一种泛酸合成酶突变体的高通量快速筛选方法
阅读说明：本技术 一种泛酸合成酶突变体的高通量快速筛选方法 (High-throughput rapid screening method of pantothenate synthetase mutants ) 是由 柳志强 钟娜 张博 郑垦 郑裕国 于 2020-12-04 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种泛酸合成酶突变体的高通量快速筛选方法。本发明以谷氨酸棒杆菌的泛酸合成酶为靶蛋白,利用饱和突变PCR技术对泛酸合成酶基因进行定向进化,突变基因重组于表达载体pET-28a(+)中,并导入大肠杆菌BL21(DE3)构建突变体文库。取β-丙氨酸及衍生化试剂于酶标板孔中,随即置于酶标仪中检测在激发波长355nm,发射波长445nm条件下的荧光值随时间的变化,曲线中最大值关联β-丙氨酸的浓度,得到β-丙氨酸标准曲线。通过计算得到反应液中β-丙氨酸的浓度,以β-丙氨酸浓度的高低来筛选泛酸合成酶突变体,使有效性状的突变株得以快速筛选出来。将缩合反应液、泛酸合成酶突变体全细胞反应液,充分混匀,反应结束后,离心除去细胞沉淀,取上清液和衍生化试剂反应,随即置于酶标仪中检测荧光值随时间的变化,本发明不受反应液中的杂质干扰,灵敏度和准确性高,重复性好,操作简便,便于推广应用。(The invention relates to a high-throughput rapid screening method of a pantothenate synthetase mutant. The invention takes pantothenate synthetase of Corynebacterium glutamicum as target protein, utilizes saturation mutation PCR technology to carry out directed evolution on pantothenate synthetase gene, the mutant gene is recombined in expression vector pET-28a (+), and is introduced into Escherichia coli BL21(DE3) to construct mutant library. And (3) putting beta-alanine and a derivatization reagent into a hole of an enzyme label plate, immediately putting the plate into an enzyme label instrument to detect the change of a fluorescence value with time under the conditions of an excitation wavelength of 355nm and an emission wavelength of 445nm, and correlating the concentration of the beta-alanine with the maximum value in a curve to obtain a beta-alanine standard curve. The concentration of beta-alanine in the reaction solution is obtained by calculation, and the pantothenate synthetase mutants are screened according to the concentration of the beta-alanine, so that the mutants with effective characters can be rapidly screened. The condensation reaction liquid and the pantothenate synthetase mutant whole-cell reaction liquid are fully and uniformly mixed, after the reaction is finished, cell precipitation is removed through centrifugation, supernate is taken to react with a derivatization reagent, and then the reaction liquid is placed in an enzyme labeling instrument to detect the change of a fluorescence value along with time.)
(一)技术领域
本发明涉及一种泛酸合成酶突变体的高通量快速筛选方法。
(二)背景技术
泛酸，又称维生素B5，是活细胞中辅酶A合成的关键前体，是生命所必需的维生素。它可以由微生物和植物合成，但不能由人类和其他动物合成。因此，它已被广泛用作饲料和食品添加剂，以及化妆品和制药工业中的活性成分。特别是家禽家畜及鱼科类动物的生长发育、脂肪的合成和分解，都不可缺少对泛酸钙的需求。缺乏泛酸会导致家禽、家畜生长迟缓、生殖机能发生障碍、适应性降低。泛酸由泛解酸和β-丙氨酸经酶催化缩合而成，具有旋光性，仅D型具有生物活性。纯游离泛酸是一种黄色粘稠油状物，有酸性，易溶于水和乙醇，不溶于苯及氯仿。泛酸在酸、碱以及光、热条件下都不能稳定存在。泛酸一般是参加体内能量的制造，并且可以控制脂肪的新陈代谢，是大脑和神经的必需营养物质。目前国内外很多保健品都添加泛酸钙，如养生堂的“成人维生素”、“成长快乐”等。泛酸钙在此领域的消费需求增长最快。
目前，生产D-泛酸的方法有：①物理诱导结晶法，利用混旋泛酸钙的溶解度大于D-型或L-型这一特点进行诱导结晶，此方法工艺成熟，但只能生产泛酸钙，无法用于其他泛酸衍生物的生产。②化学拆分法，利用氯酶胺等手性拆分剂拆分，但拆分剂价格昂贵，分离困难，还存在毒性和环境污染问题。③微生物法，包含代谢工程法、发酵法和生物酶法，Zhang等利用代谢工程法生产D-泛酸，方法复杂，产量低，最高产量仅28.45g/L；发酵法的产量较高，但存在发酵产物成分复杂，不利于下游提取等问题，发酵过程中产生的物质对食品品质也会产生一定影响；生物酶法是利用泛酸合成酶(PS)催化D-泛解酸和β-丙氨酸进行缩合反应生成D-泛酸，反应条件温和，没有副产物的生成，更有利于产品分离。
微生物体内的D-泛酸生物合成比较复杂，它最后一步合成是在泛酸合成酶(panC)的催化下进行：一分子泛解酸和一分子β-丙氨酸消耗一分子ATP形成一分子泛酸。其中β-丙氨酸来源于天冬氨酸脱羧酶(panD)的催化作用，而泛解酸来源于缬氨酸合成途径的中间体α-酮异戊酸，α-酮异戊酸首先在羟甲基转移酶(panB)作用下生成酮泛解酸，后者在酮泛解酸还原酶(panE)或者酮酸还原异构酶(ilvC)作用下还原生成泛解酸。实际上，所有这些途径都使用泛酸合成酶(PS)缩合D-泛解酸和β-丙氨酸以生成D-泛酸。
然而，很少有研究集中在泛酸合成酶(PS)上，泛酸合成酶是生物生产D-泛酸的关键酶。泛酸合成酶(Pantothenate Synthetase)，由PanC基因编码。在ATP依赖下催化D-pantoate和β-alanine缩合形成泛酸，即维生素B5，在镁或者锰离子存在下该酶活性最好。到目前为止，在PDB库网站中可搜索到70个泛酸合成酶，其中包括1个空载(apo)结构和69个晶体复合物结构。PS蛋白序列全长含287个氨基酸，由A、B两条链组成，且该二聚体两个亚基结构一致。
现有技术筛选突变的PS主要通过将筛选对象即突变的PS作为合成D-泛酸的催化剂，通过检测D-泛酸的含量筛选PS突变体；检测D-泛酸主要通过高效液相色谱(HPLC)的方法，操作费时费力，效率低，不适用于PS突变体的高通量快速筛选，因此有必要研发一种泛酸合成酶突变体的高通量快速筛选方法。
(三)
发明内容
本发明目的本发明目的是一种泛酸合成酶突变体的高通量快速筛选方法。
本发明采用的技术方案是：
一种泛酸合成酶突变体的高通量快速筛选方法，所述方法包括：
(1)试剂配制：选取待筛选泛酸合成酶突变体单克隆，配制泛酸合成酶突变体全细胞反应液；配制β-丙氨酸的衍生化反应试剂；配制泛解酸盐缩合反应液；所述待筛选泛酸合成酶突变体可从泛酸合成酶突变库中随机挑取；泛解酸盐缩合反应液由泛解酸盐，β-丙氨酸，ATP，氯化镁，氯化钾等配制而成，其中泛解酸盐由D-泛酰内酯和氢氧化钠水解制得；所述衍生化反应试剂由硼酸钠缓冲液，1,2-二乙酰基苯，β-巯基乙醇，甲醇，乙醇等配制而成；
(2)β-丙氨酸标准曲线的绘制：取β-丙氨酸及衍生化试剂，随即置于酶标仪中检测荧光值随时间的变化情况，以β-丙氨酸浓度为自变量x，荧光值为因变量y，绘制散点图，得到回归方程y＝ax+b，a为所得斜率；
(3)泛酸合成酶突变体酶活性的测定：取泛解酸盐缩合反应液和泛酸合成酶突变体全细胞反应液，充分混匀、反应结束后，离心除去细胞沉淀，收集反应上清液，稀释n倍至β-丙氨酸的浓度为0.01～10mM；
取稀释后的上清液和衍生化试剂进行反应，随即置于酶标仪中检测荧光值随时间的变化情况，确定β-丙氨酸的荧光值；
(4)筛选：根据待测样品上清液中β-丙氨酸的荧光值，对照β-丙氨酸标准曲线，计算得到反应液中β-丙氨酸的浓度，C(β-丙氨酸)＝(荧光值+b)/a×n，以β-丙氨酸浓度的高低来筛选相应活性高低的泛酸合成酶的突变体，反应液中β-丙氨酸的消耗大于原始菌的10％及以上的突变体，为高活性突变体，可继续进行下一步复筛。
本发明是通过对β-丙氨酸浓度的判断从而对泛酸合成酶突变体的催化活性进行快速筛选，即以β-丙氨酸浓度的高低来筛选相应活性高低的泛酸合成酶的突变体。所述待筛选泛酸合成酶突变体可来自泛酸合成酶突变库。
具体的，所述泛酸合成酶突变体全细胞反应液按如下方法获得：选取待筛选泛酸合成酶突变体单克隆，接种到含有50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃、180rpm过夜培养；第二天吸取细胞培养液再转接到含50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，加入IPTG至终浓度为0.1mM，28℃诱导10h后停止培养；测OD600后离心，收集菌体，加入HEPES缓冲液重悬，-80℃保存。
所述β-丙氨酸的衍生化反应试剂按如下组成配制：0.2M、pH9.5硼酸钠缓冲液，210mg/mL1,2-二乙酰基苯的甲醇溶液和5.7mg/mLβ-巯基乙醇的乙醇溶液按体积比1:1:1混合。
所述泛解酸盐缩合反应液按如下组成配制：25mM D-泛酰内酯与25mMNaOH在室温下搅拌3h后，加入25mMβ-丙氨酸、4.5mM ATP、10mMMgCl2、15mMKCl，定容至200mL，调pH至8.0，2～4℃保存，现配现用。
步骤(2)β-丙氨酸标准曲线的绘制方法如下：取0.089gβ-丙氨酸溶于10mL无菌水，分别稀释配制0、1、2、4、6、8、10mMβ-丙氨酸工作液；在96孔板中加入2.5μL0.2M、pH9.5硼酸钠缓冲液+2.5μL 10mg/mL1,2-二乙酰基苯的甲醇溶液+2.5μL5.7mg/mLβ-巯基乙醇的乙醇溶液，马上置于酶标仪中检测荧光值随时间的变化情况，每4min读取一次，读取31次，记录荧光值的最大值关联β-丙氨酸的浓度；以β-丙氨酸浓度为自变量x，荧光值为因变量y，绘制散点图，得到回归方程y＝ax+b。
本发明高通量筛选方法High-Throughput Screening method(简称HTS)的原理如图1所示。泛酸合成酶催化D-泛解酸和β-丙氨酸以及ATP生成D-泛酸。本发明开发的高通量筛选方法基于伯胺与邻二乙酰基苯和巯基乙醇的选择性荧光响应。β-丙氨酸含有伯胺，能与邻二乙酰基苯和巯基乙醇产生荧光，从而关联β-丙氨酸的浓度(R表示任意官能团，如甲基，乙基等，除羧基)。
本发明的有益效果主要体现在：(1)本发明2h能高通量快速筛选PS突变体96个，大大优于传统的HPLC检测(3个样品/小时)，能够快速筛选高产D-泛酸的PS突变体；(2)本发明不受反应液中的杂质干扰，灵敏度和准确性高，重复性好，操作简单，便于推广应用。
(四)附图说明
图1为本专利高通量筛选的原理示意图。
图2为重组菌表达蛋白SDS-PAGE凝胶电泳示意图。
图3为本专利高通量筛选方法检测β-丙氨酸的标准曲线。
图4为茚三酮检测β-丙氨酸显色情况的标准曲线。
图5为OPA、NAC衍生化试剂检测β-丙氨酸的标准曲线。
图6为PS突变体催化产生D-泛酸的HPLC检测图谱。
图7为液相检测D-泛酸的标准曲线。
(五)
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1：泛酸合成酶重组质粒的构建
将购于American Type Culture Collection(ATCC)网站的谷氨酸棒杆菌ATCC13032接种于5mL LB试管，37℃振荡培养12h，12000rpm离心获得菌体用于提取基因组(FastDNA试剂盒)。
1、在装有菌体的1.5mL离心管中加入1mL CLS-TC，使菌体悬浮裂解，转移至破碎管中，置于细胞破碎仪中破碎。
2、破碎管置于高速离心机12000rpm离心5-10分钟。
3、吸取700-800μL上清液于新的2mL离心管中，并加入等体积的Binding Matrix(使用前先放置37℃预热，混匀)，洗吹混匀。
4、轻柔地上下颠倒5分钟。
5、12000rpm离心1分钟，弃上清。
6、加入500μL SEWS-M使菌体重悬。
7、12000rpm离心1分钟，弃上清。
8、12000rpm空离1分钟，吸去多余上清。
9、加入100μL DES，置于55℃水浴加热5分钟。
10、12000rpm离心2分钟，上清液即提取的基因组。
利用PCR技术从谷氨酸棒杆菌(谷氨酸棒杆菌ATCC 13032)基因组中P出所需的目的泛酸合成酶基因panC，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
PCR扩增反应体系为：25μL 2×Phanta Max Buffer、0.5μL Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase、2μL dNTP、两条引物panC-F、panC-R(序列如表1所示)各1μL、0.5μL模板(谷氨酸棒杆菌ATCC 13032基因组)、20μL ddH2O。
构建pET-28a-panC的PCR程序表
表达载体pET-28a(+)线性化：25μL2×Phanta Max Buffer、0.5μL Phanta MaxSuper-Fidelity DNA Polymerase、2μLdNTP、两条引物pET-28a-F、pET-28a-R(序列如表1所示)各1μL、0.5μL模板(pET-28a(+)质粒，购自擎科)、20μL ddH2O。
构建线性化pET-28a(+)的PCR程序表
线性化质粒和PCR产物经过clean up(采用购自于上海生物工程公司的clean up试剂盒)后，将PCR产物和线性化的表达载体pET-28a(+)相连接，构建获得重组质粒pET-28a-panC。连接体系为：2μLExnase II(C112-02-AB)、4μL 5×Buffer、0.5μL panC片段、0.5μL pET-28a(+)线性化质粒，ddH2O补足20μL。反应条件为：37℃、30min。
表1：引物序列
实施例2：重组大肠杆菌的构建
将实施例1中得到的重组质粒pET-28a-panC通过化学转化法转入表达宿主E.coliBL21(DE3)，化学转化法具体步骤：
(1)将10μL同源重组产物导入100μL E.coli BL21(DE3)感受态细胞；
(2)冰浴20～30min；
(3)42℃水浴热激90s，取出后迅速放入冰中静置冰浴3-5min；
(4)加入650μL无抗性LB培养基混匀，于37℃，200rpm培养1h；
(5)5000rpm离心1min收菌；
(6)移去上清，剩余100-200μL吹吸混匀涂布至添加卡那抗性平板(卡那霉素浓度0.05mg/L)上。
将转化后的菌液涂布于含0.1mmol/L卡那抗性的LB平板上，37℃培养12h，挑取在LB卡那抗性平板(卡那霉素浓度0.05mg/L)上生长的单菌落，利用T7通用引物进行菌落PCR验证，然后挑取阳性转化子接种于含卡那抗性的液体LB培养基(卡那霉素浓度0.05mg/L)中，37℃培养12h后提取质粒送去测序，序列正确的保存对应的甘油管。
实施例3：重组大肠杆菌诱导表达泛酸合成酶
从实施例2中重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)的甘油管中划线分离单菌落，挑取单菌落，接种到含有0.1mM卡那的LB种子培养基中，37℃、200rpm过夜培养，以2％(v/v)的接种量转接到100mL含0.1mmol/L卡那抗性的LB培养基，37℃、200rpm培养至OD600为0.6～0.8，加入终浓度为0.1mM的IPTG进行诱导，28℃下诱导12h后收集菌体进行超声破碎，通过SDS-PAGE凝胶电泳验证，重组菌正确表达目的蛋白。表达情况如图2所示。
实施例4：高通量筛选方法β-丙氨酸标准曲线的绘制
取0.089gβ-丙氨酸溶于10mL无菌水，分别稀释配制0、1、2、4、6、8、10mMβ-丙氨酸工作液；在96孔板中加入2.5μLβ-丙氨酸工作液，150μL 0.2M硼酸钠缓冲液，2.5μL 10mg/mL1,2-二乙酰基苯(溶于甲醇)，2.5μL 5.7mg/mLβ-巯基乙醇(溶于乙醇)，马上置于酶标仪中检测荧光值随时间的变化情况，每4min读取一次，读取31次，记录荧光值的最大值关联β-丙氨酸的浓度；以β-丙氨酸浓度为自变量x，荧光值为因变量y，绘制散点图，得到回归方程y＝ax+b。标准曲线如图3所示。
称取重组菌BL21/pET-28a(+)-panC菌体0.15g，加入3mL HEPES缓冲液(100mMHEPES、20mM氯化镁、1mM EDTA，pH8.0),重悬。在1.1mL的反应底物体系(25mM D-泛解酸盐、25mMβ-丙氨酸、4.5mM ATP、10mM氯化镁、15mM氯化钾)中加入20μL全细胞悬浮液，在37℃振荡反应8min，加盐酸终止反应。反应液12000rpm离心10min后稀释5倍，取2.5μL加入本实施例中高通量筛选体系，快速置于酶标仪上检测，测得荧光值为3290，对应β-丙氨酸浓度为17.14mM，因此，反应过程中消耗了7.86mM的β-丙氨酸。后续96孔板筛选时根据每个孔中消耗的β-丙氨酸的含量高低来判断酶活是否比原始菌有所提高，反应液中β-丙氨酸的消耗大于原始菌的10％及以上的突变体，为高活性突变体，可继续进行下一步复筛。
实施例5：茚三酮法检测β-丙氨酸
酸性茚三酮溶液的制备：250mg茚三酮溶解于6mL乙酸和4mL浓盐酸，在室温中静置30min，若溶解不完全，可放入超声波超声溶解。
显色反应：取500μL酸性茚三酮，500μL乙酸和500μLβ-丙氨酸标品(0.1-1mol/L)混合在一起，在沸水浴中煮10min，取出快速冷却，随即取200μL至酶标板中，然后在紫外波长560nm测出β-丙氨酸的产量。β-丙氨酸与560nm处的吸光值的线性关系如图4所示。该方法的R2为0.9987，线性关系不如本发明提供的方法。另外，此方法影响因素较多，加热时间，加热温度，受热情况等都会影响显色情况，且与β-丙氨酸形成的复合物在空气中极易氧化造成褪色，固不适合用于高通量筛选。
实施例6：OPA、NAC衍生化法检测β-丙氨酸
参考草铵膦的高通量检测方法，用衍生化试剂OPA、NAC对β-丙氨酸进行衍生化。其中衍生化试剂中OPA、NAC的摩尔浓度分别为27.6mM及13.8mM，使用10mL无水乙醇溶解后，再用140mM的硼酸缓冲液(pH9.8)定容至50mL，混合均匀后，冰浴保存三天可用，在进行样品检测时，将β-丙氨酸稀释到一定浓度范围内，与衍生化试剂按2:1的体积比进行反应，在30℃放置40min，于λex＝340nm、λex＝455nm条件下进行检测。标准曲线如图5所示。由于OPA、NAC试剂保存时间短，且检测β-丙氨酸时的线性关系较差，因此，不适用于高通量筛选。
实施例7：D-泛酸含量的HPLC测定标准曲线绘制
检测方法如下：
色谱条件：C18柱(250×4.6mm,particle size 5μm,Agilent Technologies Co.,Santa Clara,CA,USA)、检测波长：200nm、柱温：30℃；
样品处理：将样品用超纯水稀释，保持D-泛酸含量在0.05g/L到0.40g/L之间；
流动相：乙腈/水/磷酸：(50/949/1)；
数据采集时间：18min。
泛酸标准曲线如图7所示。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权力要求书所界定的为准。
序列表
<110> 浙江工业大学
<120> 一种泛酸合成酶突变体的高通量快速筛选方法
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 40
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 1
ctttaagaag gagatatacc atgcaggtag caaccacaaa 40
<210> 2
<211> 40
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 2
tcgagtgcgg ccgcaagctt ctagagctcg atattgtcga 40
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 3
aagcttgcgg ccgcactcga gcacc 25
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 4
ggtatatctc cttcttaaag ttaaa 25
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