Pna在检测dna裂解片段中的应用
阅读说明：本技术 Pna在检测dna裂解片段中的应用 (Application of PNA in detection of DNA cleavage fragments ) 是由 叶盛 李思慧 朱晓玲 徐涛 梁兴国 方志俊 申志发 小宫山真 于 2020-08-28 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种PNA在检测DNA裂解片段中的应用,以及相应的检测DNA裂解片段的方法和引物组。本发明通过基于修饰的PNA钳制PCR,来选择性扩增裂解后的DNA,而未被裂解的模板DNA则被PNA抑制,根据PCR结果即可定性或定量的分析酶促反应,可应用于监测酶活性、检测循环肿瘤DNA和循环胎儿DNA等。(The invention discloses application of PNA in detection of DNA cleavage fragments, and a corresponding method and a corresponding primer group for detecting the DNA cleavage fragments. The invention selectively amplifies the cracked DNA by clamping PCR based on the modified PNA, but the uncleaved template DNA is inhibited by the PNA, and the enzymatic reaction can be qualitatively or quantitatively analyzed according to the PCR result, and the invention can be applied to monitoring the enzymatic activity, detecting the circulating tumor DNA, circulating fetal DNA and the like.)
技术领域
本发明属于核酸检测领域，更具体的涉及PNA在检测DNA裂解片段中的应用，以及相应的检测方法。
背景技术
酶(天然和人工酶)是生物化学和生物技术中最有价值的工具之一。目前，在3600种已知的限制性内切酶中，有300多种酶具有250多种不同的特异性，它们被用于实验室、医院和工业中，以裂解各种DNA底物用于不同目的。而且寻找新的酶仍然是问题之一。限制酶的普遍用途之一是双链DNA的位点选择性切割，以得到有用的片段。然而，分析酶促反应的效率并不容易，特别是当存在大量背景DNA，DNA底物的浓度非常低时，裂解后的DNA被背景DNA所干扰，非常难检测。
肽核酸(PNA)是具有类多肽骨架的DNA类似物，PNA的主链骨架是由N(2-氨基乙基)-甘氨酸与核酸碱基通过亚甲基羰基连接而成的。PNA可以特异性地与DNA或RNA杂交，形成稳定的复合体。PNA有3个特点：1、PNA与DNA的结合能力胜于DNA与DNA的结合能力；2、DNA/PNA双链比DNA/DNA双链的稳定性高；3、PNA易于识别单碱基错配的DNA或RNA结合。由于匹配的PNA对靶位点具有更高的亲和力，因此相对引物的结合更具优势。由于Taq聚合酶无法扩展PNA，因此这种结合的作用使扩增反应受到损害，这就是PCR钳制。当存在突变序列时，PCR引物的结合将超过PNA结合，从而产生扩增子。因此，PNA-PCR主要用于点突变的基因检测，它能与未突变的基因结合，阻止引物与未突变的基因结合，与突变的基因则不能结合，而引物可与突变的基因结合，从而使突变基因扩增。PCR钳制也可以通过干扰引物的延伸来进行，其中PNA位于距PCR引物一定距离或与PCR引物之一相邻的位置。但是，这种PCR钳制不能用于检测裂解后的DNA。
发明内容
1、发明目的。
本发明的目的是提供PNA在检测DNA裂解片段中的应用，基于该应用，可将裂解后的DNA扩增，而未裂解的模板DNA则被抑制，从而能检测出裂解后的DNA。
2、本发明所采用的技术方案。
本发明公开了PNA在检测DNA裂解片段中的应用。
本发明公开了一种定性检测DNA裂解片段的方法，其步骤包括：
(1)设计引物组和PNA探针组序列，所述引物组和PNA探针组的核苷酸序列部分重叠，重叠部分包括待检测的DNA裂解片段的端部核酸序列；
(2)以待测样品为模板，加入引物组和PNA探针组进行PCR反应，然后电泳查看结果，能观察到核酸条带说明存在待检测的DNA裂解片段。
优选的，所述引物组的引物为单碱基错配引物，错配位点位于PNA探针和核酸扩增引物重叠序列的中间。
本发明还公开了一种实时检测DNA裂解片段的方法，其步骤包括：
(1)设计引物组、PNA探针组和TaqMan MGB探针序列，所述引物组和PNA探针组的核苷酸序列部分重叠，重叠部分包括待检测的DNA裂解片段的端部核酸序列；
(2)以待测样品为模板，加入引物组、PNA探针组、TaqMan MGB探针进行荧光定量PCR，标准曲线法进行定量分析，查看扩增结果。
优选的，所述引物组的引物为单碱基错配引物，错配位点位于PNA探针和核酸扩增引物重叠序列的中间。
本发明公开了一组用于定性检测SRY基因裂解片段的引物和PNA探针组合，包括：
SRY-PNA-F：H2N-AAAGCTGTAACTCTA-CONH2
SRY-PF1m：CTGTAAATCTAAGTATCAGTGTG
SRY-PNA-R：H2N-TCCCAGCTGCTTGCT-CONH2
SRY-PR1m：AGCTGCATGCTGATCTCTGAG。
本发明公开了一组用于实时检测SRY基因裂解片段的引物、PNA探针和TaqMan探针组合，包括：
SRY-PNA-F：H2N-AAAGCTGTAACTCTA-CONH2
SRY-PF1m：CTGTAAATCTAAGTATCAGTGTG
SRY-PNA-R：H2N-TCCCAGCTGCTTGCT-CONH2
SRY-PR1m：AGCTGCATGCTGATCTCTGAG
TaqMan-MGB-SRY：AAGCGACCCATGAA。
本发明公开了一组用于定性检测Maspin基因裂解片段的引物和PNA探针组合，包括：
Maspin-PNA-F：H2N-CCAACGTGTCTGAGA-Lys-CONH2
Maspin-PF1m：GTGTCAGAGAAATTTGTAGTGTTAC
Maspin-PNA-R：H2N-CATACGTACAGACAT-Lys-CONH2
Maspin-PR1m：GTACAAACATGCGTACGGC。
本发明公开了一组用于实时检测Maspin基因裂解片段的引物、PNA探针和TaqMan探针组合，包括：
Maspin-PNA-F：H2N-CCAACGTGTCTGAGA-Lys-CONH2
Maspin-PF1m：GTGTCAGAGAAATTTGTAGTGTTAC
Maspin-PNA-R：H2N-CATACGTACAGACAT-Lys-CONH2
Maspin-PR1m：GTACAAACATGCGTACGGC
TaqMan-MGB-Maspin：CGAATATTTCACCTTCC。
3、本发明所产生的技术效果。
(1)本发明通过基于修饰的PNA钳制PCR，来选择性扩增裂解后的DNA，而未被裂解的模板DNA则被PNA抑制，根据PCR结果即可定性或定量的分析酶促反应。可应用于监测酶活、循环肿瘤DNA和循环胎儿DNA等。
附图说明
图1为实施例1中在TaqMan-MGB-SRY探针存在下，酶促消化物的实时PCR扩增。曲线1-4中使用的样品(左侧为1ng未消化的DNA；右侧为1ng消化的DNA)与图2中泳道1-4中使用的样品相对应。曲线1，酶切的DNA；曲线2，酶切的DNA+PNA；曲线3，未酶切的DNA；曲线4，未酶切的DNA+PNA。
图2为实施例1中在不存在(一)或存在(+)PNA(SRY-PNA-F和SRY-PNA-R)的情况下，PGR扩增的琼脂糖凝胶电泳分析。泳道1，酶切的DNA；泳道2，酶切的DNA+PNA；泳道3，未酶切的DNA；泳道4，未酶切的DNA+PNA。
图3为实施例2中在TaqMan-MGB-Maspin探针存在下，酶促消化物的实时PCR扩增。从荧光信号最先出现开始从左到右的曲线：未酶切的DNA，酶切的DNA，酶切的DNA+PNA，未酶切的DNA+PNA。
图4为实施例2中在不存在(--)或存在(+)PNA的情况下，HpyCH4酶对酶消化物进行PCR扩增的电泳分析。NTC，非模板对照；泳道1，母体DNA；泳道2，母体DNA+PNA；泳道3，胎盘DNA；泳道4，胎盘DNA+PNA。
图5为实施例3中在存在PNA(Maspin-PNA-F和Maspin-PNA-R)的情况下，酶切酶的PCR扩增的测定灵敏度。从左曲线到右曲线的酶切的DNA百分比：100％，10％，5％，1％，0％。
图6为基于PNA的实时PCR分析各种浓度的HpyCH4的酶促消化。反应中的酶浓度(从左到右的曲线)：0单位(无PNA)，0.5单位，0.2单位，0.1单位，0.05单位和0单位。反应条件：37℃，10分钟。
图7为酶反应时间过程的基于PNA的实时PCR分析。从左到右的曲线：DNA消化时间分别为8小时(100％消化的DNA)，2小时，1小时，30分钟，10分钟和5分钟。
附图中曲线的从左到右的确认均为从荧光信号最先出现开始从左到右。
具体实施方式
应该指出，以下具体说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有说明，本文所使用的所有科学和技术术语具有与本发明所属技术领域人员通常理解的相同含义。
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但所举实施例不作为对本发明的限定。实施例中未注明具体条件的实验方法及未说明配方的试剂均为按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：试验手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件或者制造商建议的条件进行或配置。
实施例1
1、引物的设计和合成
表1、本发明中使用的引物，TaqMan MGB探针和PNA。
引物中带下划线的序列与相应的PNA中的下划线序列相同，只是在SRY和Maspin基因的引物的第6个或第7个碱基处有一个单碱基取代。不匹配的位置以粗斜体表示。在划线的序列(即重叠序列)前进行酶切。
2、样品收集和DNA制备
招募曾在香港威尔斯亲王医院妇产科就诊的孕妇。分别在剖腹产之前和之后收集孕妇外周血样品(12ml EDTA)和胎盘样品。
将血样在4℃下以1600μg离心10分钟，然后将血浆部分以16,000μg离心10分钟。将外周血细胞部分重新离心至5,000μg，并除去任何残留的血浆。使用Nucleon血液DNA提取试剂盒(GE Healthcare，Little Chalfont，英国)从外周血细胞中提取DNA，并使用QIAamp组织试剂盒(Qiagen，Hilden，德国)从胎盘组织中提取DNA。根据制造商的血液和体液方案，使用QlAamp血液试剂盒(Qiagen)从0.8ml血浆中提取DNA。
3、酶促反应
限制性核酸酶(Alu1)的酶促反应在NEB缓冲液2上进行。将DNA与限制性核酸酶的反应混合物在37℃下孵育预定时间，然后迅速加热至65℃20分钟以终止酶反应。
4、实时PCR
使用TaqMan探针的实时PCR分析是在ABI PRISM 7300仪器(Applied Biosystems)上进行的。用于SRY基因的TaqMan MGB探针(Applied Biosystems)在5′末端标记有报告染料6-FAM(羧基荧光素)，在3′末端标记有小沟结合剂(MGB)。用于本发明的引物列于表1。引物购自Sigma-Proligo(Singapore)和Molecular Informatrix Laboratory(Korea)。使用TaqMan Universal PCR Mastermix(Applied Biosystems)以50μL反应体积扩增提取的DNA。所有探针的使用浓度均为50nmol/L，引物浓度为250nmol/L。PCR循环条件下，每25μLPCR反应中需要使用50ng DNA模板：95℃5分钟；30个循环，分别是95℃30秒，55℃30秒和72℃1分钟；72℃7分钟。每个样品至少重复分析两次。根据制造商的指导，使用序列检测软件2.1版(Applied Biosystems)对结果进行了分析。荧光定量PCR结果如图1所示。
5、凝胶电泳
PCR反应后，将2-5μL的混合物进行2％琼脂糖凝胶电泳，并使用GDS-8000Bioimaging系统进行分析。结果如图2所示。从图2中可以看出，泳道1和2中的DNA被Alu 1完全消化，得到了短片段。泳道3和泳道4中的DNA保持完整，没有被Alu 1酶消化。
结果分析：PCR扩增的基于凝胶的检测结果将PNA对PCR扩增的作用可视化。如图2所示，在不存在PNA的情况下，在指定条件下有效地扩增了酶切的和未酶切的模板(泳道1和3)。然而，在存在PNA的情况下，未酶切的DNA的PCR扩增被完全阻断，而酶切的DNA被选择性地扩增。
实时扩增检测是更优选的方案，因为具有高灵敏度，测定既定量又均匀。如图1所示，对于基于PNA的实时测定，PNA充分阻断了未酶切的DNA的扩增：在PNA存在下，未检测到荧光信号(曲线4)。酶切的DNA的PCR扩增不受PNA的影响。
实施例2
本实施例与实施例1基本一致，采用HpyCH4酶消化Maspin基因，结果如图3和图4所示。酶促反应：在37℃下，用1单位的HpyCH4消化20μL体积的pH 8.0 NEB缓冲液1中的100ngDNA 2小时。PCR循环条件：95℃30s，56℃30s和72℃30s；32个周期。
图1-4的结果证实，使用PNA可以完全抑制未酶切DNA的PCR扩增，并且不影响酶切的DNA片段的扩增。为了进一步评估PNA的作用，使用Ct(不存在PNA和存在PNA之间的Ct差异)来描述PCR抑制作用。Ct越大，PCR抑制的效率越高。Ct在Alu 1系统中为8，在HpyCH4系统中为15，这表明在PCR期间，只有很小痕量的未酶切DNA可以逃脱PNA的抑制。
实施例3
将未被HpyCH4酶切的DNA和被HpyCH4酶切的DNA以100％到1％的酶切DNA比例混合，来测试PNA介导的PCR检测低水平酶解的敏感性。结果如图5所示。
图5的结果表明，未酶切的DNA的扩增通过添加PNA被完全阻断(曲线5)，而酶切的DNA被选择性地扩增(曲线1-4)。混合实验表明，可以检测到混合物中低至1％的已酶切DNA。此外，通过计算未酶切的DNA的扩增的Ct，还可以检测到少至0.01％的酶切DNA。
实施例4
在用各种浓度的酶消化DNA之后，进行PCR，结果如图6所示。
酶切的时程分析PCR，结果如图7所示。
图6和图7的结果表明，随着酶浓度的增加和反应时间的延长，直至酶切完成，酶反应中裂解的DNA的浓度逐渐增加。这表明可以定量检测酶消化，并且可以利用该方法来监测酶消化直至100％的裂解度。
- 上一篇：一种医用注射器针头装配设备
- 下一篇：一种检测MCR基因的试剂盒、检测方法及其应用