具体实施方式

NAAT，尤其是实时PCR、多重PCR和更近的等温扩增方法，已经在大程度上取代了用于检测细菌和病毒的常规方法，因为这些分子测试检测30％至50％更多的阳性。向等温扩增测试的移动允许POC诊断测试的发展，这应当改善在临床环境(例如急诊室和门诊)以及非临床环境(例如家庭或户外)中的感染的检测和诊断。

等温扩增

已经开发了需要多个步骤和多于单一温度的各种各样扩增技术。转录介导的扩增(TMA)采用具有核糖核酸酶活性的反转录酶、RNA聚合酶和具有在5’末端处的启动子序列的引物。反转录酶从引物合成cDNA，降解RNA靶标，并在反引物结合之后合成第二链。然后RNA聚合酶结合至dsDNA的启动子区域并转录新的RNA转录物，其可用作进一步反转录的模板。该反应迅速并可在20-30分钟内产生10E9个拷贝。这种系统不像其他DNA扩增技术那样强大。这种扩增技术与自主序列复制(Self-Sustained Sequence Replication，3SR)和基于核酸序列的扩增(Nucleic Acid Sequence Based Amplification，NASBA)非常相似，但所用的酶不同。单引物等温扩增(Single Primer Isothermal Amplification，SPIA)还涉及多种聚合酶和核糖核酸酶H。首先，反转录酶沿RNA靶标延伸嵌合引物。核糖核酸酶H降解RNA靶标并允许DNA聚合酶合成cDNA的第二链。然后核糖核酸酶H降解一部分的嵌合引物以释放一部分的cDNA并打开结合位点用于下一个嵌合引物来结合，扩增过程再次经过该循环进行。该线性扩增系统可以在大约3.5小时内扩增非常低水平的RNA靶标。Q-β复制酶方法是探针扩增方法。与选择的靶标互补或基本上互补的探针区域内被插入MDV-1RNA(Q-Β复制酶的天然存在的模板)内。Q-β复制MDV-1质粒使得合成产物本身就是Q-β复制酶的模板，从而导致指数扩增，只要对于模板有过量的复制酶。由于Q-β复制方法是如此灵敏且无论是否存在靶标都可以扩增，因此需要多个洗涤步骤来清除非特异性结合的复制质粒的样品。该指数扩增大约花费30分钟；然而包括所有洗涤步骤的总时间约为4小时。

已经开发了多种等温扩增技术来规避对温度循环的需求。Walker等在1992年开发了链置换扩增(SDA)。这种扩增方法使用两组引物，链置换聚合酶和限制性核酸内切酶。缓冲引物用于置换最初延伸的引物以产生单链用于下一个引物来结合。限制性位点存在于该引物的5’区域内。硫醇修饰的核苷酸被引入合成产物中以抑制合成链的切割。这种修饰在链的引物侧形成切口位点，聚合酶可以延伸其。这种方法需要对双链靶标进行初始热变性步骤。然后在低于双链靶区域的熔解温度的温度下运行该反应。通常使用这种方法在30-45分钟内扩增长度为60至100个碱基的产物。

SDA是描述的第一种等温扩增方法，涉及用限制性核酸内切酶在未修饰的链中的识别位点处产生切口，然后用链置换聚合酶在3’末端处延伸该切口，这置换了下游链。然后，置换的链可以充当反义反应的靶标，从而最终导致DNA的指数扩增。从其开发以来，已经使用诸如超支化等方法对其进行改进，并将其应用于基因变异的全基因组分析。

滚环复制首先被表征为病毒环状基因组经过其进行复制的机制。随后，它已被用作指数DNA扩增工具(DNA的100倍扩增)和快速信号扩增工具(100倍的信号扩增)两者。在这种方法中，小片环状DNA被靶标引发，在此之后，链置换聚合酶在该环状DNA周围继续进行，从而置换互补链。最终，随着生成更多的DNA，合成的DNA保持附着于该环，从而在90分钟内生成10⁹个或更多个拷贝的该环。RCA已被应用于检测人基因组DNA中的点突变。

重组酶聚合酶扩增(RPA)是更近期的等温DNA扩增技术之一，其涉及三种酶(即重组酶、单链DNA结合蛋白(SSB)和链置换聚合酶)的混合物。重组酶能够扫描引物并将引物靶向它们在双链靶DNA中的互补序列，在此时SSB结合该引物-靶杂交物并稳定该杂交物，从而允许链置换聚合酶启动DNA合成。使用这种方法，可以在10至20分钟内完成DNA扩增，显示高灵敏度和特异性。如通过靶向冠状病毒的反转录酶RPA(RT-RPA)测定所示，RNA扩增也是可能的。在最近的报告中，Wang等展示了在20分钟内以100个拷贝的检测水平检测猫疱疹病毒1(FHV-1)。这些报告支持RPA是用于快速检测DNA和RNA靶标的强大工具。

解旋酶依赖性扩增(HDA)是通过DNA聚合酶与许多辅助蛋白(包括解开双链DNA的DNA解旋酶)组合在体内复制DNA的方法。在HDA中，解旋酶包含于扩增混合物中，使得扩增不需要热循环。用于引物结合的单链DNA中间体是由解旋酶产生，这与需要热变性步骤的PCR相反。HDA已被应用于多种生物传感器用于检测多重病原体检测，并且有望用于一次性POC诊断设备，例如用于检测艰难梭菌(Clostridium difficile)。

LAMP是目前最广泛使用和最强大的用于扩增DNA或RNA序列的等温扩增技术之一，其是基于强链置换聚合酶与四至六种引物的组合。这些引物识别靶DNA中的多个特定区域，而引物中的两种形成环结构以促进后续轮次的扩增。通过这种方式，实现高效的等温扩增。由于LAMP反应非常强大，因此产生极大量的DNA；因此产生焦磷酸盐离子(扩增的副产物)，从而产生浑浊的沉淀物(焦磷酸镁)，其可用于确定是否已发生扩增。使用这种方法，可以在30至60分钟内将1至10个拷贝的DNA扩增至10⁹至10¹⁰个拷贝，显示了出色的灵敏度和特异性。然而由于引物二聚体的形成和非特异性产物的扩增，LAMP受害于不良的特异性。此外，可以建立具有快速诊断和单基因组拷贝灵敏度的多重LAMP测定(M-LAMP)，如已经针对甲型流感/H1、甲型流感/H3和乙型流感以及呼吸道合胞病毒(RSV)A和B所示。

与上文讨论的DNA扩增方法相反，SMART或RNA靶标扩增简单方法是基于三向连接(3WJ)结构形成后的信号扩增；实际的DNA或RNA靶标未被扩增。反应中包括两个寡核苷酸探针，其两者均具有DNA或DNA靶标的互补序列以及与另一个探针互补的较小区域。这两个探针当结合其靶标时接近，在此时形成3WJ。在形成3WJ之后，聚合酶可以延伸靶特异性寡核苷酸，从而形成双链T7启动子区域；这导致在靶DNA的存下恒定地产生RNA，其可以以实时方式检测。SMART已在临床上用于检测海洋和淡水环境中的海洋蓝藻DNA。

不利地影响扩增方法结果的因素有很多，包括见于临床样本中的聚合酶活性的抑制剂和其他组分，其由于引物或模板的二级结构而降低扩增效率，和由降低扩增效率和特异性，从而导致假阳性的引物二聚体形成而导致的模板非依赖性扩增。该负面影响在设置反应混合物之后、在反应混合物被移至扩增温度之前在室温下被放大，从而给实验室中大量样品的批处理带来特异性问题。这可以在准备大量反应用于单次运行时发生，导致反应在室温下暂停(holding)。这在处理高样品量且需要批处理以获得高通量结果的大型实验室中常见。因此，高通量经常在室温下受到设置的负面影响，并且分子诊断测试的关键要求(包括一致性、可重复性和准确性)可受到负面影响。已经使用核糖核酸酶H2引物，其包含在3’末端附近的单个核糖核苷酸并包含被封闭的硫代磷酸酯核苷酸。

为了进一步加速DNA检测测定，信号扩增方法变得越来越普遍。这涉及早期特异性序列检测步骤，之后是DNA生产的指数级联，其不再依赖于初始靶标存在。信号扩增的实例包括基于核酸序列的扩增(NASBA)、转录介导的扩增(TMA)和SMART。

这些和其他扩增方法在例如Van Ness.J等，PNAS 2003 100(8):4504-4509；Tan,E.等，Anal.Chem.2005,77:7984-7992；Lizard,P.等，Nature Biotech 1998,6:1197-1202(其全部内容通过引用并入本文)中讨论。

包含可被核糖核酸酶H切割的单个核糖核苷酸和封闭的3’末端的引物已被用于减少引物二聚体形成和减少非特异性扩增。核糖核酸酶H结合至RNA/DNA双链体，并从引物的末端开始在RNA碱基和封闭基团处切割。对于引物在核糖核酸酶H切割和激活之前先与靶序列杂交，从而形成dsDNA的要求消除了引物二聚体的形成并减少了非特异性扩增。使用这些封闭的可切割引物的核糖核酸酶H依赖性PCR或rhPCR已被用于检测单核苷酸多态性(SNP)。

合作引物

核酸序列的等温扩增需要在扩增早期的特异性结合指数DNA扩增以实现DNA检测的最大灵敏度。然而，尽管环介导的等温扩增(LAMP)具有良好的灵敏度和特异性，但其受到引物-二聚体形成的不利影响，这降低了灵敏度和特异性两者。引物二聚体形成可导致非特异性扩增产物，其降低PCR和LAMP两者的检测限。各种各样的热启动已被用于PCR，合作引物已被用于PCR，核糖核酸酶H可切割引物和SSB蛋白已被用于减少PCR和LAMP两者中的非特异性扩增产物。

包含通过聚乙二醇接头连接并与待扩增的靶基因互补的两个核苷酸序列的合作引物可被用于PCR以防止引物二聚体形成并减少非特异性扩增产物的量。包含探针序列的合作引物也可被用于在扩增之后产生更高的荧光信号。

图1是用于扩增核酸分子的靶多核苷酸区域的示例性靶特异性合作引物(CCP)的示意图。在该实例中，显示了正向CCP。反向CCP具有与正向CCP相似的结构和序列区域。

在一些实施方式中，合作引物包含连接至5’至3’内部引物序列的3’至5’缓冲序列(F3、B3)。缓冲序列的5’末端连接至内部引物序列的5’末端，使得引物包含彼此在相反方向上的2个序列片段。

在一些实施方式中，内部引物序列具有与核酸分子的靶序列互补的靶区域。待扩增的核酸分子的实例包括单链和双链DNA，以及RNA。内部引物序列的3’末端包含捕获序列(F2、B2)。在一些实施方式中，内部引物序列包含在捕获序列的下游的反向互补序列(F1C、B1C)。缓冲序列为3’-5’方向，与5’-3’方向的捕获序列相反。因此，合作引物具有两个3’末端，一个在捕获序列(F2、B2)上，一个在缓冲序列(F3、B3)上。由于引物具有两个3’末端，因此聚合从引物的两端两者开始发生。

捕获序列具有高于缓冲序列的熔解温度(Tm)。由于捕获序列具有更高的Tm，因此它将在缓冲序列退火至其互补靶序列之前先退火至核酸分子的靶序列(参见图2)。在一些实施方式中，合作引物具有高Tm捕获序列和低Tm缓冲序列。在一个实施方式中，捕获序列的Tm比缓冲序列的Tm高1℃至10℃，优选高2℃至7℃，更优选高5℃至7℃。缓冲序列退火至在捕获序列上游的靶核酸分子。由于引物包含彼此在相反方向上的2个序列片段，因此引物自行回环(loop back)以使缓冲序列和捕获序列两者均退火至靶核酸分子(参见图3)。随着聚合从两端两者开始发生，从缓冲序列的3’末端开始的聚合置换捕获序列及其延伸产物(参见图4)。

在一些实施方式中，合作引物包含位于缓冲和捕获序列之间的包含一个或多个核糖核苷酸的一个切割位点。该切割位点可被核糖核酸酶(例如核糖核酸酶H)切割。核糖核酸酶的实例包括核糖核酸酶H1和核糖核酸酶H2。在一个实施方式中，合作引物包含由单个核糖核苷酸组成的一个切割位点，而引物的其余部分是脱氧核苷酸。

在一些实施方式中，使用包括至少两种合作引物(CCP)、热稳定性链置换DNA聚合酶、和缓冲剂的制剂，通过等温链置换扩增(iSDA)来扩增核酸序列。由于等温链置换扩增是由CCP引物介导，因此该扩增过程也称为CCPSDA。该扩增的产物反馈回到iSDA中以改善检测下限并缩短达到阳性的时间。

在一个实施方式中，CCPSDA使用一种正向(F-CCP)和一种反向(R-CCP)可切割合作引物。F-CCP结合至靶核酸分子(例如DNA的链)的第一靶序列。R-CCP结合至在F-CCP的延伸产物上的第二靶序列。R-CCP还可以结合至在互补靶核酸分子(例如DNA的互补链)上的第二靶序列。

在替代性实施方式中，使用四种CCP引物(两种F-CCP和两种R-CCP)。两种正向引物结合至一条链，而两种反向引物结合至互补链，从而产生额外产物以进入指数扩增阶段。

在一些实施方式中，CCP引物与两种环引物(LF和LB)和热稳定性链置换DNA聚合酶一起用于靶标扩增。在使用两种环引物以加速该反应的一些实施方式中，环引物增加了被指数扩增的靶DNA的量。参见图3，在一个实施方式中，第一环引物与F2C和F1C区域之间的第一置换链互补，第二环引物与B2C和B1C之间的区域互补。与仅有CCP引物不同，在CCP引物之外使用两种环引物加速了该反应。可以扩增病毒、细菌、真菌病原体或真核DNA的特定核酸序列(参见表1)并生成特定产物，用于使用各种各样DNA结合染料或DNA特异性探针进行检测。

表1：用于合作引物的寡核苷酸的实例

F-CCP和R-CCP结合至由45-75nt长度组成的靶基因组DNA的区域。两种CCP引物包含被核糖核苷酸隔开的3’-捕获寡核苷酸序列(F2或B2)和上游缓冲寡核苷酸序列(F3或B3)(参见图1)。捕获寡核苷酸序列的熔解温度(Tm)比缓冲寡核苷酸序列的Tm高5-7度。CCP引物的捕获序列(F2、B2)在缓冲寡核苷酸序列(F3、B3)结合之前先结合。

在F2捕获序列和F3缓冲序列退火至靶基因组DNA的互补序列之后，它们两者均通过热稳定性聚合酶在5’-3’方向延伸(图3)。F3的3’末端在5’-3’方向延伸，并从F2的3’末端开始置换延伸产物，F2的3’末端也在5’-3’方向延伸(参见图3和4中的箭头)。

然后R-CCP引物在两个阶段中结合至置换链的3’末端(图5)：1)B2捕获序列首先结合，然后2)具有比B2低的Tm的B3缓冲序列第二个结合。

B2的3’末端在5’-3’方向延伸(图6)，然后B3的3’末端在5’-3’方向延伸，从而从B2的3’末端开始置换延伸产物(图7)。

B2延伸产物沿F2延伸产物的长度在5’-3’方向延伸，并超过在F-CCP引物序列上的核糖碱基(图8)。当B2延伸产物到达在F3序列上的5’-5’连接时停止聚合。B2延伸产物的全长被B3延伸产物置换，因为它也一直延伸直到F3序列的5’-5’连接(参见图9)。随着B2延伸产物延伸超过核糖碱基，核糖碱基充当核糖核酸酶H切割位点，而dsDNA被核糖核酸酶H切割(参见图9)，从而暴露新的3’末端用于在5’-3’方向进一步延伸，这置换F2延伸产物(参见图10)，从而释放F2延伸产物(在图11中示为下链)。

转到图12，通过B2延伸产物的F1序列与B2延伸产物的F1C序列杂交，B2延伸产物在B2延伸产物的F2C序列处形成环(产物1，图12的上图)。这允许F1的3’末端沿着B2延伸产物的长度在5’-3’方向往回延伸大约超过R-CCP的核糖碱基(图13)。然后核糖核酸酶H切割产物1的R-CCP，从而暴露3’末端用于延伸，从而置换并释放成环的B2延伸产物(如图13所示)用于指数扩增(未显示)。

第二R-CCP结合至释放的F2延伸产物(产物2)，然后在5’-3’方向延伸(图12的下图)，从而形成与释放的F2延伸产物互补的链(图13的下图)。

与之前相同，然而通过B3在5’-3’方向上的延伸来置换来自第二R-CCP的B2延伸产物(产物2)(参见图13下图中的箭头)，并且该置换的B2延伸产物(产物2，图14)通过F1序列与F1C序列杂交而在F2C处形成环(图15上图)。该环在5’-3’方向延伸超过第二R-CCP的核糖核苷酸切割位点，从而导致被核糖核酸酶H切割(图15)。然后将切割的链从B3开始在5’-3’方向延伸(参见图15的第三小图中的箭头)，从而置换B2延伸产物，其通过B1序列与B1C序列杂交而在B2处形成环(图15的下图)。

然后第二F-CCP引物结合至F2C环，并向B1C和B2环延伸(图16)。该延伸产物在B1C的5’末端处终止并被置换，从而形成长的线性dsDNA(图17)。该dsDNA在核糖核苷酸切割位点处被核糖核酸酶H切割，并通过B1末端链的延伸而被置换。然后该置换的链通过F1C与F1杂交而在F2处形成环，其充当模板以启动另一轮扩增。然后用F-CCP和R-CCP引物来扩增这两条置换链并重复该循环。

试剂盒和试剂

在一些实施方式中，用于扩增核酸分子的靶多核苷酸区域的试剂盒在一个或多个容器中包括至少两种可切割合作引物(至少一种正向和一种反向合作引物)，热稳定性聚合酶和缓冲剂。所述热稳定性聚合酶具有链置换活性并在50-80℃的温度范围内具有活性。在一个实施方式中，所述试剂盒包括两种可切割合作引物，而在其他实施方式中，所述试剂盒包括两种正向合作引物和两种反向合作引物。在一些实施方式中，所述试剂盒进一步包括dNTP、核糖核酸酶H、环引物、单链结合蛋白(SSB)或其组合。

在一个实施方式中，添加单链结合蛋白(SSB)以减少引物二聚体扩增所产生的背景。可以在缓冲剂中以每个反应0.5ug至2ug的范围提供SSB。

为了检测扩增的核酸分子，可以使用各种各样DNA检测方法。例如，可以通过使用荧光探针的荧光信号检测来检测扩增产物。可以使用DNA结合染料，通过使用PNA或BNA探针和识别PNA/BNA–DNA复合物的染料对DNA进行特异性目视检测来目视检测扩增产物。检测扩增产物的其他实例包括使用亚甲基蓝染料与循环伏安法。

在一些实施方式中，试剂盒用于扩增靶DNA和/或RNA。在一些实施方式中，所述试剂盒具有核糖核酸酶抑制剂。在一个实施方式中，所述核糖核酸酶抑制剂来自NEB^TM(核糖核酸酶抑制剂，Murine cat#M0314L)。在一个实施方式中，所述核糖核酸酶抑制剂来自Promega^TM(RNasin Native(cat#N2215)和RNasin Recombinant(cat#N2515)。在从不同病原体扩增RNA的情况下，在反应混合物中包含核糖核酸酶的抑制剂是明智的。核糖核酸酶极其普遍并可见于用于生产中的污染表面和/或塑料，或可见于粗纯化的样本中。使用核糖核酸酶抑制剂阻止了RNA靶标(RNA基因组或甚至RNA转录物)在扩增过程中降解。如果不存在核糖核酸酶抑制剂并且反应被核糖核酸酶污染，则RNA靶标的扩增受到影响。在一些实施方式中，核糖核酸酶抑制剂的存在改善了在无法在扩增和检测靶标之前进行总核酸提取(从而去除核糖核酸酶)的情况下检测RNA靶标的能力。在本文所述的扩增核酸分子的靶多核苷酸区域的方法的一些实施方式中，所述方法包括在将本文所述的引物引入反应混合物中用于扩增之前，用核糖核酸酶抑制剂进行的预处理。

在一个实施方式中，所述试剂盒是即时诊断装置。即时诊断装置的实例见于WO2016/0004536(PCT/CA2015/050648)和WO2017/117666(PCT/CA2017/000001)，其全部内容通过引用并入本文。

实施例

实施例1–使用CCPSDA检测DNA

该实施例概述了展示在等温链置换(SDA)扩增反应中使用CCP引物的方法。

为了评估CCP引物在SDA中的功能，我们扩增了两种不同的基因靶标，包括来自人基因组DNA的β-肌动蛋白基因和甲型流感/H1基因。在表1中详述了用于待用于该评估的测定的引物(F-CCP、R-CCP、LF、LB)。在测试前，使用每组引物的CCPSDA反应在25℃(室温)下维持0至2小时以允许引物二聚体形成。在该室温维持后，所有反应均在BioRad CFX96中于63℃下进行30分钟。在所有这些反应中的信号扩增将通过向反应添加1x Eva green来进行(参见Biotechnology Letters，2007年12月，第29卷，第12期，第1939-1946页，其内容通过引用并入本文)。

对于使用CCP引物的CCPSDA扩增，引物混合物和模板被加热至94℃4分钟，在66℃下保持若干分钟，并就在添加至反应混合物之前冷却至室温。将引物/模板混合物添加至包含dNTP、Eva green、Bst 3.0、核糖核酸酶H2的反应混合物中，在63℃下在BioRad CFX96上扩增30分钟。

对于R-CCP和F-CCP引物，滴定包括0μM、0.2μM、0.4μM、0.8μM和1.2μM/反应。对于第二组引物LF和LB，滴定包括0μM、0.2μM、0.4μM、0.8μM和1.2μM/反应。

25μL的Eva green反应混合物包含：12.5μL的2×Master Mix(1×是20mM Tris-HCl、10mM(NH₄)₂SO₄、150mM KCl、2mM MgSO₄、用于LAMP的0.1％Tween 20pH＝8.8，和用于iSDA的Isothermal Amplification Buffer II(NEB)，0.6mM dNTP，0.8μM F-CCP和R-CCP引物，0.4μLF和LB引物，6U Bst 3.0酶，0.6mM核糖核酸酶H2(IDT)(对于核糖核酸酶H2对照，将使用缓冲剂D)，2μL样品(20ng/mL人gDNA或2.5ng/mL人gDNA或甲型流感RNA)，和无核酸酶的水至25μL。

甲型流感/H1的10⁴个靶标拷贝(图18A)和人β-肌动蛋白的10⁴个靶标拷贝(图18B)的结果示于图18中。

实施例2–CCPSDA相比于LAMP显示出减少的达到阈值扩增水平的时间

以下实施例展示了CCPSDA与传统LAMP相比改善的灵敏度。

以下实施例展示了与使用六种未修饰引物的LAMP相比，CCPSDA扩增达到阈值扩增水平的时间减少。扩增速率的增加是通过达到阈值扩增所花费的时间来衡量的。

在63℃下进行了CCPSDA和LAMP反应。人β-肌动蛋白CCP引物列于表1中，LAMP引物列于表2中。

表2：人β-肌动蛋白LAMP引物

对于使用CCP引物的CCPSDA扩增，引物混合物和模板被加热至94℃4分钟，在66℃下保持若干分钟，并就在添加至反应混合物之前冷却至室温。将引物/模板混合物添加至包含dNTP、Eva green、Bst 3.0、核糖核酸酶H2的反应混合物中，并于63℃下在BioRad CFX96上扩增30分钟。

使用1×AMP Buffer II于63℃下进行LAMP反应一式8份，所述AMP Buffer II包含：20mM Tris-HCl、10mM(NH₄)₂SO₄、150mM KCl、2mM MgSO₄、0.1％20，pH 8.8，25℃下。反应以25μL体积进行，并由以下组成：8U Bst 3.0 DNA聚合酶(New EnglandBiolabs,Ipswich,Mass.)，20ng/5μL人基因组DNA(Roche Cat.No.11 691 112 001)，以及如表2中所示的0.2μM F3和B3引物、0.4μM LF和LB引物、1.6μM F1P和B1P引物，1.4mM dNPT，以及Eva Green染料。

将引物(Integrated DNA Technologies,Coralville,Iowa)添加至扩增反应(25℃下20mM Tris pH 8.8、10mM(NH₄)₂SO₄、2mM MgSO₄)，并补充另外的6mM MgSO₄、0.01％Tween-20和1.4mM dNTP。

100个靶标拷贝的结果示于图19中，50个靶标拷贝的结果示于图20中，25个靶标拷贝的结果示于图21中，以及10个靶标拷贝的结果示于图22中。

达到阳性的时间和各种靶标拷贝数量的阳性数量/测试数量总结于表3和4中。对于10个靶标拷贝，相比于加热LAMP达到阳性的时间为16和23分钟，CCPSDA达到阳性的时间为12.4、15.6和17分钟(图22)。对于10个靶标拷贝的所有三个重复实验，没有加热步骤的传统LAMP未能显示出高于阈值水平的扩增信号。对于50个靶标拷贝，相比于加热LAMP(5/8阳性)达到阳性的时间为17分钟和传统LAMP为0/8，CCPSDA达到阳性的时间为20分钟(8/8阳性)(表4)。对于25个拷贝，CCPSDA检测到了5/8重复实验，而传统和加热LAMP两者均检测到0/8重复实验。对于10个拷贝，CCPSDA检测到3/8重复实验，而传统LAMP检测到0/8重复实验，加热LAMP检测到2/8重复实验。

表3：传统LAMP、加热LAMP和CCPSDA的扩增结果的比较

*达到阳性的时间以超过检测阈值的分钟数表示。^a 1/8重复实验为阳性。^b 100个拷贝的8重复实验的平均值。^c 8/8重复实验的平均值。^d 50个拷贝的5重复实验的平均值。^e8/8重复实验的平均值。^f 5/8重复实验的平均值。^g两重复实验的平均值。^h 3/8重复实验的平均值。ND，未进行。

表4：传统LAMP、加热LAMP和CCPSDA的扩增结果

实施例3–CCPSDA扩增相比于LAMP增加了扩增的非特异性产物达到阈值扩增水平 的时间

以下实施例展示了CCPSDA与LAMP相比改善的特异性。

使用10⁴个拷贝的人β-肌动蛋白基因靶标进行CCPSDA和LAMP测定。CCPSDA反应是在63℃下以25μL进行并由使用1×AMP Buffer II组成。

使用1×AMP Buffer II(其包含20mM Tris-HCl、10mM(NH₄)₂SO₄、150mM KCl、2mMMgSO₄、0.1％20，pH 8.8，在25℃下)在63℃下立即或与指定组分于25℃下一起孵育2小时，进行LAMP反应1小时。反应以25μL体积进行，并由以下组成：8U Bst 3.0 DNA聚合酶(New England Biolabs,Ipswich,Mass.)，20ng/5μL人基因组DNA，以及0.2μM F3和B3引物，0.4μM LF和LB引物，1.6μM F1P和B1P引物，1.4mM dNPT，Eva绿色染料。

如图23所示，LAMP的非特异性扩增产物达到阈值扩增水平的时间为34分钟，相比之下CCPSDA为52分钟。

实施例4–CCPSDA与仅两种合作引物一起工作

该实施例展示了CCPSDA可以与仅两种CCP引物一起工作。

使用10⁴个拷贝的β-肌动蛋白基因靶标一式三份进行CCPSDA测定。25μL的CCPSDA反应与两个CCP引物单独或与两个CCP引物和两个环引物一起在63℃下进行，并且由1×AMPBuffer II组成。人β-肌动蛋白CCP引物的浓度(表1)为0.8μM F-CCP和R-CCP引物，以及0.4μM LF和LB。

对于使用CCP引物的CCPSDA扩增，将引物混合物和模板加热至94℃4分钟，在66℃下保持若干分钟，并就在添加至反应混合物之前冷却至室温。将引物/模板混合物添加至包含dNTP、Eva green、Bst 3.0、核糖核酸酶H2的反应混合物中，并于63℃下在BioRad CFX96上扩增30分钟。

结果示于图24中。具有四种引物即两种CCP和两种环引物的CCPSDA在10.5分钟时超过了扩增阈值，而仅具有两种CCP引物的反应更慢，但在48至52分钟之间超过了阈值。

尽管已经在本文中描述了本发明的优选实施方式，但是本领域技术人员将理解，可以在不脱离本发明的精神或所附权利要求的范围的情况下对其进行改变。本文公开的所有文件(包括以下参考文献列表中的那些)均通过引用并入。

例如，本发明预期在本文所述的任何实施方式中示出的任何特征可以与在本文所述的任何其他实施方式中示出的任何特征结合，并且仍然落入本发明的范围内。

参考文献

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