用于检测基因多态性的引物组、试剂盒及方法
阅读说明：本技术 用于检测基因多态性的引物组、试剂盒及方法 (Primer group, kit and method for detecting gene polymorphism ) 是由 冯薇 赵方圆 智慧芳 倪君君 于 2020-12-21 设计创作，主要内容包括：本发明提供了用于检测基因多态性的引物组、试剂盒及方法,该引物组包括：用于检测APOE基因、CYP4F2基因、GGCX基因、NPC1L1基因、NQO1基因和VKORC1基因的引物对。利用该引物组进行多重PCR检测时,通过一次PCR反应可以同时对上述至少一个基因的突变进行检测,使得基因检测通量提高。(The invention provides a primer group, a kit and a method for detecting gene polymorphism, wherein the primer group comprises: primer pairs for detecting APOE gene, CYP4F2 gene, GGCX gene, NPC1L1 gene, NQO1 gene and VKORC1 gene. When the primer group is used for multiple PCR detection, the mutation of at least one gene can be simultaneously detected through one PCR reaction, so that the gene detection flux is improved.)
技术领域
本发明涉及基因检测技术领域，特别涉及用于检测基因多态性的引物组、试剂盒及方法。
背景技术
维生素K是血块形成的必需脂溶性维生素，当维生素K缺乏时，会引起机体的凝血、骨代谢异常。而APOE基因、CYP4F2基因、GGCX基因、NPC1L1 基因、NQO1基因、VKORC1基因与维生素K的代谢相关。
目前，可针对维生素K代谢相关基因APOE基因、CYP4F2基因、GGCX 基因、NPC1L1基因、NQO1基因和VKORC1基因分别设计聚合酶链式反应 (Polymerase Chain Reaction，PCR)检测试验，以进行基因突变情况的检测。
但是，由于每个PCR反应只针对一个外显子/突变位点，故导致基因多态性的检测通量低。
发明内容
本发明提供了用于检测基因多态性的引物组、试剂盒及方法，能够提高基因多态性的检测通量。
本发明提供了用于检测基因多态性的引物组，包括：下述至少一个引物对；其中，
用于检测APOE基因388T>C位点和526C>T位点的引物对，其中，该引物对的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；在上游引物SEQ ID NO.1和下游引物SEQ ID NO.2 来扩增APOE基因的388T>C位点、526C>T位点及其上下游基因时，相应扩增产物的片段长度为490bp。
用于检测CYP4F2基因rs3093168T>C位点的引物对，其中，该引物对的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，下游引物的核苷酸序列由 SEQ ID NO.4所示，测序引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；利用上游引物SEQ ID NO.3和下游引物SEQ ID NO.4来扩增CYP4F2基因rs3093168 T>C位点及其上下游基因时，相应扩增产物的片段长度为581bp。
用于检测CYP4F2基因rs2108622G>A位点的引物对，其中，该引物对的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，下游引物的核苷酸序列如 SEQ ID NO.7所示；利用上游引物SEQ ID NO.6和下游引物SEQ ID NO.7来扩增CYP4F2基因的rs2108622G>A位点及其上下游基因时，相应扩增产物的片段长度为904bp。
用于检测GGCX基因INV2-1G>T位点的引物对，其中，该引物对的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示，下游引物的核苷酸序列如 SEQ ID NO.9所示；利用上游引物SEQID NO.8和下游引物SEQ ID NO.9来扩增GGCX基因的INV2-1G>T位点及其上下游基因时，相应扩增产物的片段长度为159bp。
用于检测GGCX基因Val255Met位点的引物对，其中，该引物对的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示，下游引物的核苷酸序列如 SEQ ID NO.11所示；利用上游引物SEQ ID NO.10和下游引物SEQ ID NO.11 来扩增GGCX基因的Val255Met位点及其上下游基因时，相应扩增产物的片段长度为300bp。
用于检测检测GGCX基因Phe299Ser位点、Ser300Phe位点、Gln374Ter、 Leu394Arg位点、Arg476His\Cys位点、Arg485Pro位点、Trp493Ser位点、 Trp501Ser位点、Gly537Tyr位点和Gly558Arg位点的引物对，其中，该引物对的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示，测序引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示；利用上游引物SEQ ID NO.12和下游引物SEQ ID NO.13来扩增GGCX基因的 Phe299Ser位点、Ser300Phe位点、Gln374Ter位点、Leu394Arg位点、 Arg476His\Cys位点、Arg485Pro位点、Trp493Ser位点、Trp501Ser位点、 Gly537Tyr位点、Gly558Arg位点及其上下游基因时，相应扩增产物的片段长度为2368bp。
用于NPC1L1基因Leu216Ala位点的引物对，其中，该引物对的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示，下游引物的核苷酸序列如 SEQ ID NO.16所示；利用上游引物SEQID NO.15和下游引物SEQ ID NO.16 来扩增NPC1L1基因的Leu216Ala位点及其上下游基因时，相应扩增产物的片段长度为697bp。
用于检测NQO1基因Pro187Ser位点的引物对，其中，该引物对的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示，下游引物的核苷酸序列如 SEQ ID NO.18所示；利用上游引物SEQ ID NO.17和下游引物SEQ ID NO.18 来扩增NQO1基因的Pro187Ser位点及其上下游基因时，相应扩增产物的片段长度为1126bp。
用于检测VKORC1基因rs9923231-1369G>A位点的引物对，其中，该引物对的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.19所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.20所示；利用上游引物SEQ ID NO.19和下游引物SEQ ID NO.20来扩增VKORC1基因的rs9923231-1369G>A位点及其上下游基因时，相应扩增产物的片段长度为404bp。
用于检测VKORC1基因Arg98Trp位点的引物对，其中，该引物对的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.21所示，下游引物的核苷酸序列如 SEQ ID NO.22所示。利用上游引物SEQ ID NO.21和下游引物SEQ ID NO.22 来扩增VKORC1基因的Arg98Trp位点及其上下游基因时，相应扩增产物的片段长度为222bp。
通过上述引物对组成的引物组，可提高APOE基因、CYP4F2基因、GGCX 基因、NPC1L1基因、NQO1基因、VKORC1基因多态性检测的准确性，还可以最大程度提高检测通量。
多重PCR是在常规PCR基础上发展的一种新型扩增技术，即可在一个反应体系中加入两对及两对以上的引物，同时扩增多个核酸片段。多重PCR 在微生物、遗传病、肿瘤、药物基因组学有着重要的应用。
基于此，本发明还提供了用于检测基因多态性的试剂盒，包括：由上述至少一个引物对组成的引物组。
在本发明一实施例中，所述试剂盒中还包括：DNA聚合酶、与所述DNA 聚合酶相对应的PCR缓冲液、4种dNTP的混合物和超纯水。
其中，所述DNA聚合酶的用量包括0.5～5U，每种所述dNTP的终浓度为50～500μM，引物组中的每条引物的终浓度为20～400nM。
所述DNA聚合酶包括：Taq聚合酶、KOD FX聚合酶、Pfu聚合酶或 Phusion聚合酶。其中，与DNA聚合酶相对应的PCR缓冲液的浓缩程度包括 1×、2×、3×、4×、5×、6×、7×、8×、9×或10×。
针对DNA聚合酶的用量来说，0.5～5U是指0.5U至5U范围内的任一值，比如，0.5U、1U、1.5U、2U、2.5U、3U、3.5U、4U、4.5U以及5U。
针对每种dNTP的终浓度来说，50～500μM是指50M至500M范围内的任一值，比如，50μM、100μM、150μM、200μM、250μM、300μM、350μM、 400μM、450μM以及500μM。
针对每条引物的终浓度来说，20～400nM是指20nM至400nM范围内的任一值，比如，20nM、50nM、100nM、150nM、200nM、250nM、300nM、 350nM以及400nM。
具体地，在制作试剂盒时，还可以根据实际需要，选择性的配置用于提取待测样本DNA的试剂或者专业的DNA提取试剂盒；可以更方便快捷地得到待测样本的DNA，增强本发明的检测成品试剂盒的使用方便和快捷性。所述待测样本可以为任何含有DNA的血液、细胞、组织或口腔拭子样本。
本发明还提供了基因多态性的检测方法，包括：
设计上述由至少一个引物对组成的引物组，或者，移取上述试剂盒中的引物组；
从待测样本中提取基因组DNA作为扩增模板；
配制包含所述引物组和所述扩增模板的多重PCR反应体系；
对所述多重PCR反应体系进行多重PCR扩增反应，得到PCR产物；
根据所述PCR产物，确定所述待测样本的APOE基因、CYP4F2基因、 GGCX基因、NPC1L1基因、NQO1基因和VKORC1基因的基因型。
具体地，当利用试剂盒中的引物组进行PCR扩增反应时，配制包含所述引物组和所述扩增模板的多重PCR反应体系可以包括：
利用试剂盒中的引物组、DNA聚合酶，与该DNA聚合酶相对应的PCR 缓冲液、4种dNTP的混合物、超纯水和扩增模板，配制PCR反应体系。
在本发明一实施例中，所述根据所述PCR产物，确定所述待测样本的 APOE基因、CYP4F2基因、GGCX基因、NPC1L1基因、NQO1基因和VKORC1 基因的基因型，包括：
利用电泳检测所述PCR产物，获得所述PCR产物的扩增片段的大小；
当所述PCR产物的扩增片段的大小正确时，对所述PCR产物进行核苷酸序列测定，获得所述待测样本的APOE基因、CYP4F2基因、GGCX基因、 NPC1L1基因、NQO1基因和VKORC1基因的基因型。
具体地，可用琼脂糖凝胶电泳或聚丙烯酰胺凝胶电泳分辨不同长度的 DNA片段。
举例来说，选用KOD FX作为DNA聚合酶，且选用2×的浓缩的PCR 缓冲液时，为配置上述PCR反应体系，该体系中各个组分的用量可以为： DNA聚合酶0.5～2μl、PCR缓冲液18～30μl、各种dNTP的混合物2～12μl、 10个引物对的混合物2～10μl、DNA 5～1000ng，以及适量超纯水，以补水至 50μl。也可以为按照相同比例配置的其他体积大小。
具体地，在本发明一实施例中，所述PCR反应体系的反应条件如表1：
表1
表1中还示出了PCR产物的保存条件为2～8℃。
针对预变性的温度和变性的温度来说，94～98℃是指94℃至98℃范围内的任一值，比如，94℃、95℃、96℃、97℃以及98℃。
针对预变性时间来说，60～600s是指60s至600s范围内的任一值，比如，60s、100s、150s、200s、250s、300s、350s、400s、450s、500s、550s以及、 600s。
针对变性时间来说，5～60s是指5s是指60s范围内的任一值，比如，5s、 10s、20s、30s、40s、50s、60s。
针对退火温度来说，50～68℃是指50℃是指68℃范围内的任一值，比如， 50℃、52℃、54℃、56℃、58℃、60℃、62℃、64℃、66℃以及68℃。
针对退火时间来说，10～120s是指10s至120s范围内的任一值，比如， 10s、15s、20s、30s、40s、50s、60s、70s、80s、90s、100s、110s以及120s。
针对延伸的温度和终延伸的温度来说，68～72℃是指68℃至72℃范围内的任一值，比如，68℃、69℃、70℃以及72℃。
针对延伸时间来说，30～360s是指30s至360s范围内的任一值，比如， 30s、50s、100s、150s、200s、250s、300s以及360s。
针对终延伸时间来说，0～1800s是指0s至1800s范围内的任一值，比如， 0s、10s、50s、100s、200s、300s、400s、500s、600s、700s、800s、900s、 1000s、1100s、1200s、1300s、1400s、1500s、1600s、1700s以及1800s。
需要说明的是，该基因多态性的检测方法为非诊断目的的方法。
具体地，从待测样本中提取基因组DNA的方式，包括：通过手工提取或试剂盒提取，再对提取DNA进行提取处理，得到基因组DNA。
同现有技术相比，本发明至少可以具有以下有益效果：
(1)扩增结果判读直观准确：本发明提供的各条引物，可以保证将各引物对的扩增产物大小充分区分，各扩增片段之间不会相互作用产生非特异性产物或二聚体，确保了结果的准确性。
(2)提高检测通量：普通PCR每个反应只针对一个引物对扩增产生一个核酸片段，而本发明的多重PCR可以同时扩增出至少两个核酸片段，通过单管一次反应可以对APOE基因、CYP4F2基因、GGCX基因、NPC1L1基因、 NQO1基因和VKORC1基因中的多个热点突变位点进行检测。
(3)降低成本：本发明可以将PCR反应体系由多个体系/程序缩减至一个体系/程序，故减少了DNA聚合酶、dNTP等试剂和耗材的使用量，可大幅度降低检测成本。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明一实施例提供的琼脂糖凝胶电泳检测结果；
图2是本发明一实施例提供的PCR产物序列测定结果中针对APOE基因突变位点c.388T>C的部分核苷酸碱基序列；
图3是本发明一实施例提供的PCR产物序列测定结果中针对APOE基因突变位点c.526C>T的部分核苷酸碱基序列；
图4是本发明一实施例提供的PCR产物序列测定结果中针对CYP4F2基因突变位点rs3093168T>C的部分核苷酸碱基序列；
图5是本发明一实施例提供的PCR产物序列测定结果中针对CYP4F2基因突变位点rs2108622G>A的部分核苷酸碱基序列；
图6是本发明一实施例提供的PCR产物序列测定结果中针对AGGCX基因突变位点INV2-1G>T的部分核苷酸碱基序列；
图7是本发明一实施例提供的PCR产物序列测定结果中针对GGCX基因的Val255Met的部分核苷酸碱基序列；
图8是本发明一实施例提供的PCR产物序列测定结果中针对NPC1L1基因的Leu216Ala的部分核苷酸碱基序列；
图9是本发明一实施例提供的PCR产物序列测定结果中针对NQO1基因的Pro187Ser的部分核苷酸碱基序列；
图10是本发明一实施例提供的PCR产物序列测定结果中针对VKORC1 基因突变位点rs9923231-1369G>A的部分核苷酸碱基序列；
图11是本发明一实施例提供的PCR产物序列测定结果中针对VKORC1 基因Arg98Trp的部分核苷酸碱基序列。
具体实施方式
非特殊说明，本发明实施所采用的试剂均为市售商品，本发明实施所采用的数据库均为公开的在线数据库。以下实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
维生素K一旦被机体利用，它会变得无活性，必须重新激活，才能发挥其生物作用。这种维生素K回收过程被称为维生素K循环。维生素K的基本作用是Gla蛋白(凝血因子、骨钙素等)形成的必要辅助因子，维生素K 循环辅助Gla蛋白的形成。
造成维生素K缺乏的原因有以下点：①肠道菌群异常；②维生素K摄入过少；③维生素K吸收异常；④维生素K循环异常。因此，通过确定机体中的维生素K的含量，不仅可以了解食物中的维生素K对人体吸收与代谢的影响，还可以了解各类食物中维生素K对不同人体基因敏感的差异。
血浆维生素K水平与APOE基因型的关系为：APOE2>APOE3>APOE4，证实维生素K的水平受不同APOE基因型的调节。由于APOE4与受体结合能力相对较强，其结果是血浆乳糜微粒CM和极低密度脂蛋白VLDL代谢速率加快。具有高度亲脂性的维生素K存在于CM中，并与CM以相同的速率被清除，从而加速维生素K代谢，进而影响骨钙素的羧化，未羧化的骨钙素浓度增加，钙盐沉积及骨矿化障碍，从而使得成骨作用减弱、骨密度及骨强度随之降低。然而CM最终被肝脏代谢，用于治疗凝血异常的APOE4(E3/4+ E4/4)机体中维生素K的生物利用度高。
CYP4F2编码的蛋白具有氧化水解维生素K的功能，通过羟基化维生素 K苯基侧链导致维生素K循环中还原型维生素K水平下降。rs3093168(T>C)、 rs2108622(G>A)突变后，导致酶活性降低，凝血因子合成障碍。
谷氨酰基羧化酶由GGCX基因编码，是VK羟化依赖酶。抗凝因子II，VII，IX，X和蛋白C，S和Z等维生素K依赖蛋白只有经过GGCX的催化羟基化后才可以发挥抗凝作用。Val255Met、Phe299Ser、Ser300Phe、Gln374Ter、 Leu394Arg、Arg476His\Cys、Arg485Pro、Trp493Ser、Trp501Ser、Gly537Tyr、 Gly558Arg、INV2-1G>T发生突变后，谷氨酰基羧化酶羟基化维生素K依赖蛋白的能力下降，导致维生素K凝血因子缺乏症1型(VKCFD1)病或假黄瘤弹性样病变，服用VK，凝血因子水平部分恢复正常。
NPC1L1蛋白是一种胆固醇转运蛋白，在肠道VK吸收中起重要作用， Leu216Ala突变后摄取降低，导致机体缺乏VK。
NQO1基因编码醌氧化还原酶，又称为DT-硫辛酰胺脱氢酶 (DT-diaphorase)，由NADH或NAD(P)H提供电子催化醌类化合物，使各种醌类化合物还原为氢醌类化合物。把维生素K的醌(VK)形式转化成维生素K对苯二酚(VKH2)。Pro187Ser突变会导致酶活性下降，野生型酶活性正常，杂合性低到中等酶活性，突变型酶失活，从而干扰VK的循环。
维生素k2,3-环氧化物还原酶复合物亚单位1(VKORC1)是维生素K循环中必不可少的酶。VKORC1催化维生素k2,3-环氧化物(VK0)还原为维生素K的醌(VK)形式，进而还原为维生素K对苯二酚(VKH2)。VKORC1 酶活性不足导致维生素k依赖凝血因子缺乏，导致出血病。这种表型被称为维生素K凝血因子缺乏症2型(VKCFD2)。Arg98Trp纯合形式，目前发现的唯一与VKCFD2有关的突变。VKORC1-1639G＞A基因多态性与维生素K的急性促凝效果明显相关，G等位基因携带者体内国际标准化比率INR值降低更迅速。
因此，需要提供一种用于检测上述基因的突变情况的引物组。具体包括：
实施例1：设计并合成引物组
步骤1.1：基于APOE基因、CYP4F2基因、GGCX基因、NPC1L1基因、 NQO1基因和VKORC1基因设计特异性扩增的上下游引物及相应测序引物。
对于设计的引物，采用Primer Quest和Primer Premier 5.0对引物进行设计及二聚体、茎环错配分析，在包含待测位点的两端设计引物，10对引物的退火温度基本保持一致。
本实施例所提供的引物组覆盖了APOE基因、CYP4F2基因、GGCX基因、NPC1L1基因、NQO1基因和VKORC1基因的所有热点基因突变。由于小的序列变化会导致引物扩增效率显著降低、特异性变差，故分别针对不同位点/外显子分别设计多重PCR引物组，并在经过预实验筛选后，综合产物片段长度和位点/外显子包含情况，选取了如下述表2所示的扩增效果最佳的引物组。
表2
步骤1.2：合成步骤1.1中设计好的引物组。
实施例2：从待测样本中提取DNA
步骤2.1：用口腔拭子收集口腔脱落细胞或用采血管收集新鲜外周血样本。
步骤2.2：采用天根口腔拭子基因组DNA提取试剂盒(DP322)，或，采用血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒(DP304)，从样本中提取DNA，并采用NP80-touch(德国IMPLEN)测定DNA的浓度及纯度，保存测试结果在预设范围内的DNA。
实施例3：利用步骤1.2合成的引物组和步骤2.2中的保存的DNA配制 PCR反应体系
步骤3.1：以步骤2.2中所保存的基因组DNA为扩增模板，并采用步骤 1.2中合成的引物组，配制多重PCR反应体系。
本实施例采用东洋纺(TOYOBO)公司KOD FX酶系(货号：KFX-101) 中DNA聚合酶及缓冲液为基本原料，在酶系说明书中扩增体系的基础上，通过调整引物浓度、dNTP浓度、缓冲液浓度、酶用量，来配制多重PCR扩增体系，这一反应体系的具体组成如下述表3所示。
表3
试剂成分
体积
2×PCR buffer for FX
25μl
2mM dNTP
12.5μl
Primer Mix
8.25μl
KOD FX(1U/μl)
1.25μl
DNA
2μl
超纯水
1μl
需要说明的是，反应体系等比例放大/缩小均在本发明实施例的保护范围内；更换其他DNA聚合酶系，经过适当比例调整也可以达到扩增目的。
步骤3.2：按照下述表4所示的多重PCR反应条件，设置PCR仪器的程序，并对步骤3.1中配制的多重PCR反应体系，进行多重PCR扩增反应，得到PCR产物。
表4
表4中还示出了扩增后的PCR产物可在4℃条件下保存待用。
实施例4：电泳检测
步骤4.1：琼脂糖凝胶电泳检测步骤3.2中得到的PCR产物，获得PCR 产物片段的大小。
检测结果如图1所示，其中，图1中所示出的FW、JYX、LS、PH、SLP、 ZFY、ZHF用于表征不同的待测样本，图1的最左侧列展示了用于表征片段长度的标尺条，图1的最右侧列展示了空白对照组的PCR产物的电泳结果。
请参考图1，根据各个产物亮带所在位置与左侧标尺条的对比，可以识别出各个产物亮带所对应的是哪一外显子的扩增产物。比如，自上向下的10 条亮带，通常是分别对应于GGCX-3、NQO1、CYP4F2-2、NPC1L1、CYP4F2-1、 APOE、VKORC1-1、GGCX-2、VKORC1-2、GGCX-1基因片段的PCR扩增产物。
根据空白组的电泳结果可知，环境因素对待测样本的电泳检测结果无不良影响。根据各个待测样本的电泳结果可知，存在的10个亮带分别对应于 GGCX-3、NQO1、CYP4F2-2、NPC1L1、CYP4F2-1、APOE、VKORC1-1、GGCX-2、 VKORC1-2、GGCX-1基因片段的PCR扩增产物，亮带数量与理论保持一致；10个亮带清晰且间隔明显，不同亮带间无重叠、无拖影等，亮带效果良好。如此，可以说明利用步骤1.1中设计的PCR扩增引物组进行PCR扩增时，仅生成了预期的目标产物，而未生成其他无关产物，引物组设计合理。
步骤4.2：验证PCR产物片段的大小正确后，可针对PCR产物进行序列测定。
实施例5：序列测定
步骤5.1：步骤4.2中验证PCR产物片段的大小正确后，将步骤3.2中得到的PCR产物进行序列测定，得到.ab1格式的测序结果。
步骤5.2：通过Chromas序列分析软件分析步骤5.1中得到的测序结果，获得GGCX-3、NQO1、CYP4F2-2、NPC1L1、CYP4F2-1、APOE、VKORC1-1、 GGCX-2、VKORC1-2、GGCX-1基因的突变情况。
部分测序结果如图2至11所示。
图2示出了APOE基因突变位点c.388T>C处及其上下游的核苷酸碱基序列。请参考图3中的框线部分，可知第388位处的位点为C，而不是T，即在该位点处发生基因突变。
图3示出了APOE基因突变位点c.526C>T处及其上下游的核苷酸碱基序列。请参考图4中的框线部分，可知第526位处的位点为T，而不是C，即在该位点处发生基因突变。
图4示出了CYP4F2基因突变位点rs3093168T>C处及其上下游的核苷酸碱基序列。请参考图5中的框线部分，可知rs3093168T>C位点为C，而不是T，即在该位点处发生基因突变。
图5示出了CYP4F2基因突变位点rs2108622G>A处及其上下游的核苷酸碱基序列。请参考图6中的框线部分，可知rs2108622G>A位点为A，而不是G，即在该位点处发生基因突变。
图6示出了GGCX基因突变位点INV2-1G>T处及其上下游的核苷酸碱基序列。请参考图7中的框线部分，可知INV2-1G>T位点为G，而不是T，即在该位点处未发生基因突变。
图7示出了GGCX基因Val255Met野生纯合体测序峰局部图。请参考图 8中的框线部分，可知第255位处的氨基酸为Val(GTG)，而不是Met(ATG)，即在该氨基酸处未发生基因突变。
图8示出了NPC1L1基因Leu216Ala野生纯合体测序峰局部图。请参考图9中的框线部分，可知第216位处的氨基酸为Leu(CTG)，而不是Ala (GCN)，即在该氨基酸处未发生基因突变。
图9示出了NQO1基因Pro187Ser突变杂合体测序峰局部图。请参考图 10中的框线部分，可知第187位处的氨基酸为Ser(TCT)，而不是Pro(CCT)，即在该氨基酸处发生基因突变。
图10示出了VKORC1基因突变位点rs9923231-1369G>A处及其上下游的核苷酸碱基序列。请参考图11中的框线部分，可知rs9923231-1369G>A 位点为A，而不是G，即在该位点处发生基因突变。
图11示出了VKORC1基因Arg98Trp野生纯合体测序峰局部图。请参考图11中的框线部分，可知第98位处的氨基酸为Arg(CGG)，而不是Trp (TGG)，即在该氨基酸处未发生基因突变。
图1至图11中缺失的图形不影响本方案的技术内容。
需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个〃····〃”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同因素。
最后需要说明的是：以上所述仅为本发明的较佳实施例，仅用于说明本发明的技术方案，并非用于限定本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内所做的任何修改、等同替换、改进等，均包含在本发明的保护范围内。
- 上一篇：一种医用注射器针头装配设备
- 下一篇：PNA在检测DNA裂解片段中的应用