度。

表3：油漆调配物–第2组油漆样品

表3(续)：油漆调配物–第2组油漆样品

图3A和3B分别示出了从第2组湿漆样品和干膜样品的“苛刻”提取中回收的酶活性。对于湿漆样品，通过“苛刻提取”可回收约30-45％的酶活性。出乎意料的是，发现聚结剂DPnB和Texanol影响活性提取效率，但在湿漆样品中展现出与干膜样品中相反的趋势。与v1、v2和v3样品相比，v6和v7样品展现出较低的干膜提取活性；并且从包括NH₃的膜样品中发现，其可提取性高于以NaOH作为中和剂的膜样品。“苛刻”提取湿漆样品和干膜样品后的酶定量分别如图4A和4B所示。提取效率范围为60–100％，湿漆显示出更一致的提取(100％提取)。发现随着聚结剂DPnB和Texanol水平的增加，可提取性降低。对于分析的干漆样品，从v6和v7样品中提取了较少量的酶。另外，从包括NH₃的膜样品中观察到，其具有比含NaOH的膜样品更高的可提取性。图5A和5B分别描绘了与从第2组湿漆样品和干膜样品中提取的酶(纤维素酶)的比活性有关的数据。湿漆膜样品的比活性范围为8-18mU/mg。对于干膜样品，观察到相似的比活性值(8-11mU/mg)(除了来自v6和v7样品具有非常高的值，这可能是由于来自图4B所示的酶回收率非常低的样品中蛋白质定量不准确)。测试的纤维素酶的参考比活性为

上面的研究表明多种调配物组分会影响酶的可提取性。与第1组样品相比，在第2组样品中观察到总体上较低的酶提取和稍低的所提取的酶的比活性。发现聚结剂(DPnB和Texanol)会影响提取效率，其中湿漆样品与干膜样品的趋势相反。随着湿漆中聚结剂含量的增加，观察到活性下降，这可能是由于有机溶剂对酶的轻微灭活作用。随着干漆中聚结剂含量的增加，活性的提高可能是由于更好的成膜性(因为干燥后会蒸发出DPnB和Texanol)。测试的v6和v7样品在干膜中的提取活性较低，这证实了第1组发现从含Duramite的膜中提取的酶较低。另外，还发现将中和剂从NH₃切换为NaOH会降低酶回收率。未发现PVC水平对酶提取有任何影响。这些实验还提供了概念证明，即直接包埋在湿漆中的酶在成膜后仍保持其活性。

实例3：开发用于分析膜内酶活性的测定程序

在该实例中，开发了检测方案以直接在膜内可靠地和准确地确定酶活性(而不是在有利于最大酶回收的“苛刻”提取下)。如本文所使用的，在一些实施例中，膜内活性是指将膜置于“天然”溶液下时的直接活性，“软”提取是指可以在更天然的溶液条件下(相对于苛刻的最佳条件)在溶液中提取的酶，而剩余活性是指“软”提取后留在膜内的活性。还开发和测试了用于使酶的膜内活性可视化的琼脂板测定法。膜样品中含有纤维素酶/甘露聚糖酶。

膜内总测定法、软提取测定法和膜内残留测定法的开发

开发了一种无需初始“苛刻提取”即可直接测量膜内酶促活性的测定法(图6A)。将大约5mg(直径0.6cm)的第1组集合1膜样品(理论上含有8mU的酶)加入孔中。接下来，将缓冲液(50mM MES，pH 6，0.25％Triton X 100)和酶底物(0.1mM试卤灵纤维二糖苷)添加到孔中，并在30到50分钟内监测荧光信号(其中激发为550nm，发射为590nm)。出乎意料的是，发现可以直接测量膜内酶促活性而无需最初的“苛刻提取”(图6B)。此外，观察到较高的PVC水平始终导致较高的膜内酶促活性。

接下来，开发了在自然条件下使用测定缓冲液从膜样品中“软”提取酶的方法。使用5.5mg的一片(直径0.6cm)第1组集合3 3B膜样品(理论上含有47.8U/g酶)，因此理论上酶活性为每片0.55U。如图7A所示，将膜添加到200μL测定缓冲液(50mM MES，pH 6，0.25％Triton X 100)中，并在室温下孵育，持续各个时间(1分钟、5分钟、10分钟、20分钟、30分钟和60分钟)。将提取的酶溶液除去、稀释并根据上述方案进行测定。图7B示出了随着孵育时间段的增加，纤维素酶提取的增加。

接下来进行研究以确定与“苛刻”提取相比，从“软”酶提取中回收酶的水平。如图8A所示，将膜在室温下置于“软”提取缓冲液中五分钟，除去提取的酶溶液，添加新鲜的缓冲液，并将此过程重复几次。如上所述对提取的酶溶液进行稀释和测定。图8B示出了通过六次洗涤在30分钟内的累积纤维素酶活性。在室温下进行六次5分钟的洗涤(洗涤1-6)后，将新鲜的缓冲液添加到膜样品中，并在60℃下孵育30分钟(加热1)。孵育结束后，除去提取的酶溶液，再次将新鲜缓冲液添加到膜样品中，并在60℃下进行第二次孵育，持续30分钟(加热2)。有趣的是，发现与“苛刻”提取相比，“软”酶提取的酶回收率低(图8C)。

基于前述研究，开发了膜内总测定法、软提取测定法和膜内残留测定法以测试油漆样品(在图9A和9B中示意性地描绘)。膜内总测定法、软提取测定法和膜内残留测定法各自包括在室温下在具有0.25％Triton-X100，pH 6的50mM MES缓冲液中孵育30分钟。然而，软提取测定法包含测定所提取的酶溶液(包括可溶性蛋白质)的酶活性，而残留的酶活性则使用在上述“软”提取中处理过的膜。

用于使膜内酶活性可视化的测定法的开发

在一些实施例中，前述测定方法包括通过分光光度法对膜样品进行生化分析。为了使膜内酶活性可视化，开发了一种基于琼脂板的方法。制备含有5％琼脂培养基和0.1％偶氮-大麦葡聚糖(纤维素酶/甘露聚糖酶的天然底物)的琼脂板。将干膜样品放在琼脂表面上，使底膜表面与琼脂接触。由于底物的存在，琼脂培养基呈现出底色。如图9C所示，与载有0.1％纤维素酶的膜样品(而非无酶的对照膜)一起孵育导致在膜样品周围和下方的琼脂中出现澄清区域；这种效果是由于长链碳水化合物被酶裂解所致。出乎意料的是，发现当漆膜处于半干燥状态时和/或当漆膜没有浸入溶液中时(这可以有利地模拟涂覆条件)，该测定法是可行的。该测定法的步骤数量有限、成本低廉以及直观的目视分析提供了许多优势和潜在应用，例如，用作多个干漆样品中酶的相对活性的快速筛选工具。这些研究共同提供了原理上的证明，即直接包埋在湿漆中的多种类别的酶保留了其活性，而且在成膜后仍保持活性。

实例4：具有不同调配物的油漆样品的膜内活性

在该实例中，采用实例3中开发的膜内酶活性测定方法来检查天然条件下干漆膜中的酶活性。使用实例3的膜内总测定法、软提取测定法和膜内残留测定法来测定上述油漆样品，以阐明不同油漆调配物组分(例如，PVC水平、填料化学性质)对膜内酶活性的影响。

第2组油漆样品的膜内活性分析

在第2组干膜样品中检测到的膜内总活性、软提取活性和纤维素酶的残留活性分别示于图10A、10B和10C中。基于100％活性为31.2mU/mg的假设，通过膜内分析检测不到10％的酶活性。发现胶乳类型对膜内活性有影响，包括4750和MXK17601-603的膜展现出优异的纤维素酶活性。另外，随着聚结剂(DPnB和Texanol)水平的增加，膜内酶活性也增加。出乎意料的是，发现较高的PVC水平导致较高的膜内酶活性。

进行了一组实验，以确定总的膜内酶活性是否反映了“软”提取中的可溶性酶活性与软提取后膜中的残留酶活性的总和。如图11所示，这一假设得到了证实。有趣的是，发现膜中超过50％的活性来自可溶性酶(“软”提取)。接下来，进行了研究以阐明从膜内分析检测到的酶活性水平与从干膜样品的“苛刻”提取中检测到的酶活性水平之间的关系。如图12所示，使用膜内分析检测到的酶活性水平只是“苛刻”提取后检测到的酶活性的一小部分。表4描绘了根据图12中描述的实验计算得出的膜内活性百分比(_膜内活性/_严苛提取活性)值，所述实验是活性比较，而非蛋白质定量。有趣的是，未发现较高的“苛刻”可提取性与较高的膜内活性相关。研究表明，许多油漆调配物组分，包含DPnB水平、Texanol水平、PVC、中和剂类型和胶乳类型，均有助于酶的可提取性和膜内活性。

表4：膜内活性百分比

为了证实上述生化研究的结果，使用实例3中开发的琼脂板方法将第2组干膜样品的膜内酶活性可视化。表1所示的油漆调配物载有0.1％的纤维素酶(样品2、4、5、7、8、9、14、15、16、17)；未负载酶的平行膜样品(1、3、6、10、11、12、13)用作对照。在37℃下孵育3、7和22的板显示，含有酶的膜周围的清除区域逐渐增加(分别为图13A、13B和13C)。重要的是，这些定性的目视结果与膜内活性生化分析一致，包含发现增加的PVC水平会增加膜内酶活性。

表5：使用琼脂板方法测定的油漆调配物

第1组集合1油漆样品的膜内活性分析

图14A和14B分别示出了通过第1组集合1干膜样品的“严苛”提取和总膜内活性测定法检测到的酶活性。与本文其它实验的结果一致，从较高的PVC样品中检测到较高的膜内活性；此外，与以上结果一致，“苛刻”提取未观察到此效果。据发现，通过膜内测定法检测到少于10％的酶活性。样品5(包括SiO₂-硅藻土填料)展现出最高的膜内活性。这些数据提供了进一步的证据，表明增加的PVC水平会增加膜内酶活性。并且与上述结果一致，较高的“苛刻”可提取性与较高的膜内活性无关。通过膜内总活性测定法和“软”提取测定法进一步测定了具有40％PVC值的第1组集合1A干膜样品(图15)。发现总膜内活性的约25％来自可溶性酶。

第1组集合3油漆样品的膜内活性分析

通过“苛刻”提取和总膜内活性测定法对第1组集合3干膜样品进行了分析(分别为图16A和16B)。与上述测定的集合1干膜样品相比，集合3干膜样品包括更高的酶负载与本文其它实验的结果一致，从较高的PVC样品中检测到较高的膜内活性(并且“苛刻”提取未观察到此效果)。据发现，通过膜内测定法检测到少于12％的酶活性。与以上结果一致，样品5(包括SiO2-硅藻土填料)展现出最高的膜内活性。这些数据提供了进一步的证据，表明增加的PVC水平会增加膜内酶活性。并且与上述结果一致，较高的“苛刻”可提取性与较高的膜内活性无关。通过膜内总活性测定法和“软”提取测定法进一步分析了第1组集合3干膜样品(图17)。从集合1样品中可以看出，大多数膜内活性来自“软”提取。

本文所述的实验通过开发的测定法获得了关于膜内酶活性的许多见解，并且阐明了油漆调配物组分对膜内酶活性的影响。发现膜内酶活性明显低于“苛刻”提取的酶回收率，并且“苛刻”提取中的较高活性与较高的膜内活性无关。在理论性夹杂水平下，膜内测定法中的酶活性明显低于溶液中“游离”酶的酶活性，其中观察到的值仅为约10％或更低。结果表明，从“苛刻”提取中回收的酶仍然保持高活性，因此这不太可能是由于膜中的不可逆酶失活所致。因此，可以合理地得出结论，酶在比活性降低的膜中保持活性。这可能是由于多种因素限制了膜内酶催化转化率，包含底物和/或酶的扩散、底物对酶的可及性以及膜基质中酶的构象。发现总膜内活性的质量平衡大约是可以通过“软”提取进行提取的“游离”酶的活性与残留在膜中的残留活性的总和。最后，出乎意料地发现多种调配物组分对膜内酶活性具有显著影响。发现较高水平的聚结剂可增加膜内活性。PVC水平较高的油漆调配物也表现出增加的膜内活性。另外，胶乳类型和填充剂类型都影响膜内活性，其中包括SiO₂(硅藻土)的调配物展现出最高的活性。重要的是，这些结果已通过使用不同类型的测定法以及不同类型的油漆调配物得到了证实。总的来说，这些研究进一步提供了原理上的证明，即直接包埋在湿漆中的多种类别的酶保留了其活性，而且在成膜后仍然保持活性。

实例5：针对其它酶类别的概念验证分析设计新的膜内活性分析

该实例表明，直接包埋在湿漆中的其它类别的酶在成膜后仍保持其活性。本组实验的另一个目标是开发生化测定法和琼脂板实验方案，二者可以直接并准确地直接在膜内针对扩展的一类酶(包含淀粉酶、脂肪酶、蛋白酶、漆酶、脲酶)确定酶活性。琼脂板筛选是一种可视化和筛选酶活性的快速有效的技术。最后，还进行了研究，阐明了对于这些酶类别，不同油漆调配物组分(例如，PVC水平、填料化学性质)对膜内酶活性的影响。

琼脂板膜内活性测定法

方案

制备的琼脂板由2％Difco琼脂Noble和酶的底物组成。选择底物，使得在将底物酶促转化为产物之后，可以目视观察颜色变化。颜色变化可以来自底物或产物本身，也可以来自与底物一起共同包埋在琼脂中的造影剂。为了达到均匀性，将2％Difco琼脂Noble溶液煮沸成熔融溶液，并在台式机上冷却至 然后添加酶的底物，如下所示：

漆酶底物：0.2mM底物(丁香醛连氮)

脂肪酶底物：1％植物油；2％尼罗红

淀粉酶底物：0.7％红色淀粉

蛋白酶底物：0.5％脱脂奶粉

然后将混合物倒入培养基板，并冷却至室温以使其固化。

将干燥的含酶漆膜的片(例如，由打孔机切割的直径为0.6-cm的圆形片)放置在琼脂表面上。琼脂中的水分部分地润湿了膜，从而使底物迁移至漆膜，并使酶从膜迁移至琼脂中的紧邻区域。通过琼脂中的酶将底物转化为产物，可以目视观察颜色变化(强度增加、强度降低、颜色消失或出现)，并且可以通过成像仪或照相机捕获图像。

结果

将淀粉酶、脂肪酶、蛋白酶和漆酶包埋在等效于第1组样品7A/B(包括Minex 4填料[(NaK)Al₂(AlSi₃)O₁₀(OH)₂])的油漆调配物中。

制备包括5％琼脂和0.7％红色淀粉的红色淀粉琼脂板。图18A示出了根据本文公开的若干实施例的构成红色淀粉琼脂板测定法基础的酶催化反应的示意图。将包括0.1％α-淀粉酶或0.1％β-淀粉酶的干漆膜样品在30℃的琼脂表面上孵育7小时。载有淀粉酶的滤纸和未负载淀粉酶的漆膜分别用作阳性对照和阴性对照。如图18B中所示，载有α淀粉酶(内切和外切作用)的干膜样品显示出良好的淀粉消化(由清除区域表示)，而β淀粉酶(仅外切作用)显示出较差的淀粉消化。

制备包括2％琼脂和0.5％脱脂奶粉的牛奶琼脂板(在一些实施例中，添加蓝色染料以增强对比度)。图19A示出了根据本文公开的若干实施例的构成牛奶琼脂板测定法基础的酶催化反应的示意图。将包括0.1％(1mg/mL)蛋白酶的干漆膜样品在30℃的琼脂表面上孵育3小时。载有蛋白酶的滤纸和未负载蛋白酶的漆膜分别用作阳性对照和阴性对照。如图19B所示，载有乙酰赖氨酸蛋白酶的干膜样品在膜周围呈现出对比度改变的区域。

制备包括2％琼脂、1％植物油和2％尼罗红的植物油琼脂板。图20A示出了根据本文公开的若干实施例的构成植物油琼脂板测定法基础的酶催化反应的示意图。将包括4％(40mg/mL)脂肪酶的干漆膜样品在30℃的琼脂表面上孵育3小时。载有脂肪酶的滤纸和未负载脂肪酶的漆膜分别用作阳性对照和阴性对照。如图20B所示，载有脂肪酶的干膜样品在膜周围呈现出红色区域。将该板再孵育一个小时并除去膜，这表明琼脂中颜色的红移也发生在膜下方(图20C)。

制备包括2％琼脂和0.2mM SGZ的丁香醛连氮(SGZ)琼脂板。图21A示出了根据本文公开的若干实施例的构成SGZ板测定法基础的酶催化反应的示意图。将包括40U/mL漆酶的干漆膜样品在30℃的琼脂表面上孵育4小时。载有漆酶的滤纸和未负载漆酶的漆膜分别用作阳性对照和阴性对照。如图21B所示，由于负载了漆酶(一种多酚氧化酶)的干膜样品具有氧化酚类化合物的能力，因此在膜周围呈现出紫色区域。

这些琼脂板研究提供了概念证明，即淀粉酶、脂肪酶、蛋白酶和漆酶可以直接包埋在湿漆中，并在成膜后保持其在膜内的活性。此外，这些实验表明琼脂板测定法能够可靠地和准确地直接在膜内确定淀粉酶、脂肪酶、蛋白酶和漆酶的活性。鉴于观察到的PVC水平对纤维素酶膜内纤维素酶活性的显著影响，进行了研究PVC水平和填料类型对淀粉酶、脂肪酶、蛋白酶和漆酶的膜内活性的影响的琼脂板测定法。表6描绘了这些酶类别的油漆调配物。淀粉酶、蛋白酶、漆酶和脂肪酶的掺入水平分别为1％、0.1％、41.2U/mL和0.1％。由于溶剂评估，干膜中含有两倍的膜；因此，湿漆中的0.01％意味着干膜中的0.02％。

表6：用于测试多种酶类别的油漆调配物

将漆酶、蛋白酶、α-淀粉酶和脂肪酶添加到包括Minex 4填料和40％PVC(0A样品)或20％PVC(0B样品)的油漆调配物中。图22显示，对于包括脂肪酶和蛋白酶的膜，PVC水平对膜内酶活性的积极影响也是显而易见的。

此外，包括Minex 4填料(表6中的0A和0B样品)或硅藻土填料(0C和0D样品)以及40％PVC(0A和0C样品)或20％PVC(0B和0D样品)的油漆调配物包埋有漆酶和蛋白酶，并通过琼脂板测定膜。与Minex 4相比，在用硅藻土作为填料配制的油漆中，这两种酶类别均展现出更高的膜内活性(图25)。对于所有测试的漆酶样品以及包埋在含硅藻土的油漆中的蛋白酶，发现膜内活性均随着PVC水平的增加而增加；然而，对于包埋在含Minex的油漆中的蛋白酶，并未观察到这种趋势。

生化膜内活性测定法

生化膜内活性测定法的问题与解决方案

比色测定法是方便快捷的体外测定法，所述测定法基于与酶相互作用时底物在特定波长下的吸光度变化来评估酶活性。该测定法需要入射光路径穿过测试溶液并记录所述光的吸光度。在分析干漆膜中的酶活性的情况下，由于干漆膜会阻挡光路，因此无法测量吸光度。这种光阻隔可能会导致许多问题，具体取决于所测试的酶、油漆和底物，所述问题包含：1)酶活性读数不准确；2)需要延长分析时间；3)需要更高水平的底物和/或酶；和/或4)特定油漆调配物与测定法不相容。该挑战特别成问题，因为可能需要进行大量筛选才能阐明用于给定酶和/或预期的油漆应用的最佳油漆调配物。本文提供了该问题的解决方案：将膜配置成允许入射光路径穿过，如例如，通过在将膜放置在样品孔中之前除去膜的内部部分。在一些实施例中，所述方法包括切出膜的中间部分以允许光通过，如图23B所示。重要的是，如图23C所示，该溶液与96孔板中膜的测定法相容。在一些实施例中，使用两种不同尺寸的打孔器将含有酶的干漆膜切成“O形环形状”的片。首先，使用直径为0.6cm的较大的打孔器将干漆膜切成圆形片，所述圆形片完全适配到96孔板的孔中。用较小的打孔器(直径＝0.31cm)在中心进一步切割干漆膜的所述圆形片。这将创建具有0.31cm空心中心(或“O形环形状”)的0.6cm圆盘。结果，所述空心中心使入射的光穿过每个孔的中心，并能够记录所述光的吸光度，而漆膜“O形环”部分中的酶则可以与添加到控中的底物溶液相互作用。重要的是，该方法允许检测从漆膜释放到溶液中的酶以及固定在干漆膜中的酶的酶活性。此外，所述方法便于使用微量滴定板以高通量方式评估不同干漆膜中的酶。此处描述的尺寸适用于96孔微量滴定板规格；可以针对其它板或非板格式调整尺寸，以进行吸光度测量。

比色测定程序

使用2种不同尺寸的打孔器(外径＝0.6cm，内径＝0.31cm)制备5mg含有酶(漆酶、脂肪酶、蛋白酶或淀粉酶)的O形环形状干漆膜，并将其置于96孔板的孔中。活性测定条件如下：

漆酶：将200μL含有0.02mM底物(丁香醛连氮)的100mM磷酸钾缓冲液(pH 6.5)添加到孔中。记录530nm处吸光度随时间的变化，以确定漆酶的活性。

脂肪酶：将200μL含有100mM NaCl、20mM CaCl2、0.01％Triton-X100和1mM底物(4-硝基苯基辛酸酯)的50mM HEPES缓冲液(pH 7.5)添加到孔中。记录405nm处的吸光度随时间的变化，以确定脂肪酶的活性。

淀粉酶：将200μL含有0.1mg/mL BSA、1U/mLβ-葡萄糖苷酶和4mM底物(2-氯-4-硝基苯基-β-D-麦芽三糖苷)的50mM HEPES缓冲液(pH 7.5)添加到孔中。记录405nm处的吸光度随时间的变化，以确定淀粉酶的活性。图23A示出了比色膜内淀粉酶活性测定法的示意图。

蛋白酶：将200μL含有1mM底物(琥珀酰-Ala-Ala-Pro-Phe-对硝基苯胺)的50mMHEPES缓冲液(pH 7.5)添加到孔中。记录405nm处的吸光度随时间的变化，以确定蛋白酶的活性。

脲酶：将100μL含有10μL底物(尿素溶液，配有Sigma Aldrich的脲酶检测试剂盒)的10mM磷酸盐缓冲液(pH 7.0)添加到96孔板中的干漆膜中，并孵育10分钟。在这段时间内，油漆中的脲酶将尿素转化为氨和二氧化碳。然后将150μL检测试剂(试剂A和试剂B，配有Sigma Aldrich的脲酶检测试剂盒)添加到溶液中。这些试剂抑制脲酶活性，并使氨与检测剂反应生成蓝色(波长在600-700nm之间)。记录600-700nm处的吸光度，并将其与脲酶标准曲线比较以确定脲酶的活性。

总膜内活性测定法包括在室温下将膜与测定缓冲液一起孵育30分钟并测量活性。“软”提取活性测定法包括将膜在测定缓冲液中孵育30分钟，除去膜，并测量可溶性蛋白质的活性。膜内残留测定法包括在缓冲液中冲洗“软”提取测定法中的膜，并测量膜中的残留酶活性。图24示出了根据本文公开的若干实施例的膜内总测定法、软提取测定法和膜内残留测定法的示意图(分别为图24A、24B和24C)。

结果

将淀粉酶(20mg/g)、脂肪酶(2mg/g)、蛋白酶(0.2mg/g)和漆酶(82U/g)包埋在表6中的油漆调配物中，所述油漆调配物包括Minex 4填料(0A和0B样品)或硅藻土填料(0C和0D样品)以及40％(0A和0C样品)或20％(0B和0D样品)的PVC。测定膜样品的总膜内活性、“软”提取活性和膜内残留活性。

将脲酶(4U/g)包埋在等效于第2组样品v7_E40/E20(表7中所示)的油漆调配物中，所述样品包括填料Duramite(CaCO₃)，并且包括NaOH作为中和剂。

表7：包埋有脲酶的油漆调配物

对于包埋有漆酶、蛋白酶或脂肪酶的油漆，在含硅藻土的油漆中观察到的膜内酶活性明显高于Minex 4的膜内酶活性，并且较高的PVC水平会导致较高的膜内活性(图26、27和29)。这与包埋有纤维素酶的第1组和第2组油漆样品的膜内活性测定法一致。在添加的酶活性水平下，所测量的最高膜内活性(在具有40％PVC的含硅藻土油漆中)分别为：漆酶，～30％；蛋白酶～20％；以及脂肪酶～6％。然而，在所有油漆调配物中，包埋有淀粉酶的油漆展现出相似的高膜内活性(添加的酶活性水平的～30％)(图28)。

出乎意料的是，PVC水平对脲酶膜内活性有相反的影响，并且较低的PVC水平会导致较高的膜内尿素酶活性(图30)。在添加的脲酶活性水平的～20％处测得最高膜内活性(在具有20％PVC的油漆中)。对于包埋有漆酶、蛋白酶、淀粉酶、脲酶或脂肪酶的膜，大多数膜内活性可以归因于“软”提取的酶，其中检测到的残留活性非常低。

结论

琼脂板测定法和膜内生化活性测定法在各种酶类别和油漆样品中均表现出乎意料的良好效果。进一步地，作为这些方法的验证，通过本文所述的其它方法在不同的油漆调配物和酶类别中获得了相似的结果。通过例如除去内部区域将膜配置成允许光通过，效果出乎意料，并且可以在多种酶类别和油漆调配物中使用。这些实验提供了使用本文开发的琼脂测定法和生化测定法作为筛选工具的概念证明。膜内酶活性(以添加的酶活性水平的百分比衡量)在不同的酶类别之间差异很大。膜内活性的大部分可归因于“软”提取的酶，因为残留的膜活性非常低。最后，对于大多数酶类别，较高的PVC水平始终导致较高的膜内活性；然而，脲酶呈现相反的趋势；并且对于大多数酶类别，具有硅藻土填料的油漆比具有Minex 4填料的油漆具有更高的膜内酶活性。总的来说，这些研究进一步提供了原理上的证明，即直接包埋在湿漆中的多种类别的酶保留了其活性，而且在成膜后仍然保持活性。

实例6：膜中的酶的原位定位和活性

该实例示出了用于使酶在干漆膜和在湿漆中的原位定位以及酶在干漆膜中的原位活性可视化的微观方法。这些研究的另一个目的是发现油漆调配物成分对膜中酶的分布和膜内活性的影响。最后，进行了这些研究以进一步证实通过其它测定方法检测和测量的酶的膜内活性。

膜中的原位酶活性的可视化

用荧光染料(荧光素)共价标记纤维素酶(Pyrolase HT)，然后将其添加到液体油漆样品中；将漆膜涂好并干燥。使用共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)在干漆膜中(在底表面和横截面处)将酶的分布可视化。低倍率图像和高倍率图像均被捕获，其中灰色是由于TiO₂颜料发出的光散射，而荧光发光是由于荧光标记的酶。包括Minex填料[(NaK)Al₂(AlSi₃)O₁₀(OH)₂]的漆膜横截面的显微分析表明，酶的分布表现为小颗粒和较大的区域，可能位于某些填料颗粒上(图31)。图32示出了包括Duramite填料(CaCO₃)的漆膜的横截面，其中观察到酶朝向表面的分布略有梯度，并且酶似乎主要位于填料颗粒上。在包括Minex填料的漆膜的底视图的整个图像中观察到均匀的荧光，其中看到了一些明亮区域(图33)。包括Duramite填料的漆膜的底视图的CLSM可视化在整个图像上也产生了均匀的荧光(图34)，其中一些区域不含酶，而其它区域的酶强烈吸收(可能是CaCO₃填料)(如图34B中的箭头所示)。

这些微观分析表明干漆样品中酶的分布通常不均匀。酶似乎朝向膜表面迁移并在膜上形成梯度。进一步观察到膜内填料颗粒和未指定的附聚物上的吸附。在液体油漆样品中，酶出现不均匀分布，并且主要在水相中，除了在液体油漆中的TiO₂/粘合剂相之外，水相还形成了单独的相。在Minex和Duramite填料的情况下，在液体油漆中均未观察到酶在填料颗粒上的吸附。

膜中的原位酶活性的可视化

为了使膜内酶活性可视化，将底物溶液(试卤灵纤维二糖苷)涂在漆膜的边缘或横截面上。将底物溶液(100μmol试卤灵纤维二糖苷)涂在膜的边缘，当底物被纤维素酶转化时，释放的试卤灵染料发出荧光。图35示出了包括Minex填料[(NaK)Al₂(AlSi₃)O₁₀(OH)₂]的漆膜中酶活性的共聚焦激光扫描显微镜可视化。反射和荧光的叠加层显示出由于TiO₂颜料的散射而产生的灰色反射，而荧光发光则是由于纤维素酶活性使荧光染料试卤灵从底物试卤灵纤维二糖苷中释放出来。在膜内观察到了酶将底物转化为产物(图35)。观察到转化产物(染料)或酶也扩散到周围的溶液相中。有趣的是，在较低的PVC样品中，荧光渗透到膜中的速度较慢(图35B)。

总之，可以在漆膜中将酶对底物(试卤灵纤维二糖苷)的转化可视化。有趣的是，在较高的PVC样品中，底物到膜中的渗透以及随后的酶转化更快。酶促反应产生的荧光染料试卤灵在填料颗粒的界面处富集。然而，游离染料分子本身是略微疏水的，并且在填料颗粒的界面处也吸收更强。因此，不能直接得出酶主要位于这些界面处的结论。总的来说，这些研究进一步提供了原理上的证明，即直接包埋在湿漆中的多种类别的酶保留了其活性，而且在成膜后仍然保持活性。

在至少一些前述实施例中，一个实施例中使用的一个或多个元件可以在另一实施例中互换使用，除非这种替换在技术上不可行。本领域技术人员将认识到，在不脱离所要求保护的主题的范围的情况下，可以对上述方法和结构进行各种其它省略、添加和修改。所有这些修改和改变旨在落入由所附权利要求书限定的主题的范围内。

关于本文中基本上任何复数和/或单数术语的使用，本领域技术人员可以根据情况和/或应用在适当时将复数转换为单数和/或将单数转换为复数。为了清楚起见，可以在本文中明确地阐述各种单数/复数置换。

本领域技术人员将理解，通常，本文中并且尤其在所附权利要求书(例如，所附权利要求书的主体)中使用的术语通常旨在作为“开放”术语(例如，术语“包含(including)”应当被理解为“包含但不限于”，术语“具有(having)”应当被理解为“至少具有”，术语“包含(include)”应当被理解为“包含但不限于”等)。本领域技术人员将进一步理解，如果希望特定数量的所引入的权利要求陈述物，则将在权利要求书中明确地陈述这种意图，并且在没有这种陈述的情况下，不存在这种意图。例如，为了帮助理解，以下所附权利要求书可能含有引入性短语“至少一个”和“一个或多个”的使用以引入权利要求陈述物。然而，此类短语的使用不应被解释为暗示着权利要求陈述通过不定冠词“一个/一种(a或an)”进行的引入将含有这样引入的权利要求陈述物的任何特定权利要求限制为只含有一个这样的陈述物的实施例，即使当同一权利要求包含该引入性短语“一个或多个”或“至少一个”以及不定冠词“一个”或“一种”时也是如此(例如，“一个”和/或“一种”应当被解译为意指“一个或多个”或“至少一个”)；这对于用于引入权利要求陈述物的定冠词的使用同样有效。另外，即使明确陈述了具体数量的引入的权利要求陈述物，本领域技术人员将认识到，这样的陈述应被解释为至少意味着所陈述的数量(例如，没有其它修饰语的情况下，仅陈述“两个陈述物”意指至少两个陈述物、或两个或更多个陈述物)。

此外，在根据马库什(Markush)群组描述本公开的特征或方面的情况下，本领域技术人员将认识到，本公开也因此以马库什群组的任何单独的成员或成员子群组的形式进行描述。

如本领域技术人员将理解的，出于任何和所有目的，如在提供书面描述方面，本文所公开的所有范围还涵盖任何和所有可能的子范围及其子范围的组合。任何列出的范围可以容易地被识别为充分描述并使相同的范围被分解为至少相等的二分之一、三分之一、四分之一、五分之一、十分之一等。作为非限制性实例，本文所讨论的每个范围可以容易地被分解为下三分之一、中三分之一和上三分之一等。如本领域技术人员还将理解的，如“至多”、“至少”、“大于”、“小于”等所有语言包含所引用的数字并且是指可以被随后分解为上文所讨论的子范围的范围。最后，如本领域技术人员将理解的，范围包含每个单独的成员。因此，例如，具有1-3个物品的组是指具有1个、2个或3个物品的组。类似地，具有1-5个物品的组是指具有1个、2个、3个、4个或5个物品的组，依此类推。

尽管本文已经公开了各个方面和实施例，但是其它方面和实施例对于本领域技术人员将是显而易见的。本文所公开的各个方面和实施例是出于说明的目的，而不是旨在进行限制，并且真实的范围和精神由所附权利要求书指示。

本文所引用的所有参考文献，包含专利、专利申请、论文、教科书等，以及本文所引用的参考文献，就其尚未被引用的程度而言，在此通过引用整体并入。如果所结合的文献和类似材料中的一个或多个与本申请不同或矛盾，包含但不限于所定义的术语、术语用法、所描述的技术等，则以本申请为准。