雷公藤三萜酸在制备防治白斑综合征病毒药物的应用
阅读说明：本技术 雷公藤三萜酸在制备防治白斑综合征病毒药物的应用 (Application of tripterygium triterpenic acid in preparation of medicine for preventing and treating white spot syndrome virus ) 是由 王永杰 李凯 夏文旭 江录志 刘昱辰 覃冰 于 2019-09-19 设计创作，主要内容包括：本发明属于水产养殖的疾病防治领域,特别涉及雷公藤三萜酸在制备防治白斑综合征病毒药物的应用。尤其是在制备防治虾类白斑综合征病毒药物的应用中。雷公藤三萜酸经口投喂或经口注射的方式应用。本发明通过实验证明了雷公藤三萜酸对克氏原螯虾和南美白对虾的保护率均可以达到90％以上。雷公藤三萜酸可用于阻断WSSV通过经口方式感染宿主,作为生产防治虾白斑综合征的药物,可有效预防WSSV的感染和传播,成为虾养殖业中阻断WSSV感染的特效药物。(The invention belongs to the field of disease prevention and treatment of aquaculture, and particularly relates to application of tripterygium triterpenic acid in preparation of a medicine for preventing and treating white spot syndrome virus. In particular to the application of preparing the medicine for preventing and treating the shrimp white spot syndrome virus. The tripterygium triterpenic acid is applied by oral feeding or oral injection. The invention proves that the protection rate of the tripterygium triterpenic acid on procambarus clarkia and penaeus vannamei can reach more than 90 percent through experiments. Tripterygium wilfordii triterpenic acid can be used for blocking WSSV from infecting a host in an oral way, can be used for producing a medicament for preventing and treating shrimp white spot syndrome, can effectively prevent WSSV infection and transmission, and becomes a specific medicament for blocking WSSV infection in shrimp farming industry.)
技术领域
本发明属于水产养殖的疾病防治领域，特别涉及雷公藤三萜酸在制备防治白斑综合征病毒药物的应用。
背景技术
白斑病(White Spot Disease)爆发于上世纪90年代初期，是由虾白斑综合征病毒(White spot syndrome virus，WSSV)引起的一种急性、高死亡率的疾病。对虾一旦感染则在3-7天内出现100％死亡。WSSV是杆状的大型双链环状DNA病毒，基因组大小约为300kbp，被归类为Whispovirus属。WSSV具有广泛的甲壳纲动物宿主，包括养殖或野生的对虾、螃蟹、龙虾、淡水养殖的罗氏沼虾等。虽然不同宿主间的易感染性不同，但是对于所有对虾品种来说WSSV是致命的。对虾感染WSSV后，表现出的临床症状有嗜睡、摄食减少，昼夜活动减少，外皮松动以及肝胰脏变色，最明显的特征是在对虾的头胸甲的外壳上会形成0.5-3.0mm白色斑点。
对WSSV的宿主之一虾来说，由于虾类有摄食同类的天性，这非常有利于病毒的传播。虾类暴露在含有WSSV颗粒的水体中或者经口摄食被WSSV感染的食物，这就非常容易造成WSSV的感染。另外，通过物理接触WSSV也足以造成虾塘中白斑病的爆发。目前，WSSV是全世界虾养殖业的巨大威胁。
从形态学上来说，WSSV颗粒呈卵圆形或者椭圆形，80–120×250–380nm，并一端带有类似“尾巴”的结构，尾状结构功能未知。病毒结构由最外层的囊膜蛋白、桥联蛋白、核衣壳蛋白构成，这些结构单位均为结构蛋白。
囊膜蛋白处在WSSV病毒的最外层，在病毒与宿主细胞识别的过程中起着重要作用。WSSV囊膜蛋白的功能研究已有一定进展，已经明确WSSV囊膜蛋白可参与宿主蛋白的互作。
由于WSSV多种囊膜蛋白具有与宿主的相关蛋白互作的功能，在WSSV的防治中常采用如下几种方法：WSSV囊膜蛋白的重组蛋白疫苗保护、RNA干扰基因沉默虾体内相应的受体蛋白、制备WSSV囊膜蛋白抗体在虾体内进行中和实验以及寻找药物及化合物中和WSSV囊膜蛋白。具体来说，WSSV囊膜蛋白的重组蛋白疫苗保护主要通过真核或者原核表达系统对研究的目标蛋白进行表达纯化，得到重组蛋白后，按照一定的比例加入到用于投喂实验用虾的饲料中去。经口投喂或注射WSSV病毒液后，一段时间后观察实验组虾的死亡及病毒侵染情况确定重组蛋白的保护效果及保护率。现有技术中的防止方法几乎不具备实际的应用价值，因为它们具有时效性短、生产费用昂贵和养殖环境中不易使用等局限性。
雷公藤三萜酸(CAS：86632-20-4)，属于五环三萜类化合物，自1989年发现以来，陆续证实雷公藤三萜酸具有很多同分异构体，三萜类物质广泛具有抗炎作用及免疫调节等功能，但目前对雷公藤三萜酸具体的生理研究依旧不明确。
总的来说，雷公藤三萜酸的具体生理活性功能及应用范围尚不明确，且未见使用雷公藤三萜酸物质制备防治虾白斑综合征的药物，尤其是口服药物的相关报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种雷公藤三萜酸在制备防治白斑综合征病毒药物的应用，本发明通过实验证明，药物雷公藤三萜酸对虾的保护率为90％-100％。
本发明的目的，通过以下技术方案实现：
雷公藤三萜酸(Orthosphenic acid，CAS：86632-20-4，化学式C30H48O5)，分子量488g/mol。分子结构式如下：
雷公藤三萜酸在制备防治白斑综合征病毒药物的应用。优选的，所述雷公藤三萜酸在制备防治虾类白斑综合征病毒药物的应用。进一步优选的，所述虾类为克氏原螯虾或南美白对虾。
所述雷公藤三萜酸经口投喂或经口注射的方式应用。
所述雷公藤三萜酸经口注射的方式应用时，以浓度为50％的乙醇溶解成雷公藤三萜酸溶液，溶液中，雷公藤三萜酸的有效浓度为0.5-150μg/mL，注射剂量为0.002-0.6μg/g。
优选的，所述雷公藤三萜酸经口注射的方式在防治克氏原螯虾白斑综合征病毒应用中时，以浓度为50％的乙醇溶解成雷公藤三萜酸溶液，溶液中，雷公藤三萜酸的有效浓度为0.5-1.5μg/mL，注射剂量为0.002-0.006μg/g。进一步优选的，所述雷公藤三萜酸溶液中的有效浓度为1.0μg/mL，注射剂量为0.004μg/g。
所述雷公藤三萜酸经口投喂的方式应用在防治克氏原螯虾白斑综合征病毒应用中时，经口投喂计量为0.7-0.9mg/万尾虾。进一步优选的，所述雷公藤三萜酸经口投喂的方式应用时，经口投喂计量为0.8mg/万尾虾。
优选的，所述雷公藤三萜酸经口注射的方式应用在防治南美白对虾白斑综合征病毒应用中时，以浓度为50％的乙醇溶解成雷公藤三萜酸溶液，溶液中，雷公藤三萜酸的有效浓度为50-150μg/mL，注射剂量为0.2-0.6μg/g。进一步优选的，所述雷公藤三萜酸溶液中的有效浓度为100μg/mL，注射剂量为0.4μg/g。
所述雷公藤三萜酸经口投喂的方式应用时，应用在防治南美白对虾白斑综合征病毒应用中时，经口投喂计量为70-90mg/万尾虾。进一步优选的，所述雷公藤三萜酸经口投喂的方式应用时，经口投喂计量为80mg/万尾虾。
有益效果为：
1、本发明提供了雷公藤三萜酸可用于阻断WSSV通过经口方式感染宿主，作为生产防治虾白斑综合征的药物，可有效预防WSSV的感染和传播，成为虾养殖业中阻断WSSV感染的特效药物。
2、本发明实验证明了雷公藤三萜酸对克氏原螯虾(小龙虾)和南美白对虾的保护率均可以达到90％以上，能够有效阻断WSSV经口感染虾。尤其是在以克氏原螯虾为活体时，雷公藤三萜酸的有效浓度为1.0μg/mL的药物实验组，注射量为0.004μg/g，保护率达到了100％；以南美白对虾为活体时，雷公藤三萜酸的有效浓度为100μg/mL的药物实验组，注射量为0.4μg/g，保护率亦达到了100％。
附图说明
图1是药物雷公藤三萜酸在克氏原螯虾活体实验结果对比图。
图2是药物雷公藤三萜酸在南美白对虾活体实验结果对比图。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明作进一步说明：
雷公藤三萜酸(Orthosphenic acid，CAS：86632-20-4，化学式C30H48O5)。分子量为488g/mol，购买于卡博森斯化学科技(苏州)有限公司(Carbosynth China Ltd)；
本实验室构建的以VP28为目的基因的WSSV定量标准质粒。海洋动物组织基因组DNA提取试剂盒(TIANGEN)，2×ChamQTM UniversalqPCR Master Mix(Vazyme)，ddH2O、WSSV荧光定量检测的特异性引物VP28(正向序列：AGGTGTGGAACAACACATCAAG，反向序列:TGCCAACTTCATCCTCATCA)由Sangon生产。
实施例1
活体实验方案如下表所示。
(1)、WSSV-free克氏原螯虾：挑选出120只WSSV-free克氏原螯虾(每只20-30g)用于攻毒实验。保证每只克氏原螯虾体型一致、健康状态和活力一致。
WSSV-TW悬浮液，拷贝数8×107copies/μL，由本实验室纯化。
(2)、实验过程：
a.将健康活跃的WSSV-free克氏原螯虾以每组10只随机分布到各个虾缸中并标记组别。
b.对药物雷公藤三萜酸母液400μL(浓度为1mg/mL)进行稀释，获得4mL，浓度为100μg/mL的药液，再按10倍梯度稀释，从而制备药物雷公藤三萜酸的四个浓度梯度的药液。四个浓度分别是0.1μg/mL，1μg/mL，10μg/mL，100μg/mL。
c.将WSSV-TW病毒悬浮液(拷贝数8×107copies/μL)从-80℃中取出，放冰上解冻2-3h，以TM buffer作为稀释液，制备获得8×106copies/μL WSSV-TW病毒悬浮液。
d.取5个15mL无菌离心管中分别标记实验组名称。放置于冰上，往标记好的四个药物组A、药物组B、药物组C和药物组D的试管中，分别加入1.2mL 8×106copies/μL WSSV-TW病毒悬浮液后。随后，药物组A中加入1.2mL0.1μg/mL的药液，药物组B中加入1.2mL1μg/mL的药液，药物组C中加入1.2mL 10ug/mL的药液，药物组D中加入1.2mL 100ug/mL的药液，分别轻摇混匀。最后，制备好阳性对照组WSSV-TW悬浮液和阴性对照组TM buffer。
e.将上述试管，一同放入恒温摇床INNOVA 40R中。孵育条件为：25℃，85rpm，1.5h。
f.将孵育好的药物组A、药物组B、药物组C、药物组D、药物对照组、阴性对照和阳性对照组试管从恒温摇床中取出，在室温放置待用。分别吸取200μL上述液体，以经口注射的方式，注射每组中的每只克氏原螯虾。注意经口注射的组别顺序为阴性对照组、药物组A、药物组B、药物组C、药物组D、药物对照组(100ug/mL药物)和阳性对照组，并且每完成一个组更换新的手套。
g.注射完成后，每天中午查看克氏原螯虾是否死亡，并做好记录。间隔2-3天投喂冻干红虫。空调设定为26℃。收集各组死亡的克氏原螯虾，标记好组别和死亡日期，将死虾样品于-20℃中保存。
(3)、检测
对克氏原螯虾进行逐个WSSV本底检测：实验周期持续三周之后，所有组的克氏原螯虾均被无菌剪刀剪取30mg腹部肌肉，放于1.5mL无菌离心管中。按照海洋动物组织基因组DNA提取试剂盒提取克氏原螯虾腹部肌肉组织的基因组总DNA。利用多功能酶标仪测定DNA浓度，保证浓度范围为50-100ng/μL，分装后提取的DNA并保存于-20℃冰箱中。最后，以这些总DNA为模板，经qPCR(实时荧光定量PCR技术)，检测每个样品中的WSSV含量。
单个20μL的qPCR反应体系：10μL的qPCR Master Mix，各0.6μL的正反引物，6.8μL的ddH2O，DNA模板2μL。荧光定量PCR仪ABI7500 FAST的反应程序设置：Holding stage(95℃30s)，Cycling stage(40个循环，95℃ 15s，60℃ 30s)。Melt Curve Stage(continues，默认参数)。
(4)结论
经过22天的实验观察，实验结束后，统计各组中克氏原螯虾(小龙虾)的存活情况，利用GraphPad Prism 8软件作图，获得该药物雷公藤三萜酸活体实验结果，如图1所示，可见药物雷公藤三萜酸的保护率为90％-100％，能够有效阻断WSSV感染小龙虾。
为此，我们对所有的小龙虾进行了WSSV的qPCR检测，以进一步证明药物雷公藤三萜酸是否具有阻断病毒感染虾。
qPCR检测小龙虾体内的WSSV含量：阴性对照组TM buffer的小龙虾，在整个实验周期中均无死亡，表明经口注射的实验技能无操作失误，并且经过后续的q-PCR检测分析，发现阴性对照组中存活的所有小龙虾均未检测到WSSV。药物雷公藤三萜酸(CAS：86632-20-4)对照组(100μg/mL药物)中的小龙虾全部存活，故此最大剂量的药物不会致死小龙虾，可见100μg/mL雷公藤三萜酸(CAS：86632-20-4)对小龙虾无毒性。阳性对照组WSSV-TW，整个实验周期中，从第三天开始逐渐死亡，直到实验周期结束时累计死亡达到80％，在第22天时，仍有2只小龙虾存活。对阳性对照组中死亡的8只小龙虾经q-PCR检测发现WSSV数量级在107-1010copies/μL，活着的2只中，1只WSSV数量级为106copies/μL，1只为109copies/μL。可见，WSSV-TW毒株是具有活性的，能够感染小龙虾。
对于药物实验组的四个梯度组来说：药物组A(药物0.1μg/mL+WSSV-TW)仅在第14天死掉1只小龙虾，经q-PCR检测分析，发现A组中的死掉的1只小龙虾中WSSV数量级为7.5×109copies/μL，活的小龙虾均不含有WSSV。药物组B(药物1μg/mL+WSSV-TW)在第6天死掉1只小龙虾，经q-PCR检测分析，发现B组中的死掉的1只小龙虾中无WSSV(不是病毒感染死亡)，另外B组中活的9只小龙虾均不含有WSSV。药物组C(药物10μg/mL+WSSV-TW)整个实验过程中无死虾，经q-PCR检测分析，所有小龙虾均不含有WSSV。药物组D(药物100μg/mL+WSSV-TW)在第17天死1只小龙虾，经q-PCR检测分析，发现死掉的1只小龙虾中WSSV数量级为5.14×107copies/μL，同样D组中活的9只小龙虾中均没有检测到WSSV。通过活体实验及q-PCR检测结果，我们将药物雷公藤三萜酸与WSSV病毒颗粒共同孵育后，病毒基本上失去了入侵宿主的能力。因此，该药物雷公藤三萜酸对克氏原螯虾(小龙虾)具有比较良好的保护效果，保护率高达90％-100％。
综上所述，药物活体实验表明，对于四个梯度的药物组来说，药物雷公藤三萜酸对克氏原螯虾(小龙虾)的保护率达到了90％-100％，能够有效阻断WSSV经口感染虾。尤其是药物组B和C，保护率达到了100％。
实施例2
由于克氏原螯虾对WSSV具有一定的抗性，而南美白对虾几乎对WSSV无抗性，为了进一步验证雷公藤三萜酸(CAS：86632-20-4)可以在不同属种的虾类中依旧起到相似的保护作用，在实施例1的基础上，进行了试验的进一步验证与优化，选择以南美白对虾为试验虾种，通过药物包埋WSSV进行经口攻毒试验验证。
活体实验方案如下表所示。
(1)、WSSV-free南美白对虾：挑选出50只WSSV-free南美白对虾(重量：10.5-12g，长度：10.5-13.5cm)用于攻毒实验。保证每只南美白对虾体型一致、健康状态和活力一致。
WSSV-TW悬浮液，拷贝数8×107copies/μL，由本实验室纯化。
(2)、实验过程：
a.将健康活跃的WSSV-free南美白对虾以每组10只随机分布到各个虾缸中并标记组别。
b.选取实施例1中的两种雷公藤三萜酸的药液，浓度分别为10μg/mL和100μg/mL。
c.按照实施例1制备获得8×106copies/μL WSSV-TW病毒悬浮液。
d.取2个15mL无菌离心管中分别标记实验组名称。放置于冰上，往标记好的两个药物组A和药物组B的试管中，药物组A中加入2.4mL 8×106copies/μL WSSV-TW病毒悬浮液后，再加入2.4mL 100μg/mL的药液(以药物组A为优选组，增加了一组平行试验组)；药物组B中加入1.2mL 8×106copies/μL WSSV-TW病毒悬浮液后，再加入1.2mL 10μg/mL的药液，分别轻摇混匀。最后，制备好阳性对照组WSSV-TW悬浮液和阴性对照组TM buffer。
e.将上述试管，一同放入恒温摇床INNOVA 40R中。孵育条件为：25℃，85rpm，1.5h。
f.将孵育好的药物组A、药物组B、阴性对照和阳性对照组试管从恒温摇床中取出，在室温放置待用。分别吸取200μL上述液体，以经口注射的方式，注射每组中的每只南美白对虾。注意经口注射的组别顺序为阴性对照组、药物组A、药物组B和阳性对照组，并且每完成一个组更换新的手套。
g.注射完成后，每天中午查看南美白对虾是否死亡，并做好记录。每天早晚各投喂饲料一次。水温调控在22℃。收集各组死亡的南美白对虾，标记好组别和死亡日期，将死虾样品于-20℃中保存。
(3)、检测
对南美白对虾进行逐个WSSV本底检测：检测方法及步骤按照实施例1中的检测方法。
(4)结论
经过14天的实验观察，实验结束后，统计各组中南美白对虾的存活情况，利用GraphPad Prism 8软件作图，获得该药物雷公藤三萜酸活体实验结果，如图2所示，可见药物雷公藤三萜酸的保护率为80％-100％，能够有效阻断WSSV感染白对虾。
为此，我们对所有的白对虾进行了WSSV的qPCR检测，以进一步证明药物雷公藤三萜酸是否具有阻断病毒感染南美白对虾。
qPCR检测白对虾体内的WSSV含量：阴性对照组TM buffer的白对虾，在整个实验周期中均无死亡，表明经口注射的实验技能无操作失误，并且经过后续的q-PCR检测分析，发现阴性对照组中存活的所有南美白对虾均未检测到WSSV。阳性对照组WSSV-TW，整个实验周期中，从第三天开始逐渐死亡，直到第六天全部死亡，累计死亡达100％。对阳性对照组中死亡的所有白对虾经q-PCR检测发现WSSV拷贝数在3.46×107-9.49×107copies/μL。可见，WSSV-TW毒株是具有活性的，能够感染白对虾。
对于药物实验组的两个梯度组来说：两组药物组A(药物100μg/mL+WSSV-TW)仅其中一组在第5天死掉1只白对虾，经q-PCR检测分析，发现死掉的1只白对虾中WSSV拷贝数为6.51×103copies/μL，其余活的白对虾均不含有WSSV。
药物组B(药物10μg/mL+WSSV-TW)在第4天和第5天分别死掉1只白对虾，经q-PCR检测分析，发现B组中的死掉的2只白对虾中的WSSV拷贝数分别为1.66×104和8.52×105，其余活的白对虾均不含有WSSV。通过活体实验及q-PCR检测结果，我们将药物雷公藤三萜酸与WSSV病毒颗粒共同孵育后，病毒基本上失去了入侵宿主的能力。因此，该药物雷公藤三萜酸对南美白对虾具有比较良好的保护效果，保护率高达80％-100％。
综上所述，药物活体实验表明，对于这两个梯度的药物组来说，药物雷公藤三萜酸对南美白对虾的保护率达到了80％-100％，能够有效阻断WSSV经口感染南美白对虾。尤其是药物组A，保护率可以达到90％-100％。
综上所述，根据药物活体实验的实际保护效果，证实了药物雷公藤三萜酸与WSSV孵育后能够与WSSV表面的囊膜蛋白结合，从而封闭囊膜蛋白的活性位点，有效阻断WSSV经口入侵虾宿主，基于此，使得雷公藤三萜酸可以用于实际的养殖水体中，使其具备实际的应用价值。
此外，出于药物后续应用以及经济性方面的考虑，优选的质量浓度为50％乙醇做溶剂，雷公藤三萜酸药液泼洒于虾养殖池塘，雷公藤三萜酸的有效浓度为1μg/mL时，经口投喂计量为0.8mg/万尾虾，雷公藤三萜酸对克氏原螯虾(小龙虾)的保护率达到了90％；
雷公藤三萜酸的有效浓度为100μg/mL时，经口投喂计量为80mg/万尾虾，雷公藤三萜酸对南美白对虾的保护率达到了90％，可有效阻断WSSV入侵虾宿主。
以上所述为本发明的较佳实施例而已，但本发明不应该局限于该实施例所公开的内容。所以凡是不脱离本发明所公开的精神下完成的等效或修改，都落入本发明保护的范围。