阅读说明：本技术 一种单细胞dna表观遗传修饰空间定位与邻近分布的可视化区分方法 (Visual distinguishing method for single-cell DNA epigenetic modification space positioning and adjacent distribution ) 是由 赵永席 陈锋 薛静 张进 于 2020-06-29 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种单细胞DNA表观遗传修饰空间定位与邻近分布的可视化区分方法,属于分析化学领域,具体涉及通过叠氮衍生物探针1,3-吲二酮(AI)对5-醛基胞嘧啶(5-fC)进行叠氮(N<Sub>3</Sub>)官能团的化学标记、利用T4噬菌体β葡萄糖基转移酶(β-GT)对5-羟甲基胞嘧啶(5-hmC)进行叠氮(N<Sub>3</Sub>)官能团的酶介导标记；成对的临近位点的引物共同对有缺口的环模板实现原位临近连接,剩余不成对的5-fC和5-hmC修饰位点,引物通过链置换反应被释放,接着杂交对应的特异性环模板；并结合核酸扩增、荧光探针杂交,实现单细胞DNA表观遗传修饰空间定位与邻近分布的单分子可视化区分。(The invention discloses a visual distinguishing method for single-cell DNA epigenetic modification space positioning and adjacent distribution, belongs to the field of analytical chemistry, and particularly relates to azide (N) of 5-aldehyde cytosine (5-fC) through an azide derivative probe 1, 3-inddione (AI) 3 ) Chemical labeling of functional groups, azidation (N-C) of 5-hydroxymethylcytosine (5-hmC) with T4 bacteriophage beta glucosyltransferase (beta-GT) 3 ) Enzyme-mediated labeling of functional groups; the paired primers of the adjacent sites jointly realize in-situ adjacent connection on the ring template with the gap, the remaining unpaired 5-fC and 5-hmC modified sites are released through strand displacement reaction, and then the corresponding specific ring template is hybridized; and combines nucleic acid amplification and fluorescent probe hybridization to realize the single-cell DNA epigenetic modification spaceLocalization is distinguished from single molecule visualization of adjacent distribution.)

一种单细胞DNA表观遗传修饰空间定位与邻近分布的可视化 区分方法

技术领域

本发明属于分析化学领域，涉及一种单细胞DNA表观遗传修饰空间定位与邻近分布的可视化区分方法。

背景技术

哺乳动物基因组中存在着不同的DNA表观遗传标记。这些表观遗传标记对基因表达和染色质结构都有着深远的影响，并与很多疾病(如癌症等)的病理有关。在基因的表观遗传标记中，研究较多的是5-甲基胞嘧啶(5-mC)及其氧化衍生物5-hmC和5-fC，经过研究发现，它们不仅是5-mC去甲基化通路的中间产物，而且也具有很好的稳定性。这两种DNA表观遗传标记都是由双加氧酶的10-11易位家族产生的。

表观遗传标记在单细胞中的空间定位也是理解其功能的基础，不同的表观遗传标记如果在空间上呈临近分布状态，则它们可能会有相互干扰作用或者它们所表达的蛋白质之间会有相互作用。针对这些修饰碱基，当前已经有几种用于全基因组分析的深度测序策略，可以揭示它们在正常生物过程和疾病发生过程中的重要功能。但是这些深度测序的方法都是针对细胞群体平均进行分析，并且不能实现修饰碱基在亚细胞分布的可视化。

在针对DNA表观遗传标记空间邻近分布的研究方法中，传统的基于荧光原位杂交的细胞成像仅限于检测感兴趣的序列，不足以评估碱基修饰；免疫分析仅限于在裸DNA中使用抗体与DNA修饰(如5hmC)结合，且当抗体蛋白的尺寸较大时，DNA结合蛋白或浓缩染色质中所覆盖的碱基位点就会对免疫蛋白的识别产生影响，导致识别率下降。不仅如此，这种抗体与DNA非共价的、基于亲和力的方法识别特异性和结合效率较低，并且无法对有不同表观遗传标记碱基的空间邻近性进行研究；相比之下，基于化学酶或化学的方法在对5-hmC或5-fC进行标记时，可以更准确和更全面的实现DNA表观遗传位点的标记。然而，因为在细胞内环境中含有大量修饰碱基的类似物，会对识别造成干扰，所以该方法还没有在真实的细胞内环境中进行过应用。因此当前的研究方法不能获取DNA表观遗传标记空间邻近分布的信息。

发明内容

为了克服上述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种单细胞DNA表观遗传修饰空间定位与邻近分布的可视化区分方法，该方法能够实现单细胞内5-fC/5-hmC依次原位特异性标记，且标记过程具有高度特异性，能够有效避免干扰，反应效率高、反应条件简单、反应速度快。

为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案予以实现：

本发明公开了一种单细胞DNA表观遗传修饰空间定位与邻近分布的可视化区分方法，包括以下步骤：

1)利用特异性标记方法，标记单细胞内DNA表观遗传修饰位点；

2)通过点击化学将标记为点共价连接上对应的引物，成对的临近修饰位点的引物能够对有缺口的环模板实现原位临近连接，得到完整环模板Pad1；

3)对于剩余不成对的修饰位点，引物通过链置换反应被释放，接着利用特异性环模板Pad2和Pad3分别对修饰位点进行杂交，实现修饰位点的空间定位与邻近分布特征编码；

4)编码完成后，通过核酸扩增、荧光探针杂交，实现单细胞DNA表观遗传修饰空间定位与邻近分布的单分子可视化区分。

优选地，修饰位点为5-醛基胞嘧啶和5-羟甲基胞嘧啶。

进一步优选地，步骤1)中，是利用叠氮衍生物探针1,3-吲二酮对5-醛基胞嘧啶进行叠氮官能团的化学标记，利用T4噬菌体β葡萄糖基转移酶对5-羟甲基胞嘧啶进行叠氮官能团的酶介导标记。

具体操作如下：将含有10mM AI和10％二甲基亚砜的20μL 1×MES缓冲液加入到反应室中，并在37℃下孵育24h。随后利用点击化学反应，将含有100nM二苯并环辛炔DBCO修饰引物探针P1-fC的1×PBS缓冲液加入到反应室，在37℃下反应1h。再向反应室中加入20μL含1×NEBuffer 4，50μM的UDP-N₃-Glu和5U的T4β-GT的反应液，37℃孵育2h。最后再向反应室加入100nM P2-hmC探针，在37℃下反应1h。每次向反应室加入反应液前先将上一步的反应液移除，并使用PBS清洗反应室三遍。

优选地，步骤2)中，对单细胞内5-醛基胞嘧啶和5-羟甲基胞嘧啶修饰位点依次顺序进行特异性标记、点击化学共价连接上对应的RCA引物P1-5-醛基胞嘧啶及P2-5-羟甲基胞嘧啶后，成对的临近位点的引物共同对有缺口的环模板实现原位临近连接，得到完整环模板Pad 1。

具体操作如下：对单细胞内5-fC和5-hmC修饰位点依次顺序进行特异性标记、点击化学共价连接上对应的RCA引物(P1-fC及P2-hmC)后，成对的临近位点的引物共同对有缺口的环模板实现原位临近连接，得到完整环模板(Pad 1)。即，在1×T4 DNA连接酶缓冲液中加入含10U T4DNA连接酶的L-proxi和Pad-proxi探针，分别与两种引物DNA探针P1-fC和P2-hmC进行原位杂交和连接。实现5-fC和5-hmC的邻近分布特征编码。

优选地，步骤3)中，对于剩余不成对的修饰位点，引物通过链置换反应被释放，包括如下操作：在邻近位点的引物发生原位连接后，剩余不成对的5-fC和5-hmC修饰位点，引物通过链置换反应被释放，即，在邻近位点进行原位杂交和连接后，使用200nM的Disp-fC和Disp-hmC在37℃条件下进行链置换反应，将5-fC或5-hmC位点上的过量探针置换出来。

优选地，步骤3)中，对发生链置换反应后的表观遗传修饰位点进行特异性环模板杂交，包括如下操作：在将5-fC或5-hmC位点上的过量探针置换出来后，利用对应的特异性环模板(Pad 2及Pad 3)对该位点进行杂交。即，将制备的200nM的5-fC/5-hmC特异性环状DNA条码探针加入反应室中，在37℃下孵育2h。实现5-fC和5-hmC的空间定位编码。

优选地，步骤4)中，进行RCA扩增、杂交荧光探针以及荧光成像，包括如下操作：将含有10Uφ29DNA聚合酶和2mM dNTP的1×φ29DNA聚合酶缓冲液加入到反应室中，在37℃下反应2h。最后荧光探针与RCA扩增产物在含20％甲酰胺的2×SSC缓冲液中杂交。荧光探针杂交后，用DAPI染色细胞核，激光扫描共聚焦显微镜(TCS SP8 STED 3X，Leica)进行成像。每次向反应室加入反应液前先将上一步的反应液移除，并使用PBS清洗反应室三遍。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明公开的单细胞DNA表观遗传修饰空间定位与邻近分布的可视化区分方法，通过叠氮衍生物探针1,3-吲二酮(AI)对5-醛基胞嘧啶(5-fC)进行叠氮(N₃)官能团的化学标记、利用T4噬菌体β葡萄糖基转移酶(β-GT)对5-羟甲基胞嘧啶(5-hmC)进行叠氮(N₃)官能团的酶介导标记；成对的临近位点的引物共同对有缺口的环模板实现原位临近连接，剩余不成对的5-fC和5-hmC修饰位点，引物通过链置换反应被释放，接着杂交对应的特异性环模板；并结合核酸扩增、荧光探针杂交，实现单细胞DNA表观遗传修饰空间定位与邻近分布的单分子可视化区分。该方法的优势体现在：

1、对单细胞内5-fC/5-hmC依次进行原位特异性标记，并结合原位临近连接、链置换反应、特异性环模板杂交及滚环扩增，实现了5-fC/5-hmC空间定位的差异可视化以及它们在单个细胞中的邻近程度。这种多层次的空间信息会促进对表观遗传修饰碱基调控功能和机制的深入研究。

2、本发明所述的成对的临近表观遗传修饰位点的引物发生原位临近连接，通过对单细胞内5-fC和5-hmC修饰位点依次顺序进行特异性标记、点击化学共价连接上对应的RCA引物(P1-fC及P2-hmC)后，成对的临近位点的引物共同对有缺口的环模板实现原位临近连接，可以得到完整环模板，实现5-fC和5-hmC的邻近分布特征编码，继而就可以得到表观遗传修饰碱基5-fC和5-hmC的临近分布信息。且标记过程具有高度特异性，可以避免干扰。

3、本发明所述的不成对的表观遗传修饰位点的引物发生链置换反应，可以利用多余探针将非邻近的5-fC或5-hmC位点上的过量探针置换出来。在邻近位点的引物发生原位连接后，使用200nM的Disp-fC和Disp-hmC在37℃条件下进行链置换反应，将剩余不成对的5-fC和5-hmC修饰位点上的引物释放。该过程是一种高产率、反应条件简单、反应速度快的反应。

4、本发明所述的发生链置换反应后的表观遗传修饰位点进行特异性环模板杂交，利用对应的特异性环模板(Pad 2及Pad 3)对链置换反应后的位点进行杂交，可以实现5-fC和5-hmC的空间定位编码。利用该方法，可以为更深入的表观遗传学研究提供更全面的亚细胞分布信息。

附图说明

图1为本发明的原理图；

图2为本5-fC和5-hmC成对邻近分布可视化的试管验证实验结果；其中，A为5-fC与AI特异性标记产物的质谱分析；B为对不同dsDNA样品使用AI处理后进行测序分析；C为N₃-5-gmC的质谱分析结果；D为盖玻片上5-fC和5-hmC的成对临近可视化成像结果；

图3为单细胞5-fC和5-hmC的空间定位；其中，A为5-fC、5-hmC和H3K4me1在不同细胞系中的代表细胞图像；B为5-fC/5-hmC、5-fC/H3K4me1和5-hmC/H3K4me1在不同细胞系中的共定位分析(N＝50)；C为5-fC或5-hmC与5种组蛋白修饰在MCF-10A细胞中的共定位分析(N＝50)。N表示统计细胞的数量；

图4-1为单细胞内5-fC和5-hmC的成对临近分布可视化设计示意图；

图4-2为单细胞(N＝55)各通道内荧光强度和RCA扩增产物RCP斑点计数的统计分析结果图；

图4-3为DAPI信号强度(蓝色)、成对邻近位点(绿色)、未成对的5fC(黄色)或5hmC(红色)的信号强度随核中心到核膜的距离而变化的结果图；

图4-4为每个信号与DAPI的对应Pearson相关性结果(N＝55)。

具体实施方式

为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。

需要说明的是，本发明的说明书和权利要求书及上述附图中的术语“第一”、“第二”等是用于区别类似的对象，而不必用于描述特定的顺序或先后次序。应该理解这样使用的数据在适当情况下可以互换，以便这里描述的本发明的实施例能够以除了在这里图示或描述的那些以外的顺序实施。此外，术语“包括”和“具有”以及他们的任何变形，意图在于覆盖不排他的包含，例如，包含了一系列步骤或单元的过程、方法、系统、产品或设备不必限于清楚地列出的那些步骤或单元，而是可包括没有清楚地列出的或对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤或单元。

下面结合附图对本发明做进一步详细描述：

参见图1，为本发明的原理图，本发明公开的单细胞DNA表观遗传修饰空间定位与邻近分布的可视化区分方法，包括以下步骤：

1)利用特异性标记方法，标记单细胞内DNA表观遗传修饰位点；

2)通过点击化学将标记为点共价连接上对应的引物，成对的临近修饰位点的引物能够对有缺口的环模板实现原位临近连接，得到完整环模板Pad1；

3)对于剩余不成对的修饰位点，引物通过链置换反应被释放，接着利用特异性环模板Pad2和Pad3分别对修饰位点进行杂交，实现修饰位点的空间定位与邻近分布特征编码；

4)编码完成后，通过核酸扩增、荧光探针杂交，实现单细胞DNA表观遗传修饰空间定位与邻近分布的单分子可视化区分。

具体地，通过叠氮衍生物探针AI对5-fC进行N₃官能团的化学标记、利用β-GT对5-hmC进行N₃官能团的酶介导标记；再利用点击化学在标记位点分别共价连接上对应的RCA引物。成对的临近位点的引物共同对有缺口的环模板实现原位临近连接，剩余不成对的5-fC和5-hmC修饰位点，引物通过链置换反应被释放，接着杂交对应的特异性环模板；并结合核酸扩增、荧光探针杂交，实现单细胞DNA表观遗传修饰空间定位与邻近分布的单分子可视化区分。

实施例1：结合图1，MCF-10A细胞DNA表观遗传修饰的空间定位及邻近分布可视化。将细胞使用多聚甲醛固定于带有微反应室的盖玻片上。

通过叠氮衍生物探针AI对5-fC进行N₃官能团的化学标记、利用β-GT对5-hmC进行N₃官能团的酶介导标记。将含有10mM AI和10％二甲基亚砜的20μL1×MES缓冲液加入到反应室中，并在37℃下孵育24h。随后利用点击化学反应，将含有100nM DBCO修饰引物探针P1-fC的1×PBS缓冲液加入到反应室，在37℃下进行反应1h。再向反应室中加入20μL含1×NEBuffer 4，50μM的UDP-N₃-Glu和5U的T4β-GT的培养液，37℃孵育2h。最后再向反应室加入100nM P2-hmC探针，在37℃下反应1h。每次向反应室加入反应液前先将上一步的反应液移除，并使用PBS清洗反应室三遍。

成对的临近位点的引物共同对有缺口的环模板实现原位临近连接，剩余不成对的5-fC和5-hmC修饰位点，引物通过链置换反应被释放，接着杂交对应的特异性环模板。将制备的200nM的5-fC/5-hmC特异性环状DNA条码探针加入反应室中，在37℃下孵育2h。实现5fC和5hmC的空间定位与邻近分布特征编码。

进行RCA扩增及杂交荧光探针，将含有10Uφ29DNA聚合酶和2mM dNTP的1×φ29DNA聚合酶缓冲液加入到反应室中，在37℃下反应2h。最后荧光探针与RCA扩增产物在含20％甲酰胺的2×SSC缓冲液中杂交。每次向反应室加入反应液前先将上一步的反应液移除，并使用PBS清洗反应室三遍。

荧光探针杂交后，用DAPI染色细胞核，激光扫描共聚焦显微镜(TCS SP8STED 3X，Leica)进行成像。最终实现MCF-10A细胞DNA表观遗传修饰的空间定位及邻近分布可视化。

参见图2，为5-fC和5-hmC成对邻近分布可视化的体外验证。其中，A图为质谱分析5-fC与AI的特异性标记产物。发现了5fC-AI的质谱理论计算值[C₁₆H₁₁N₆O₂]＝319.09380，实验测得值＝319.09312，没有发现5-hmC、5-fU和5-hmU的反应产物。B图中对不同dsDNA样品使用AI处理后进行测序分析。C图则是N₃-5-gmC的质谱理论计算值[C₁₆H₂₂N₅O₁₀]＝444.13722，实验测得值＝443.15466。D图中盖玻片上5-fC和5-hmC的成对临近可视化。对于不同分离距离的碱基对，每个样本分析三个等面积视野的RCP数量，比例尺为50μm。结果证明，本发明成功利用特异性标记方法，标记了单细胞内DNA表观遗传修饰位点。

图3为单细胞5-fC和5-hmC的空间定位研究。其中，A图为5-fC、5-hmC和H3K4me1在不同细胞系中的代表细胞图像。B图为5-fC/5-hmC、5-fC/H3K4me1和5-hmC/H3K4me1在不同细胞系中的共定位分析(N＝50)。C图为5-fC或5-hmC与5种组蛋白修饰在MCF-10A细胞中的共定位分析(N＝50)。N表示统计细胞的数量。比例尺为10微米。说明本发明能够获得单细胞内DNA表观遗传修饰位点5-fC和5-hmC的空间定位情况。

参见图4-1、4-2、4-3和4-4为单细胞内5-fC和5-hmC的成对临近分布可视化。具体地，4-1为设计示意图；图4-2为单细胞(N＝55)各通道内荧光强度和RCP斑点计数的统计分析。4-3为DAPI信号强度(蓝色)、成对邻近位点(绿色)、未成对的5fC(黄色)或5hmC(红色)的信号强度随核中心到核膜的距离而变化的情况。每条线代表一个细胞，粗线表示所有细胞数据均值的拟合曲线。4-4为每个信号与DAPI对应的Pearson相关性(N＝55)。可以看出，利用本发明的方法，能够实现单细胞内DNA表观遗传修饰位点5-fC和5-hmC空间定位与邻近分布的可视化区分。

以上给出的实施例是实现本发明较优的例子，本发明不限于上述实施例。本领域的技术人员根据本发明技术方案的技术特征所做出的任何非本质的添加、替换，均属于本发明的保护范围。

以上内容仅为说明本发明的技术思想，不能以此限定本发明的保护范围，凡是按照本发明提出的技术思想，在技术方案基础上所做的任何改动，均落入本发明权利要求书的保护范围之内。