具体实施方式

以下结合附图和实施例对本发明做进一步详细说明。

本发明所述的反式1,3-二亚油精具有如下化学结构式：

。

本发明提供一种反式1,3-二亚油精在制备治疗胃癌的药物中的应用。

在一些实施例中，所述反式1,3-二亚油精作为治疗胃癌的药物的活性药物成分。

在一些实施例中，所述反式1,3-二亚油精作为治疗胃癌的药物的唯一活性药物成分。

本发明还提供一种抗胃癌药物，所述抗胃癌药物包括作为活性药物成分的反式1,3-二亚油精，和一种或多种药物可接受的辅料。

在一些实施例中，所述抗胃癌药物为常氧和/或低氧环境下具有抑制胃癌细胞增殖活性的药物。

在一些实施例中，所述抗胃癌药物的剂型可以为片剂、颗粒剂、胶囊剂等药物可接受的剂型。

在一些实施例中，所述药物可接受的辅料包括填充剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂、助流剂、矫味剂、着色剂等。

本发明还提供一种反式1,3-二亚油精在制备健胃药物中的应用。

在一些实施例中，所述反式1,3-二亚油精作为健胃药物的活性药物成分。

在一些实施例中，所述反式1,3-二亚油精作为健胃药物的唯一活性药物成分。

本发明还提供一种健胃药物，所述健胃药物包括作为活性药物成分的反式1,3-二亚油精，和一种或多种药物可接受的辅料。

在一些实施例中，所述健胃药物为常氧和/或低氧环境下具有促进胃黏膜上皮细胞增殖活性的药物。

在一些实施例中，所述健胃药物的剂型可以为片剂、颗粒剂、胶囊剂等药物可接受的剂型。

在一些实施例中，所述药物可接受的辅料包括填充剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂、助流剂、矫味剂、着色剂等。

基于对常氧和低氧条件下正常人胃粘膜上皮细胞系 GES-1的增殖具有良好的促进作用，反式1,3-二亚油精亦可用于制备具有健胃功效的保健品，以及将反式1,3-二亚油精作为起健胃作用的食品添加剂用于制备具有健胃功效的功能性食品。

2,3-二羟基丙基（9E，12E）-9,12-十八碳二烯酸酯为二羟基化合物，且两个羟基相邻，为了选择性在未端羟基上引入十八碳-9，12-二烯，本发明还提供一种制备反式1,3-二亚油精的方法，该方法包括：

在4-二甲氨基吡啶（DMAP）和三乙胺的作用下，2,3-二羟基丙基（9E，12E）-9,12-十八碳二烯酸酯与（9E，12E）-9,12-十八碳二烯酰氯反应，得到所述的反式1,3-二亚油精。

在一些实施例中，4-二甲氨基吡啶的用量为2,3-二羟基丙基（9E，12E）-9,12-十八碳二烯酸酯质量的1~20%。

在一些实施例中，4-二甲氨基吡啶的用量为2,3-二羟基丙基（9E，12E）-9,12-十八碳二烯酸酯质量的1%、2%、4%、8%、10%、12%、14%、16%、18%、20%，或者任意两数值构成的区间范围，如8~12%。

在一些实施例中，三乙胺的用量为2,3-二羟基丙基（9E，12E）-9,12-十八碳二烯酸酯质量的0.5~5倍。

在一些实施例中，三乙胺的用量为2,3-二羟基丙基（9E，12E）-9,12-十八碳二烯酸酯质量的0.5倍、1倍、1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍，或者任意两数值构成的区间范围，如1.5~2倍。

在一些实施例中，2,3-二羟基丙基（9E，12E）-9,12-十八碳二烯酸酯与（9E，12E）-9,12-十八碳二烯酰氯的摩尔比控制在1:0.1~1:10。

在一些实施例中，2,3-二羟基丙基（9E，12E）-9,12-十八碳二烯酸酯与（9E，12E）-9,12-十八碳二烯酰氯的摩尔比为1:0.1、1:0.5、1:1、1:1.5、1:2、1:3、1:4、1:6、1:10，或者任意两数值构成的区间范围，如1:1~1:2。

上述反应可在二氯甲烷（DCM）等惰性溶剂中进行。

上述反应在冰浴中反应，反应时间可控制在10~24小时。

在一些实施例中，所述2,3-二羟基丙基（9E，12E）-9,12-十八碳二烯酸酯可通过包括以下步骤的方法制备：

（1）在催化量的酸作用下，甘油与丙酮反应，得到1,2-甘油乙酰内酯；

（2）在4-二甲氨基吡啶和二环己基碳二亚胺（DCC）的作用下，1,2-甘油乙酰内酯与反式亚油酸反应，得到(2，2-二甲基-1，3-二氧戊环-4-基)-甲基(9E，12E)-9，12-十八碳二烯酸酯；

（3）(2，2-二甲基-1，3-二氧戊环-4-基)-甲基(9E，12E)-9，12-十八碳二烯酸酯在酸作用下水解，得到所述的述2,3-二羟基丙基（9E，12E）-9,12-十八碳二烯酸酯。

在一些实施例中，步骤（1）所述的酸选自对甲基苯磺酸。

在一些实施例中，对甲基苯磺酸的用量为甘油摩尔量的0.01~0.1%。

在优选地实施例中，对甲基苯磺酸的用量为甘油摩尔量的0.05%。

在一些实施例中，步骤（1）所述的甘油与丙酮反应的温度控制在50~100℃。

在优选地实施例中，甘油与丙酮反应的温度控制在70℃。

在一些实施例中，步骤（2）所述4-二甲氨基吡啶的用量为1,2-甘油乙酰内酯质量的1~10%。

在优选地实施例中，4-二甲氨基吡啶的用量为1,2-甘油乙酰内酯质量的4~6%。

在一些实施例中，步骤（2）所述二环己基碳二亚胺的用量为1,2-甘油乙酰内酯质量的1~5倍。

在优选地实施例中，二环己基碳二亚胺的用量为1,2-甘油乙酰内酯质量的3~4倍。

在一些实施例中，步骤（3）所述的酸选自乙酸。

在优选地实施例中，步骤（3）所述水解的温度控制在40~60℃。

在一些实施例中，所述（9E，12E）-9,12-十八碳二烯酰氯可通过以下方法制备得到：

在二甲基甲酰胺（DMF）的作用下，反式亚油酸与氯化亚砜反应，得到（9E，12E）-9,12-十八碳二烯酰氯。

在一些实施例中，反式亚油酸过量的氯化亚砜反应。

在优选地实施例中，氯化亚砜的用量为反式亚油酸摩尔量的2~5倍。

反式亚油酸的化学结构式： 。

实施例1

反式1,3-二亚油精的合成路线如下：

具体过程如下：

（1）1，2-甘油乙酰内酯的合成

将甘油(40 mmol，3.223 g)和对甲基苯磺酸 (0.02 mmol，0.004 g)置于100 ml的圆底烧瓶中，加入丙酮(31.5 mmol，1.83 g)将其溶解，加入己烷(11 ml)，温度设置为70℃，每隔12小时加1 ml的丙酮，在该条件下反应48-60小时，TLC检测反应，反应完全后减压旋蒸除去溶剂，然后硅胶柱分离纯化后得到化合物1,2-甘油乙酰内酯（化学结构式：）。

（2）(2，2-二甲基-1，3-二氧戊环-4-基)-甲基(9E，12E)-9，12-十八碳二烯酸酯的合成

将1，2-甘油乙酰内酯(1.07 mmol，0.141 g)、反式亚油酸(1.07 mmol，0.300 g)和DMAP(0.06 mmol，0.007 g)置于50ml的圆底烧瓶中，加入二氯甲烷（6 mL）将其溶解，再将DCC(2.14 mmol，0.441 g)溶于4 mL的二氯甲烷中，冰浴（0℃）下滴加到装有1，2-甘油乙酰内酯的圆底烧瓶中，室温反应过夜进行TLC检测，反应完成后抽滤除去不溶性的固体，并用石油醚洗3-5次，收集滤液减压旋蒸，然后硅胶柱分离纯化后得到化合物(2，2-二甲基-1，3-二氧戊环-4-基)-甲基(9E，12E)-9，12-十八碳二烯酸酯（化学结构式：）。

（3）2,3-二羟基丙基（9E，12E）-9,12-十八碳二烯酸酯的合成

将(2，2-二甲基-1，3-二氧戊环-4-基)-甲基(9E，12E)-9，12-十八碳二烯酸酯(0.76 mmol，0.301 g)置于25 ml的圆底烧瓶，加入2880 ul的冰乙酸以及720 ul的水将其溶解，在50℃条件下加热回流反应7-12小时，TLC检测反应，反应完全后用乙酸乙酯萃取三次，得到的有机相用饱和NaCl溶液洗两次，无水Na₂SO₄干燥，收集滤液减压旋蒸，然后硅胶柱分离纯化后得到化合物2,3-二羟基丙基（9E，12E）-9,12-十八碳二烯酸酯。

（4）反式1,3-二亚油精的合成

将反式亚油酸(0.423 mmol，0.118 g)、氯化亚砜(1.69 mmol，0.201 g，120 ul，4eq)置于50 ml的圆底烧瓶中，加入6 ml二氯甲烷将其溶解，再加三滴DMF。反应12小时，TLC检测反应，反应完全后旋蒸除去溶剂，加6 ml二氯甲烷旋蒸三次除尽氯化亚砜得到化合物（9E，12E）-9,12-十八碳二烯酰氯（化学结构式： ）。将其溶解于2 ml的二氯甲烷中并加入到装有2,3-二羟基丙基（9E，12E）-9,12-十八碳二烯酸(0.282 mmol，0.100 g)的50 ml的反应瓶中，将DMAP（10%，10 mg）和三乙胺（1.805 mmol，0.183 g，248 ul，6.4eq）加入到2-4 ml二氯甲烷中，在冰浴（0℃）下滴加到50 ml的反应瓶中。反应12小时，TLC检测反应，反应完全后旋蒸除去溶剂，然后硅胶柱分离纯化后得到化合物反式1,3-二亚油精，产率为50%。

实施例2 反式1,3-二亚油精的细胞模型实验

细胞培养

人胃癌细胞系HGC-27细胞，人胃粘膜上皮细胞系GES-1细胞(来自中国典型培养物保藏中心(中国武汉)) 37℃，5％CO₂分别在RPMI Medium Modified（Hyclone,SH30809.01）、Dulbecco's Modified Eagle's Medium-high glucose（Sigma,D6429）中培养，其中补充有10％胎牛血清(Gibco,10270-106)和1％青霉素-链霉素(Gibco, 15140-122)。

细胞活性测定

反式1,3-二亚油精对HGC-27细胞的细胞毒性测定。将5000个细胞铺在96孔板中，每孔加入100μL培养基。贴壁12小时后，每孔给予100μL含不同浓度（0μΜ、50μΜ、100μΜ、200μΜ、300μΜ、400μΜ、500μΜ）反式1,3-二亚油精且预热的正常培养基，分别放入5%二氧化碳、37℃、常氧和1%氧气培养箱培养48小时。吸取各孔培养基，每孔加入无血清培养基配制含1/6原浓度MTS(Promega) 60μL，分别对应放入5%二氧化碳、37℃、常氧或1%氧气培养箱孵育2小时，通过酶标仪（Thermo Scientific）测量490nm吸光值。

反式1,3-二亚油精对GES-1细胞的细胞毒性测定。将10000个细胞铺在96孔板中，每孔加入100μL培养基。贴壁12小时后，每孔给予100μL含不同浓度（0μΜ、6.25μΜ、12.5μΜ、25μΜ、50μΜ、100μΜ、200μΜ、400μΜ、800μΜ、1000μΜ）反式1,3-二亚油精且预热的正常培养基，分别放入5%二氧化碳、37℃、常氧和1%氧气培养箱培养48小时。吸取各孔培养基，每孔加入无血清培养基配制含1/11原浓度CCK8 (ABMole BioScience) 60μL，分别对应放入5%二氧化碳、37℃、常氧或1%氧气培养箱孵育40分钟通过酶标仪（Thermo Scientific）测量450nm吸光值。

统计

使用EXCEL，进行双侧Student's t-检验，检测两组测量值的统计学显著性。P值<0.05被认为是统计学显著的。除非另有说明，否则所有数据均以均值±标准差表示。

实验结果

结果如图4所示，反式1,3-二亚油精在25μM至400μM范围内对于常氧和低氧条件下人胃粘膜上皮细胞系 GES-1的增殖有促进作用（图4 A-B）。反式1,3-二亚油精对于人胃癌细胞系HGC-27具有浓度依赖性杀伤作用且对低氧胃癌细胞具有更强杀伤作用（图4 C-D）。值得注意的是，在300μM及以上浓度时反式1,3-二亚油精明显杀伤胃癌细胞且低氧条件下效果更为显著，同时明显促进正常胃黏膜上皮细胞的增殖。上述结果提示反式1,3-二亚油精是一种潜在的优秀的即可以保护正常胃粘膜细胞、又可以杀伤胃癌细胞的健胃抗癌活性成分。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。