一种含羟基的化合物在制备药物中的应用
阅读说明：本技术 一种含羟基的化合物在制备药物中的应用 (Application of hydroxyl-containing compound in preparation of medicine ) 是由 吴若铭 叶冠 王辉俊 吕兴 于 2019-09-18 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种含羟基的化合物在制备药物中的应用。本发明提供了一种如式I所示含羟基的化合物在制备抗神经胶质瘤药物中的应用。本发明还提供了一种如式I所示含羟基的化合物在制备细胞周期蛋白D1抑制剂和细胞周期蛋白E抑制剂的应用以及制备Jak蛋白磷酸化抑制剂和Stat3蛋白磷酸化抑制剂的应用。本发明的含羟基的化合物能有效抑制神经胶质瘤细胞U251的增殖,为研究与开发新的抗神经胶质瘤药物提供了候选药物,为开发利用桃金娘中的天然活性物质提供了科学依据。(The invention discloses an application of a compound containing hydroxyl in preparing a medicament. The invention provides application of a hydroxyl-containing compound shown as a formula I in preparation of an anti-glioma drug. The invention also provides application of the hydroxyl-containing compound shown as the formula I in preparation of cyclin D1 inhibitors and cyclin E inhibitors and application in preparation of Jak protein phosphorylation inhibitors and Stat3 protein phosphorylation inhibitors. The hydroxyl-containing compound can effectively inhibit the proliferation of glioma cells U251, provides a candidate drug for researching and developing a new glioma-resisting drug, and provides a scientific basis for developing and utilizing natural active substances in myrtle.)
技术领域
本发明涉及一种含羟基的化合物在制备药物中的应用。
背景技术
神经胶质瘤是中枢神经系统肿瘤中最常见的肿瘤。神经胶质瘤的发病机制尚不明确。其发生和发展可能与身体因素、外部环境因素和基因突变等因素有关。它是多种原癌基因和肿瘤抑制基因共同参与的结果。近年来，随着现代生物医学的飞速发展，神经胶质瘤的发病机制和病因研究也取得了一定的进展。研究表明，胶质瘤的发生可能与染色体突变、肿瘤抑制基因的缺失和突变以及癌基因的重排和扩增有关。与肿瘤发病机制密切相关的基因有两种：一种是原癌基因，另一种是抗肿瘤基因。原癌基因的激活、过度表达和有限表达可诱导肿瘤发生。相反，抗肿瘤基因的存在和正常表达有助于抑制肿瘤的发生。原癌基因存在于人体的正常细胞中，在正常情况下，原癌基因低表达或不表达，也不会诱导细胞癌变。在化学产品，病毒生物制品和放射性物质等的刺激下，体内正常细胞中的原癌基因可被异常激活。原癌基因的表达逃避了机体的免疫监视，肿瘤细胞的数量迅速增加，导致肿瘤组织的形成。尽管在临床上广泛应用手术切除、放疗和化疗的手段治疗，但胶质母细胞瘤患者的平均一年生存率仅为46％。其原因之一是胶质瘤的发生发展机制尚不清楚。因此，对胶质瘤发病机制的基础研究，对于该病的治疗和提高生存率具有重要的科学和社会意义。人类胶质瘤细胞U251，生长方式为侵入性生长，多核，其癌变引发的胶质瘤被认为是人类肿瘤细胞中最恶性的肿瘤之一。研究发现，通过对Jak/Stat3信号通路和细胞周期的抑制可以抑制胶质瘤细胞的增殖，影响细胞凋亡过程，从而抑制肿瘤的生长。
细胞周期蛋白D1是一种重要的细胞周期蛋白，在细胞周期进程中起重要作用。最近的研究发现细胞周期蛋白D1参与前列腺癌和口腔鳞状细胞癌细胞增殖的调节。细胞周期蛋白E是一种最初从酿酒酵母中提取的G1期核蛋白。在正常细胞中，细胞周期蛋白E开始在G1中间合成，并达到S期的最高水平。S期发生降解，G2期和M期未见表达。在异常情况下，细胞周期蛋白E在整个细胞周期中无序的过度表达，导致细胞的异常增殖超出控制范围，从而导致肿瘤的发生。
桃金娘(Rhodomyrtus tomentosa)是一种起源于东南亚的常绿灌木，被用于传统泰国药物中，常用来治疗大肠腹泻，痢疾，脓肿，出血和妇科疾病。此外，还被用于制备美白，抗衰老和皮肤美容剂。这种植物的传统医学活动可能是由于其抗氧化活性。到目前为止，已从该植物的叶子中分离出几种化合物，如Rhodomyrtone，花青素，黄烷酸衍生物和六环间氯葡萄糖醇衍生物(TomentosoneA和B)。尽管进行了广泛的植物化学研究，但还没有系统的方法来了解这种植物或其成分的免疫药理活性。
在室温下通过CH2Cl2，Me2CO和MeOH连续提取桃金娘的干燥叶子。将Me2CO萃取物溶解在己烷中并分馏以获得可溶和不溶部分。然后，通过QCC分离可溶性组分，并用己烷-CH2Cl2、CH2Cl2、CH2Cl2-Me2CO和Me2CO梯度溶剂多次洗脱，以获得Rhodomyrtone。
发明内容
本发明要解决的技术间题是为了克服现有的治疗神经胶质瘤的药物种类单一的缺陷，而提供了一种含羟基的化合物在制备药物中的应用。本发明的含羟基的化合物Rhodomyrtone能够有效抑制细胞周期蛋白D1、细胞周期蛋白E的表达以及Jak、Stat3蛋白的磷酸化，能用于制备抗神经胶质瘤药物。
本发明通过以下技术方案解决上述技术问题。
本发明提供了一种如式I所示的含羟基的化合物或其药学上可接受的盐在制备抗神经胶质瘤的药物中的应用；
所述的神经胶质瘤优选为弥漫性星形细胞瘤、少突胶质细胞瘤和室管膜瘤。
本发明还提供了一种药物组合物，其包括如式I所示的含羟基的化合物或其药学上可接受的盐，和药用辅料；
本发明提供了一种抗神经胶质瘤的药物组合物，其包括如式I所示的含羟基的化合物或其药学上可接受的盐，和药用辅料；
本发明提供了一种药物组合物，所述的如式I所示的含羟基的化合物或其药学上可接受的盐的用量为治疗有效量；
本发明所述的药物组合物的剂型可以为口服、阴道、肛门、鼻腔、肌肉或静脉制剂。
所述的口服制剂为片剂、胶囊剂、颗粒剂、缓释制剂或滴丸。
本发明提供了一种如式I所示的含羟基的化合物或其药学上可接受的盐在制备U251细胞增殖抑制剂中的应用；
本发明提供了一种如式I所示的含羟基的化合物或其药学上可接受的盐在制备细胞周期蛋白D1抑制剂和细胞周期蛋白E抑制剂中的应用；
本发明提供了一种如式I所示的含羟基的化合物或其药学上可接受的盐在制备Jak蛋白磷酸化抑制剂和Stat3蛋白磷酸化抑制剂中的应用；
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于：本发明的Rhodomyrtone能够有效抑制细胞周期蛋白D1、细胞周期蛋白E的表达以及Jak、Stat3蛋白的磷酸化，为研究与开发新的抗神经胶质瘤药物提供了候选药物，为开发利用桃金娘中的天然活性物质提供了科学依据。
附图说明
图1为Rhodomyrtone抑制U251细胞的增殖。分别用1、3、9μM Rhodomyrtone处理24小时后的细胞活力，与空白对照组和DMSO组相比较，*表示P＜0.05。
图2为Rhodomyrtone抑制U251细胞的增殖。分别用1、3、9μM Rhodomyrtone处理48小时后的细胞活力，与空白对照组和DMSO组相比较，*表示P＜0.05。
图3为不同细胞周期阶段对照组的细胞分布。
图4为Rhodomyrtone阻断了G0/G1期的U251细胞。用3μM Rhodomyrtone处理24小时的不同细胞周期的U251细胞的细胞分布。
图5为Rhodomyrtone阻断了G0/G1期的U251细胞。用3μM Rhodomyrtone处理48小时的不同细胞周期中U251细胞的细胞分布。
图6为Rhodomyrtone阻断了G0/G1期的U251细胞。用3μM Rhodomyrtone分别处理24h和48h每组不同细胞周期阶段的U251细胞的细胞比例，与DMSO组相比较。
图7为Rhodomyrtone抑制U251细胞中Jak/Stat信号通路。用3μM Rhodomyrtone分别处理15min、30min、1h和2h时p-Jak3、p-Stat3、Stat3和内参蛋白Tubulin的表达量，与DMSO组相比较。
图8为Rhodomyrtone抑制U251细胞中细胞周期蛋白D1和细胞周期蛋白E的表达。用3μM Rhodomyrtone分别处理15min、30min、1h和2h时Cyclin D1、Cyclin E和内参蛋白Tubulin的表达量，与DMSO组相比较。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的内容进行具体阐释，但并不以此限定本发明的保护范围。实验中未详述的实验操作过程均为本领域技术人员所熟知的常规实验操作。
实施例1：化合物Rhodomyrtone的制备
桃金娘干燥枝叶10Kg经90％乙醇(与药材体积比为8：1)加热回流提取3次，每次1h，减压浓缩后得浸膏，经石油醚、乙酸乙酯萃取后，得乙酸乙酯部分，并与100～200目硅胶按质量比为1∶1拌样，以200～300目硅胶进行柱层析，以Rhodomyrtone样品为对照品，洗脱液TLC点板，得Rhodomyrtone部位洗脱液，合并浓缩后，加适量的丙酮进行重结晶，得到Rhodomyrtone粗品681mg。Rhodomyrtone粗品约150mg以岛津LC-20AD HPLC，Zorbax SB-C18硅胶柱(9.4×250mm，5μm)，SPD-M20A紫外检测器，流动相以甲醇：水(80：20)洗脱进行半制备，得到Rhodomyrtone 100mg。Rhodomyrtone通过LC-MS检测得其分子量为442。Rhodomyrtone以CDCl3溶解进行NMR，得C谱、H谱，并与文献报道数据一致。核磁共振数据见表1。
表1化合物Rhodomyrtone的核磁共振数据
Rhodomyrtone的结构式
实施例2：化合物Rhodomyrtone的抗神经胶质瘤生物活性以及相关机制
1.实验材料与方法
胶质瘤细胞系U251购自中国科学院上海细胞生物学研究所。在含有胎牛血清(10％)和链霉素(100μg/ml)青霉素(100IU/ml)的培养基中培养胶质瘤细胞。将培养瓶置于37℃和5％CO2的培养箱中。培养基根据细胞的生长、培养基的颜色和浑浊度每24-48小时更换一次。当细胞生长到培养瓶底部70％以上时，进行传代以调节培养瓶中的细胞密度。
细胞计数试剂盒8(CCK8)法测定细胞增殖率。将细胞悬液接种到96孔板(100μL/孔)中。培养板在37℃，5％CO2的培养箱中预培养。向每个孔中添加CCK8溶液。孵育板在孵育器中孵育1～4小时。酶标法测定了450纳米的吸收。
细胞存活率(％)＝[A(药物)-A(空白)]/[A(0药物)-A(空白)]×100
A(药物)：细胞、CCK8溶液和药物溶液吸收孔
A(空白)：用培养基和CCK8溶液吸收无细胞孔。
A(0药)：细胞吸收孔，CCK8溶液，无药物溶液。
流式细胞仪：PI(碘化丙啶)渗入DNA染色，流式细胞仪检测细胞周期分布。药物治疗24小时后取U251细胞，用PBS(磷酸缓冲盐溶液)冲洗两次。加入预先冷却的70％甲醇，在4℃下固定4小时以上，用PBS洗涤细胞两次，离心分离。在不同样品中加入100μL的RNaseA(核糖核酸酶A)，37℃浸泡30分钟后，在不加光的情况下加入400μL的PI。流式细胞术检测细胞周期。
细胞蛋白提取：培养完成后，对PBS进行多次洗涤。加入含有蛋白酶抑制剂PMSF的RIPA裂解液，刮除细胞。1毫升注射器反复抽吸。细胞放在冰上，反复旋转，离心，然后转移到新的EP管中。用BCA(或直接冷冻在-80℃冰箱中)对蛋白质进行定量分析。计算浓度，根据样品量分配蛋白质，并在沸水中浸泡5分钟。使用高速瞬变加载样品或直接在-20℃冷冻(在-20℃冷冻的蛋白质样品在取样前需要重新煮沸2分钟)。
用RIPA裂解液收集Rhodomyrtone处理的细胞蛋白和对照细胞蛋白，调整到相同的载量200μg，用10％SDS-PAGE凝胶分离蛋白后，用BiO-RAD半干电池(恒压100V，60分钟)将蛋白转移到硝酸纤维素(NC)膜上，取出NC膜。转移。在膜转移结束时，取出NC膜并与5％脱脂奶粉一起温育1小时。然后加入1∶1稀释的抗体，在4℃下孵育过夜。然后在37℃下将第二抗体加入孵育1小时，用1×TBST洗涤3次×5分钟。加入ECL发光溶液温育1分钟，曝光，显影和固定。
2.材料与试剂
3.实验结果
CCK8实验结果表明，Rhodomyrtone处理24小时和48小时的U251细胞增殖率明显低于对照组。浓度越高，增殖率越低。这表明，1、3、9μM的Rhodomyrtone对U251细胞的增殖具有剂量依赖性和时间依赖性。如图1-图2所示。
为进一步研究Rhodomyrtone对U251细胞增殖的抑制作用，Rhodomyrtone处理24h和48h后U251细胞G0/G1期细胞比例明显高于对照组。G2/M期的U251细胞数量显着低于对照组。48h组G0/G1期的U251细胞比例高于24h组，表明U251主要停滞于G0/G1期，随着Rhodomyrtone处理时间的延长，U251细胞阻断数量增加。如图3-图6所示。
为了阐明Rhodomyrtone影响U251细胞周期和增殖的具体机制，采用Westernblotting检测Rhodomyrtone处理后相关蛋白的表达。检测了3μM Rhodomyrtone处理的U251细胞中Jak/Stat3信号通路以及Cyclin D1和Cyclin E随时间的变化。结果显示，随着Rhodomyrtone处理时间的延长，CyclinD1和CyclinE的表达减少，p-Jak(磷酸化的Jak蛋白)和p-Stat3(磷酸化的Stat3蛋白)的表达减少，Jak/Stat3信号通路的抑制程度增加。如图7-图8所示。
上述实验明确的表明，Rhodomyrtone可以有效抑制U251细胞的增殖，并以剂量依赖性和时间依赖性的方式阻断G0/G1期。同时，Rhodomyrtone还可抑制Jak/Stat3信号以及抑制Cyclin D1和Cyclin E蛋白的表达。因此，Rhodomyrtone可用于制备抗神经胶质瘤药物。本发明为研究和开发新的抗神经胶质瘤药物提供了候选药物，为开发利用桃金娘中的天然活性物质提供了科学依据。
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