具体实施方式

下面将结合本发明中的实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动条件下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1 靶向基因突变位点crRNA的的设计及获得

1、基于CRISPR-Cpf1系统的叶酸代谢检测位点的发现

根据基因序列及大量临床检测数据确定叶酸代相关突变基因常见突变位点序列，针对这些不同区域设计crRNA并构建CRISPR-Cpf1系统进行研究。结果表明，以表1的SEQ IDNO.1-3所示区域的序列为基于CRISPR-Cpf1系统的叶酸代谢突变的检测位点，具有很好的检测效果。

表1 叶酸代谢突变的检测位点

其中MTHFR-667突变位点，即在MTHFR基因的第677位点存在C/T多态性，对应SEQID NO.1中第25bp处存在C→T突变；MTHFR-1298突变位点，即在MTHFR基因的第1298位点存在A/C多态性，对应SEQ ID NO.2中第24bp处存在A→C突变；MTRR-66突变位点，即在MTHFR基因的第66位点存在A/G多态性，对应SEQ ID NO.3中第22bp处存在A→G突变。

2、靶向基因突变位点crRNA的设计

(1)靶向基因突变位点crRNA设计原则

由于CRISPR-Cpf1系统是一种新型的靶向DNA基因编辑系统，其中Cpf1与crRNA结合形成监测复合物，crRNA的向导区域用互补序列识别目标DNA，并且Cpf1降解目标DNA链。其中所述crRNA设计要求：crRNA包括蛋白锚定序列和向导序列，序列格式为：5`-与Cpf1蛋白结合的锚定序列-crRNA向导序列-3`，蛋白锚定序列需要根据Cpf1蛋白来确定，使其能够与选定的Cpf1蛋白匹配并结合；向导序列则与靶向DNA中的片段匹配。crRNA向导序列不能离起始密码子(ATG)太近；长度为22-24个核苷酸。

(2)crDNA序列的选择

本发明中选用的Cpf1蛋白为FnCpf1，因此选定与Cpf1蛋白结合的锚定序列为UAAUUUCUACUCUUGUAGAU(如SEQ ID NO.4所示)；所述crRNA向导序列根据上述SEQ ID NO.1-3所示序列中的突变位点区域设计，每个突变位点设计了两个相应的crDNA，其序列具体为：

MTHFR-667突变位点的crDNA：其序列如SEQ ID NO.5-6任一所示；

MTHFR-1298突变位点的crDNA：其序列如SEQ ID NO.7-8任一所示；

MTRR-66基因突变位点的crDNA：其序列如SEQ ID NO.9-10任一所示。

(3)crRNA的获得

将所得的3个突变位点的crDNA片段分别在T7 RNA聚合酶(转录反应体系如表2所示)作用下生成RNA，回收纯化得到crRNA。

表2 转录反应体系

所得crRNA为：

MTHFR-667突变位点的crRNA：其序列如SEQ ID NO.11-12任一所示；

MTHFR-1298突变位点的crRNA：其序列如SEQ ID NO.13-14任一所示；

MTRR-66基因突变位点的crRNA：其序列如SEQ ID NO.15-16任一所示。

实施例2 叶酸代谢相关分子标志物基因突变的检测试剂盒及检测方法

1、试剂盒的组成

本试剂盒包括叶酸代谢检测的6个crRNA(3个突变位点对应的crRNA如实施例1所示获得)或者6个突变位点的crDNA(当试剂盒中为crDNA时，需要操作者先将crDNA片段分别在T7 RNA聚合酶作用下生成RNA，回收纯化得到crRNA，具体见实施例1)、一条特异性荧光探针(如表3所示)、Cpf1蛋白(本实施例采用的是FnCpf1)、无酶水、DNA酶抑制剂；

表3 荧光探针序列

进一步的，所述试剂盒中还可包括扩增体系，所述扩增体系包括等温扩增引物对，各突变位点的引物对具体为：

MTHFR-667突变位点的等温扩增引物对序列如SEQ ID NO.17-18所示；

MTHFR-1298突变位点的等温扩增引物对序列如SEQ ID NO.19-20所示；

MTRR-66突变位点的等温扩增引物对序列如SEQ ID NO.21-22所示。

2、叶酸代谢相关分子标志物基因突变的检测方法

(1)取50-100ng待测样本DNA，加入等温扩增体系(RPA扩增体系)中，RPA扩增体系如表4所示，其中所述引物为如上所示的对应的等温扩增引物对。

表4 RPA扩增体系

(2)将所述得到的扩增产物、与所述检测试剂：对应的crRNA、Cpf1蛋白、荧光探针和无酶水按照表5所示的进行混合，得到检测体系。

表5 检测体系

用100-250nM纯化的Cpf1，50-100nM crRNA，1-5μL合成的荧光探针，2μL DNA酶抑制剂，5-10μL目的DNA的扩增产物，在检测缓冲液(NEBuffer 3)中37℃孵育1～3小时。同时设立阴性对照组(将扩增产物替换为无酶水)。将所述检测体系孵育后加入到胶体金试纸条样品检测区进行检测，观察检测线的有无；或者将所述检测体系孵育后利用荧光检测仪测定荧光值，统计分析反应前后荧光值的变化情况，以判断待测待测样本DNA中是否存在相应的叶酸代谢相关分子标志物基因突变。

实施例3 crRNA对野生型和突变型序列的特异性检测

合成野生株(WT)和突变株(MUT)的靶序列，分别利用实施例1设计的6个crRNA构建检测体系进行检测筛选，检测结果如图1所示，其中667-crRNA1为SEQ ID NO.11所示序列，667-crRNA2为SEQ ID NO.12所示序列；1298-crRNA1为SEQ ID NO.13所示序列，1298-crRNA2为SEQ ID NO.14所示序列；66-crRNA1为SEQ ID NO.15所示序列，66-crRNA2为SEQID NO.16所示序列。根据检测结果，选取相较于野生株在突变株中荧光值变化更显著，即灵敏度更高，效果更优异的crRNA，分别为SEQ ID NO.12所示的667-crRNA2，SEQ ID NO.13所示的1298-crRNA1以及SEQ ID NO.15所示的66-crRNA1。

通过上述筛选得到效果相对较优的crRNA，用于构建CRISPR-Cpf1系统，并在体外进行切割有效性验证，具体为：

用100-250nM纯化的Cpf1，250-500nM crRNA，1-5μL合成的荧光探针，2μL DNA酶抑制剂，不同稀释浓度的目的DNA，在检测缓冲液(NEBuffer 3)中37℃孵育1～3小时。几组反应混合物同时在便携式检测仪中反应(温度设置为37℃，动力学检测每10min检测一次共1个小时)。使用荧光定量PCR仪检测体系的荧光信号变化。

1、MTHFR-667的特异性检测

检测了SEQ ID NO.12所示的MTHFR-667crRNA对野生MTHFR-667、MTHFR-667突变型序列的检测效果，检测结果如图2所示。图2为MTHFR-667突变位点的体系荧光值结果。结果显示，加入野生MTHFR-667、不同浓度的突变型MTHFR-667模板后均出现了荧光信号的升高，其中与MTHFR-667crRNA完全匹配的MTHFR-667突变模板的信号随着时间的延长，为野生型对照组信号的2到3倍以上，普遍高于野生型，利用该方法可以区分10拷贝突变株与10⁴拷贝的野生株，灵敏度高于普通PCR。

2、MTHFR-1298的特异性检测

检测了SEQ ID NO.13所示的MTHFR-1298crRNA对野生MTHFR-1298、MTHFR-1298突变型序列的检测效果，检测结果如图3所示。图3为MTHFR-1298突变位点的体系荧光值结果。结果显示，加入野生MTHFR-1298、不同浓度的突变型MTHFR-1298模板后均出现了荧光信号的升高，其中与MTHFR-1298crRNA完全匹配的MTHFR-1298突变模板的信号随着时间的延长，为野生型对照组信号的2到3倍以上，普遍高于野生型，利用该方法可以区分10拷贝突变株与10⁴拷贝的野生株，灵敏度高于普通PCR。

3、MTRR-66的特异性检测

检测了SEQ ID NO.15所示MTRR-66crRNA对野生MTRR-66、MTRR-66突变型序列的检测效果，检测结果如图4所示。图4为MTRR-66突变位点的体系荧光值结果。结果显示，加入野生MTRR-66、不同浓度的突变型MTRR-66模板后均出现了荧光信号的升高，其中与MTRR-66crRNA完全匹配的MTRR-66突变模板的信号随着时间的延长，为野生型对照组信号的2到3倍以上，普遍高于野生型，利用该方法可以区分10拷贝突变株与10⁴拷贝的野生株，灵敏度高于普通PCR。

综上，结果显示本发明设计的crRNA检测靶标DNA的体系荧光值变化趋势均显著高于阴性对照，即本发明所述的用于检测叶酸代谢相关分子标志物基因突变的3个crRNA可以分别特异性地检测出对应的突变序列。

实施例4 crRNA对野生型和突变型序列的灵敏性试验

检测实施例3筛选得到的效果相对较优的3个crRNA的灵敏度，具体为：

1、MTHFR-667突变位点的crRNA的灵敏度检测

将MTHFR-667突变质粒和野生型质粒标准品梯度稀释后作为模板进行PCR扩增并构建检测体系，随后用1.0％的琼脂糖凝胶电泳检测，电泳结果如图5所示。阴性对照(NC，即0copies/μL)无条带，说明扩增过程中无污染；模板浓度在10³copies/μL至10⁴copies/μL时，均可观察到位于100-250bp之间的单一电泳条带，条带清晰且与目的条带大小(150bp左右)一致；而当模板浓度低于为10²copies/μL时则观察不到扩增条带，说明利用琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物时，其灵敏度约能达到10²copies/μL左右。

2、MTHFR-1298突变位点的crRNA的灵敏度检测

将MTHFR-1298突变质粒和野生型质粒标准品梯度稀释后作为模板进行PCR扩增并构建检测体系，随后用1.0％的琼脂糖凝胶电泳检测，电泳结果如图6所示。阴性对照(NC，即0copies/μL)无条带，说明扩增过程中无污染；模板浓度在10³copies/μL至10⁴copies/μL时，均可观察到位于250-500bp之间的单一电泳条带，条带清晰且与目的条带大小(280bp左右)一致；而当模板浓度低于为10²copies/μL时则观察不到扩增条带，说明利用琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物时，其灵敏度约能达到10²copies/μL左右。

3、MTRR-66基因突变位点的crRNA的灵敏度检测

将MTRR-66突变质粒和野生型质粒标准品梯度稀释后作为模板进行PCR扩增并构建检测体系，随后用1.0％的琼脂糖凝胶电泳检测，电泳结果如图7所示。阴性对照(NC，即0copies/μL)无条带，说明扩增过程中无污染；模板浓度在10³copies/μL至10⁴copies/μL时，均可观察到位于250-500bp之间的单一电泳条带，条带清晰且与目的条带大小(320bp左右)一致；而当模板浓度低于为10²copies/μL时则观察不到扩增条带，说明利用琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，其灵敏度约能达到10²copies/μL左右。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 武汉博杰生物医学科技有限公司

<120> 叶酸代谢相关分子标志物基因突变的检测试剂盒与检测方法

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<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 56

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tgaaggagaa ggtgtctgcg ggagccgatt tcatcatcac gcagcttttc tttgag 56

<210> 2

<211> 45

<212> DNA

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<212> DNA

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<210> 4

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<212> RNA

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<212> DNA

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<212> DNA

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