一种ARMS-TaqMan Blocker体系的Blocker双链设计方法
阅读说明：本技术 一种ARMS-TaqMan Blocker体系的Blocker双链设计方法 (Method for designing Blocker double chain of ARMS-TaqMan Blocker system ) 是由 杨芳梅 徐红梅 于 2020-12-08 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种ARMS-TaqMan Blocker体系的Blocker双链设计方法,将Blocker设计在互补链上,形成非竞争性Blocker,与竞争性Blocker同时使用；非竞争性Blocker设计原则：将Blocker设计在突变位点处,覆盖突变位点；Blocker与野生型模板完全匹配；Blocker与突变型模板不完全匹配,不完全匹配的Tm值与退火温度一致或接近；Blocker的3’末端添加多个与模板不匹配的无关碱基。本发明创造性提出非竞争性Blocker设计原则,与竞争性Blocker同时使用,形成双链压制体系,可针对初期产生的少量非特异产物进行压制,在保证体系灵敏度不受影响的前提下,大大提高体系的特异性。(The invention discloses a method for designing a Blocker double chain of an ARMS-TaqMan Blocker system, which comprises the steps of designing Blocker on a complementary chain to form a non-competitive Blocker which is used together with a competitive Blocker; non-competitive Blocker design principle: designing Blocker at the position of a mutation site to cover the mutation site; blocker is completely matched with a wild template; blocker is incompletely matched with the mutant template, and the Tm value of the incomplete match is consistent with or close to the annealing temperature; the 3' end of Blocker is added with a plurality of unrelated bases which do not match with the template. The invention creatively provides a non-competitive packer design principle, and the non-competitive packer design principle is used together with a competitive packer to form a double-chain pressing system, so that a small amount of non-specific products generated in the initial stage can be pressed, and the specificity of the system is greatly improved on the premise of ensuring that the sensitivity of the system is not influenced.)
技术领域
本发明涉及肿瘤突变检测技术领域，具体是一种ARMS-TaqMan Blocker体系的Bloc ker双链设计方法。
背景技术
近年来，探针的非放射性标记受到广泛重视，同时得到迅速发展，广泛应用于核酸序列测定、基因检测以及疾病诊断等。ARMS技术是常用的荧光探针法，其基本原理是，如果引物的3’端碱基与模板碱基不互补，则用一般耐热DNA聚合酶无法延伸。因此根据已知点突变设计3条引物，其3’端碱基分别与突变和正常的模板碱基互补，从而将有某种点突变的模板与正常模板区分开来。有时候为了提高特异性，会在体系中加入野生型模板扩增阻断剂(Blocker)，用以压制野生型模板的扩增，虽然这种方法在一定程度上可以压制野生，但是由于缺乏准确的Blocker设计软件和有效的筛选规则，导致压制效果不理想；另外，也可在ARMS引物的3’端倒数第二或第三个碱基处引入错配碱基，但是引入错配碱基通常会牺牲灵敏度。因此，常规ARMS-TaqMan Blocker体系一般很难同时做到灵敏度、特异性兼顾，常需要复杂繁琐的优化工作。
传统的竞争性Blocker设计在与ARMS引物部分交叠的位置，起到竞争性作用，但仅能对非特异模板的单链进行压制，如果ARMS引物的特异性不理想，初期产生的少量非特异产物会成为后续扩增的模板，并且逃离Blocker的压制作用，增加了非特异信号。
传统的竞争性Blocker设计原则为：①将Blocker设计在突变位点处，覆盖突变位点，与ARMS引物部分重叠，起到位置竞争作用，且尽量使突变位点位于Blocker的中间位置，使得Blocker熔点差较大(依据：突变位点位于中间时的熔点差大于突变位点位于两边时的熔点差)；②Blocker与野生型模板完全匹配，Tm值比ARMS引物与野生型模板匹配的Tm值高约5℃，使Blocker与野生型模板优先结合，而且有时为了增大熔点差，会加入LNA、MGB等修饰；③Blocker与突变型模板不完全匹配，Tm值比ARMS引物与突变型模板匹配的Tm值低，使ARMS引物与突变型模板优先结合；④Blocker的3’末端需加上封闭修饰，如硫代修饰、氨基修饰、磷酸化修饰等，以防止延伸。
发明内容
针对现有ARMS-TaqMan Blocker体系的Blocker设计存在的技术缺陷，本发明提供一种非竞争性Blocker设计，与竞争性Blocker设计同时使用，形成双链压制的ARMS-TaqMan Blocker体系。
本发明保护一种ARMS-TaqMan Blocker体系的双链Blocker设计方法，将Blocker设计在互补链上，形成非竞争性Blocker，与竞争性Blocker同时使用。
非竞争性Blocker设计原则：将Blocker设计在突变位点处，覆盖突变位点；Blocker与野生型模板完全匹配；Blocker与突变型模板不完全匹配，不完全匹配的Tm值与退火温度一致或接近；Blocker的3’末端添加多个与模板不匹配的无关碱基。
竞争性Blocker设计原则：将Blocker设计在突变位点处，覆盖突变位点；Blocker与野生型模板完全匹配，完全匹配的Tm值高于ARMS引物与野生型模板匹配的Tm值，允许熔点差低于5℃；Blocker与突变型模板不完全匹配，不完全匹配的Tm值与ARMS引物跟突变型模板的Tm值一致或接近；Blocker的3’末端添加多个与模板不匹配的无关碱基。此竞争性Blocker设计原则及其优点以详细描述在申请人于2020年11月18日申请的发明专利申请《一种ARMS-TaqMan Blocker体系的Blocker设计和筛选方法》中，申请号为2020112951785，在此仅对其技术效果进行阐述，具体实施例不再重复。
上述竞争性Blocker设计原则，不严格要求突变位点位于Blocker的中间位置，也不需要满足熔点差5℃的要求，只要存在熔点差即可，相对来说更容易设计。与此同时，由于没有严格要求5℃左右的熔点差，所以不需要引入LNA修饰，不存在LNA合成难度及额外的成本费用。
上述竞争性Blocker设计原则，保证Blocker与突变型模板不完全匹配的Tm值与ARMS引物与突变型模板匹配的Tm值一致或接近，因为只有在这个Tm值下，体系中的Blocker才能不会产生冗余，起到最大的压制效果。这一点与传统的竞争性Blocker设计原则是完全不同的。
上述竞争性Blocker设计原则，Blocker的3’末端不需要加特殊的封闭修饰，而是通过在3’末端添加个别无关碱基，这些无关碱基与模板不匹配，从而无法在TaqDNA聚合酶作用下发生延伸，因此不必加特殊修饰，节约了近几十倍的成本。
传统的Blocker设计原则设计成本高，对于多位点检测体系来说，成本费用更是不可低估。本发明的Blocker设计和筛选原则，具有明确的筛选方向，一次性就能筛出最佳Blocker，不需要反复修改，而且Blocker与普通引物一样合成，不需要特殊修饰和纯化，成本低廉。
本发明还保护上述双链压制体系在肿瘤突变检测中的应用。
本发明创造性提出非竞争性Blocker设计原则，与竞争性Blocker同时使用，形成双链压制体系，可针对初期产生的少量非特异产物进行压制，在保证体系灵敏度不受影响的前提下，大大提高体系的特异性。
附图说明
图1为本发明E545K位点双链压制作用考察；
图2为本发明braf位点双链压制作用考察；
图3为本发明G719位点双链压制作用考察。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。本发明的实施例是为了示例和描述起见而给出的，而并不是无遗漏的或者将本发明限于所公开的形式。很多修改和变化对于本领域的普通技术人员而言是显而易见的。选择和描述实施例是为了更好说明本发明的原理和实际应用，并且使本领域的普通技术人员能够理解本发明从而设计适于特定用途的带有各种修改的各种实施例。
说明：本发明使用的引物、探针、Blocker通过软件TMUtilityv1.3进行熔点预测，各引物、探针、Blocker的序列信息见下表1，其中小写字母表示人为添加的碱基、Tm1表示引物/探针/Blocker与靶序列完全匹配时的熔点、Tm2表示引物/Blocker与靶序列不完全匹配时的熔点。
表1
实施例1 E545K位点双链压制作用考察
一、引物、探针、Blocker设计
引物按照ARMS引物设计原则设计，引物长度15-38nt，GC含量40-60％，引物自身3’端避免发卡结构，引物之间避免4个碱基的匹配，碱基分布均匀，避免连续的GC或AT。上游ARMS引物的3’端与突变位点一致，下游引物为通用引物，可同时扩增野生和突变型模板。上游引物E545K-F4序列如表1中的SEQ NO.01，下游引物E545K-R1序列如表1中的SEQ NO.02。
探针按照TaqMan探针设计原则设计，长度为14-35nt，GC含量60-70％，5’端第一个碱基避免为G，探针E545K-P序列如表1中的SEQ NO.03。
竞争性Blocker为E545K-B18，序列如表1中SEQ NO.04；非竞争性Blocker按照本发明设计原则设计，为E545K-B25，序列如表1中SEQ NO.05。
Blocker均经筛选得到，筛选方法为按照本发明的Blocker设计原则设计3-10条Block er，这些Blocker的低熔点都在退火温度附近，有比之高的，也有比之低的，不同Blocker之间可以相差1碱基，使这些Blocker与突变型模板匹配的Tm值在退火温度附近呈现逐步升高的梯度，这样Tm值范围广而密，不会错失最佳Blocker；然后经实时PCR验证梯度Blocker对体系的灵敏度和特异性的影响，筛选出对灵敏度无影响且特异性最好的Blocker。
二、PCR反应体系配制
PCR反应液配制，补充去离子水至25μl。第一组反应液只加竞争性BlockerE545-B18，用量已达到最大添加量，具体成分及浓度参照表2；第二组反应液同时加竞争性BlockerE545-B18和非竞争性BlockerE545-B25，具体成分及浓度参照表3。
PCR成分
用量
10×Buffer(含Mg<sup>2+</sup>)
1×
dNTPs
0.16mM
E545K-F1
0.4μM
E545K-R1
0.4μM
E545K-P
0.4μM
E545-B18
2μM
氯化钠
32mM
表2
PCR成分
用量
10×Buffer(含Mg<sup>2+</sup>)
1×
dNTPs
0.16mM
E545K-F1
0.4μM
E545K-R1
0.4μM
E545K-P
0.4μM
E545-B18
2μM
E545-B25
0.32μM
氯化钠
32mM
Taq酶
1U
表3
三、样本准备
将E545K质粒10^3copies/μl与10ng/μl野生型基因组等体积混合，得到突变率为50％的标准品，将50％的标准品用10ng/μl野生型基因组进行稀释，得到1％和0.1％的标准品，准备10ng/μl野生型基因组，备用。
四、加样，上机
以上两组反应液均加入5μl的1％和0.1％的标准品和10ng/μl野生型基因组，每组各2个平行管并设置无模板对照(NTC)。上机程序为：95℃2min，1个循环；95℃5s，56℃30s(不采集荧光)，72℃15s，10个循环；93℃3s，56℃30s(采集荧光)，60℃30s，35个循环。仪器使用SLAN96荧光PCR仪。
五、实验结果分析
参照图1，第一组只添加竞争性BlockerE545-B18的一组扩增曲线用黑色圆圈表示；，第二组同时添加竞争性BlockerE545-B18和非竞争性BlockerE545-B25的一组用黑色正三角表示；NTC用白色正三角表示。从图1可以看出，双链压制体系的特异性比单链压制的特异性更好，10ng/μl野生型基因组的CT值更靠后。
实施例2 braf位点双链压制作用考察
一、引物、探针、Blocker设计
引物按照ARMS引物设计原则设计，引物长度15-38nt，GC含量40-60％，引物自身3’端避免发卡结构，引物之间避免4个碱基的匹配，碱基分布均匀，避免连续的GC或AT。上游ARMS引物的3’端与突变位点一致，下游引物为通用引物，可同时扩增野生和突变型模板。上游引物braf-F序列如表1中SEQ NO.06，下游引物braf-R序列如表1中SEQN O.07。
探针按照TaqMan探针设计原则设计，长度为14-35nt，GC含量60-70％，5’端第一个碱基避免为G，探针braf-P序列如表1中SEQ NO.8。
竞争性Blocker为braf-B4，序列如表1中SEQ NO.09；非竞争性Blocker按照本发明设计原则设计，为braf-B8，序列如表1中SEQ NO.10；Blocker均经筛选得到，筛选方法同实施例1。
二、PCR反应体系配制
PCR反应液配制，补充去离子水至25μl。第一组反应液只加竞争性Blockerbraf-B4，用量已达到最大添加量，具体成分及浓度参照表3；第二组反应液同时加竞争性Blockerb raf-B4和非竞争性Blockerbraf-B8，具体成分及浓度参照表4。
表3
PCR成分
终浓度
10×Buffer(含Mg<sup>2+</sup>)
1×
dNTPs
0.16mM
braf-F
0.8μM
braf-R
0.8μM
braf-P
0.04μM
braf-B4
0.32μM
braf-B8
0.6μM
氯化钠
20mM
Taq酶
1U
表4
三、样本准备
将braf质粒10^3copies/μl与10ng/μl野生型基因组混合，得到突变率为50％的标准品，将50％的标准品用10ng/μl野生型基因组进行梯度稀释，得到1％和0.1％的标准品，准备100ng/μl野生型基因组，备用。
四、加样，上机
以上两组反应液均加入5μl的1％和0.1％的标准品和100ng/μl野生型基因组，每组各2个平行管并设置无模板对照(NTC)。上机程序为：95℃2min，1个循环；95℃5s，56℃30s(不采集荧光)，72℃15s，10个循环；93℃3s，56℃30s(采集荧光)，60℃30s，35个循环。仪器使用SLAN96荧光PCR仪。
五、实验结果分析
参照图2，第一组只加竞争性Blockerbraf-B4，扩增曲线用黑色圆圈表示；第二组反应液同时加竞争性Blockerbraf-B4和非竞争性Blockerbraf-B8，扩增曲线用黑色正三角表示；NTC用白色正三角型表示。从图2可以看出，双链压制体系的特异性比单链压制的特异性更好，100ng/μl野生型基因组的CT值更靠后，且非特异荧光信号更低。
实施例3 G719位点双链压制作用考察
一、引物、探针、Blocker设计
引物按照ARMS引物设计原则设计，引物长度15-38nt，GC含量40-60％，引物自身3’端避免发卡结构，引物之间避免4个碱基的匹配，碱基分布均匀，避免连续的GC或AT。上游ARMS引物的3’端与突变位点一致，下游引物为通用引物，可同时扩增野生和突变型模板。上游引物G719-F序列如表1中SEQ NO.11，下游引物G719-R序列如表1中SEQ NO.12。
探针按照TaqMan探针设计原则设计，长度为14-35nt，GC含量60-70％，5’端第一个碱基避免为G，探针G719-P序列如表1中SEQ NO.13。
竞争性Blocker为G719-B1，序列如表1中SEQ NO.14；非竞争性Blocker按照本发明设计原则设计，为G719-B6，序列如表1中SEQ NO.15；Blocker均经筛选得到，筛选方法同实施例1。
二、PCR反应体系配制
PCR反应液配制，补充去离子水至25μl。第一组反应液只加竞争性BlockerG719-B1，用量已达到最大添加量，具体成分及浓度参照表5；第二组反应液同时加竞争性BlockerG719-B1和非竞争性BlockerG719-B6，具体成分及浓度参照表6。
PCR成分
终浓度
10×Buffer(含Mg2+)
1×
dNTPs
0.16mM
G719-F
0.8μM
G719-R
0.8μM
G719-P
0.04μM
G719-B1
0.2μM
氯化钠
32mM
表5
表6
三、样本准备
将G719质粒10^3copies/μl与10ng/μl野生型基因组混合，得到突变率为50％的标准品，将50％的标准品用10ng/μl野生型基因组进行稀释，得到1％和0.1％的标准品，准备10ng/μl野生型基因组，备用。
四、加样，上机
以上两组反应液均加入5μl的1％、0.1％的标准品和10ng/μl野生型基因组，每组各2个平行管并设置无模板对照(NTC)。上机程序为：95℃2min，一个循环；95℃5s，56℃30s(不采集荧光)，72℃15s，10个循环；93℃3s，56℃30s(采集荧光)，60℃30s，35个循环。仪器使用SLAN96荧光PCR仪。
五、实验结果分析
参照图3，第一组反应液只加竞争性BlockerG719-B1，扩增曲线用黑色圆圈表示；第二组反应液同时加竞争性BlockerG719-B1和非竞争性BlockerG719-B6，扩增曲线黑色正三角表示；NTC用白色正三角型表示。从图3可以看出，双链压制体系0.1％标准品不受影响，特异性比单链压制更好，10ng/μl野生型基因组无CT值。
显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域及相关领域的普通技术人员在没有作出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都应属于本发明保护的范围。