具体实施方式

下面结合附图对本发明做进一步说明。

NU9序列:TCTCGTGATGAAAACTCTGTCCAGT(SEQ ID NO.1)

NU13序列:TGGAGGTGATGAACTGTCTGAGCCTGACCTT(SEQ ID NO.2)

ND5序列:ATGTTGGATCAGGACATCCCAATGGTGCAGC(SEQ ID NO.3)

ND7序列:ATGTTGGATCAGGACATCCCAATGGTGCAGCC(SEQ ID NO.4)

ND9序列:TTGGATCAGGACATCCCAATGGTGCAGCC(SEQ ID NO.5)

1标本与材料

1.1主要试剂及仪器CO2孵箱(美国Thermo公司)、恒温水浴箱(上海医疗器械厂)细胞培皿(美国Hyclone公司)、移液器(德国Eppendorf公司)、超速离心机(美国Thermo公司)荧光显微镜(日本Nikon公司)、胎牛血清(美国Hyclone公司)、F-12培养基(美国Gibico公司)、嘌呤霉素(美国Sigma公司)、Trizol(美国Thermo公司)、miRNA逆转录第一链试剂盒(中国天根TIANGEN公司)、miRNA荧光定量PCR试剂盒(中国天根TIANGEN公司)、mRNA逆转录第一链试剂盒(日本Takara公司)、mRNA荧光定量PCR试剂盒(德国Qiagen公司)

1.2细胞课题组前期将携带Piwil2-GFP标记的慢病毒以及空载目的基因的GFP标记的慢病毒分别转染原代培养的小儿包皮成纤维细胞(FB)，经细胞行为学及体外细胞染色体核型分析证实成功构建Piwil2诱导的肿瘤干细胞，并长期储存于液氮中。

1.3临床标本收集重庆医科大学附属儿童医院泌尿外科2015年6月至2019年6月入院肾母细胞瘤患者的手术标本，均为首次行肿瘤切除术并经病理科2位医师证实为肾母细胞瘤组织。标本来自34例儿童，男15例，女19例，平均年龄29.9(4.0～104.0·)个月，依照美国国家肾母细胞瘤研究组(NWTS-5)标准，组织分化良好型(FH)27例，分化不良型(uFH)7例，分期I期7例，II期9例，Ⅲ期11例，Ⅳ期1例，Ⅴ期6例。每位患者皆取其肿瘤组织作为肿瘤组，并取其癌旁组织距离肿瘤≥3cm正常肾脏组织作为对照组织，Ⅴ期双侧肿瘤则取肿瘤同侧的正常肾脏组织。

2实验方法

2.1细胞培养将Piwil2-FB、GFP-FB细胞从-80℃冰箱中取出，快速在37℃水浴箱中复温，将细胞悬液移至10mlEP管中，加入2mlF12培养基后离心清洗后分别培养于10％胎牛血清的F12培养基(10cm的培养皿)，在37℃、5％CO2培养箱中培养，细胞每隔48小时进行换液，待细胞生长至80％融合度以上时使用trizol消化进行总RNA提取。

2.2总RNA提取、逆转录及qPCR trizol法提取细胞及组织的总RNA，将10cm培养皿中细胞用1ml trizol消化10min后吸入1.5ml去酶EP管中(组织加100μg/ml trizol后电动匀浆器充分匀浆1-2分钟)，加入200μl氯仿震荡混匀后室温放置15分钟，4℃12000g离心15分钟，吸取上清加入500μl异丙醇混匀室温静置10分钟后4℃12000g离心10分钟，弃上清，加入1ml 75％乙醇温和震荡，4℃8000g离心5分钟弃上清，真空干燥5-10分钟后加入50μlDEPC水溶解。进行NanoDrop ND-1000分光光度仪和琼脂糖凝胶电泳进行质量检验，满足标准A260/A280在1.8～2.0之间且电泳可见28s、18s两条亮带。使用miRNA逆转录试剂盒(天根TIANGEN)以及mRNA逆转录试剂盒(Takara)将总RNA逆转录为cDNA。qPCR引物设计来自上海生工(表1)，qPCR实验步骤参见miRNA荧光定量试剂盒(天根TIANGEN)和mRNA荧光定量试剂盒(Qiagen)。

表1

2.3二代测序及靶基因预测送检2组样本(Piwil2-FB、GFP-FB)于上海惠研生物进行二代测序。通过illumina Hiseq2000测序平台的单端50bp测序模式对模式物种人类的样本进行高通量测序，Piwil2-FB(Piwil2通过慢病毒转染FB而成的肿瘤干细胞)作为实验组、GFP-FB(空载GFP标记慢病毒转染的FB)作为对照组。原始数据经过引物与adaptor序列去除并经过对测序片段3’端的质量检验，同时选择质量可靠长度范围24-30nt的片段用于预测piRNA。piRNA的预测采用k-mer统计方法建立数学模型用以识别区分具有piRNA特征和非piRNA序列特征的序列，经过机器训练学习算法建立piRNA序列特征分类器，并以此用于预测piRNA。差异基因的筛选标准为P≤0.05且|logFC|≥1，并通过Miranda算法对这些差异基因进行靶基因预测，并且对这些靶基因进行功能分析。

3统计学分析

采用SPSS及Graphpad进行统计分析和作图，非正态分布的数据描述采用中位数(四分位数区间)表示，通过wilcoxcon检验比较配对样本中目标基因的表达差异，Mann-whitney检验比较目标基因在不同年龄、性别、分期和分型的肿瘤组织中的差异。以P<0.05为差异有统计学意义。

4结果

4.1 Piwll2-iCSC中piRNA表达谱及差异piRNA：从Piwll2-iCSC中筛选出的显著差异piRNA个数为230条，对比The piRNA database数据库，其中180条已发现且报道过的基因(46条在人类基因中有过报道，134条在非人生物中有过报道)，50条未有报道的新piRNA(上调未知用NU表示，下调未知用ND表示)。其中106条表达量在肿瘤干细胞中显著上调(其中22条未知)，124条表达量显著下调(其中28条未知)。

4.2 piRNA靶基因预测及富集分析：通过miRanda算法对230个差异表达基因进行靶基因预测，共61个piRNA预测出靶基因，预测出的靶基因共43条。对这43个靶基因进行GO分析(P≤0.05)，发现其参与的生物学过程主要为调节细胞钙离子浓度，分子功能主要为参与ATP酶的活动及多聚A尾RNA结合(图2)。通过String数据库对其进行蛋白互作网络分析(互作分数≥0.15)，其中肌球蛋白IXA有8个相互作用蛋白，成蛋白2有7个互作蛋白，蛋白酪氨酸磷酸酶D型受体(PTPRD)有6个互作蛋白，NOP56核糖核蛋白(NOP56)有4个互作蛋白，40S核糖体蛋白S8(RPS8)有3个互作蛋白，相互作用综合分数最高的组合是NOP56和RPS8(0.994)。靶基因MT-RNR2样蛋白1(MTRNR2L1)虽然没有在蛋白互作网络中，但是在差异表达量前十的下调未知piRNA中有3个piRNA靶向它(图3)。4.3极差piRNA及其靶基因在34例肾母细胞瘤患者组织中的表达：选择piRNA NU13(未知的上调差异piRNA第13位)及其靶向基因NOP56，piRNA NU9(未知的上调差异piRNA第9位)及其靶向基因RPS8，piRNA ND5、ND7、ND9(未知的上调差异piRNA第5、第7、第9位)及其靶向基因MTRNR2L1在34例肾母细胞瘤患者组织中进行qPCR检测。结果显示，在肿瘤组织中，NU13表达量显著下调(P<0.01)，其靶向基因NOP56表达无显著差异(P＝0.58)；NU9表达量显著下调(P<0.01)，其靶向基因RPS8的表达无显著差异(P＝0.29)；而ND5、ND7、ND9及其靶基因MTRNR2L1的表达量均显著下调(P<0.01)(图3)。其中NOP56与RPS8在肿瘤组织的表达量与年龄性别有关，其余基因与肾母细胞瘤NWTS分期、年龄以及性别并无相关性(P＞0.05)(表2，3)。

表2 piRNA NU9,NU13,ND5，ND7，ND9在34例肾母细胞瘤患者组织中的表达情况与临床病理参数的关系

表3靶基因MTRNR2L1,NOP56,RPS8在34例肾母细胞瘤患者组织中的表达情况与临床病理参数的关系

可见piRNA NU9,NU13，ND5，ND7，ND9在肾母细胞瘤组织与正常组织间的表达差异巨大，因此以上piRNA可以作为胚胎性恶性肿瘤的诊断新靶点。

序列表

<110> 何大维

<120> 一种piRNA ND9作为检测靶点的儿童胚胎性恶性肿瘤诊断试剂

<140> 2020102021262

<141> 2020-03-20

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 25

<212> DNA

<213> 人类(Homo sapiens)

<400> 1

tctcgtgatg aaaactctgt ccagt 25

<210> 2

<211> 31

<212> DNA

<213> 人类(Homo sapiens)

<400> 2

tggaggtgat gaactgtctg agcctgacct t 31

<210> 3

<211> 31

<212> DNA

<213> 人类(Homo sapiens)

<400> 3

atgttggatc aggacatccc aatggtgcag c 31

<210> 4

<211> 32

<212> DNA

<213> 人类(Homo sapiens)

<400> 4

atgttggatc aggacatccc aatggtgcag cc 32

<210> 5

<211> 29

<212> DNA

<213> 人类(Homo sapiens)

<400> 5

ttggatcagg acatcccaat ggtgcagcc 29