阅读说明：本技术 一种黄腐酚在制备新型冠状病毒抑制剂中的应用 (Application of xanthohumol in preparation of novel coronavirus inhibitor ) 是由 王卓亚 刘昊 初燕燕 王鑫 徐锡明 杨金波 魏志强 于 2020-11-20 设计创作，主要内容包括：本发明提出了一种黄腐酚在制备新型冠状病毒抑制剂中的应用。本发明以新型冠状病毒引发肺部炎症的Mpro蛋白酶为靶点,通过基于结构的虚拟筛选得到了具有与Mpro蛋白酶结合能力强的抗病毒的活性化合物——黄腐酚。黄腐酚通过与靶点Mpro蛋白酶结合,抑制Mpro蛋白酶活性,从而抑制病毒的复制和转录,达到抗击新型冠状病毒感染的效应。黄腐酚可以在制备新型冠状病毒Mpro蛋白酶抑制剂中进行应用,从而在制备预防和/或治疗新型冠状病毒炎症的药物中进行应用。本发明的黄腐酚与Mpro蛋白酶的结合能是：-63.427KJ/mol,对Mpro蛋白酶的IC_(50)为4.97±1.79μM,抑制常数Ki值为2.14μM。(The invention provides an application of xanthohumol in preparation of a novel coronavirus inhibitor. The invention takes Mpro protease of novel coronavirus causing lung inflammation as a target spot, and obtains an antiviral active compound-xanthohumol with strong binding capacity with the Mpro protease through virtual screening based on a structure. The xanthohumol inhibits the activity of Mpro protease by combining with the target Mpro protease, thereby inhibiting the replication and transcription of viruses and achieving the effect of resisting the infection of the novel coronavirus. The xanthohumol can be applied to the preparation of a novel coronavirus Mpro protease inhibitor, so that the xanthohumol can be applied to the preparation of a medicament for preventing and/or treating novel coronavirus inflammation. The binding energy of the xanthohumol of the invention to the Mpro protease is: 63.427KJ/mol, IC for Mpro protease 50 4.97 +/-1.79 mu M, inhibitThe constant Ki was set to 2.14. mu.M.)

一种黄腐酚在制备新型冠状病毒抑制剂中的应用

技术领域

本发明涉及黄腐酚用途的技术领域，特别是指一种黄腐酚在制备新型冠状病毒抑制剂中的应用。

背景技术

新型冠状病毒(SARS-CoV-2)是2019年在人体中发现的冠状病毒新毒株，由其感染而导致的肺炎称为新型冠状病毒肺炎(Corona Virus Disease 2019，COVID-19)。新型冠状病毒肺炎主要通过呼吸道飞沫传播和接触传播，人群普遍易感，具有高度传染性。新型冠状病毒肺炎自2019年12月爆发以后，迅速席卷全球。目前，世界卫生组织已将新型冠状病毒肺炎列为全球大流行病，这也是首个由冠状病毒引发的全球大流行。截止2020年10月28日，全球已有超过4400万患者确诊感染新型冠状病毒肺炎，累计死亡人数超过110万。

新型冠状病毒肺炎以发热、干咳和乏力为主要临床特征，约50％的患者在1周后出现呼吸困难，严重者可快速进展为急性呼吸窘迫综合征、脓毒症休克、难以纠正的代谢性酸中毒和出凝血功能障碍等症状。尽管大多数患者预后良好，仍有部分患者出现急性呼吸窘迫综合征或脓毒症休克，甚至死亡。新型冠状病毒肺炎目前尚无特效治疗药物，临床上多采取各种氧疗、对症治疗和免疫调节治疗。然而，部分重症患者在经过抗病毒治疗以及抗炎治疗后仍无法有明显疗效，容易合并感染，造成多发性和弥漫性病变。目前的药物以及治疗方法尚无法满足临床需要，研发新型冠状病毒炎症的治疗药物具有重大的社会学和经济学意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种黄腐酚在制备新型冠状病毒抑制剂中的应用，旨在解决现有技术中治疗新型冠状病毒炎症的药物和治疗方法尚无法满足临床需要的问题。

为了解决上述技术问题，本发明的技术方案是这样实现的：

在一个方面，本发明提供了一种黄腐酚在制备新型冠状病毒Mpro蛋白酶抑制剂中的应用。

新型冠状病毒(SARS-CoV-2)的基因组中包含了约30000个核苷酸，SARS-CoV-2的复制酶编码中有两个高同源性的多聚蛋白pp1a和pp1ab，pp1a和pp1ab是病毒复制和转录所必需的。新型冠状病毒(SARS-CoV-2)主蛋白酶(Mpro，3CLpro，nsp5)是一种半胱氨酸蛋白酶，通过水解消化来释放功能性的多肽。主蛋白酶Mpro从pp1a和pp1ab的自溶裂解开始，将从至少11个保守位点来水解消化多聚蛋白，形成功能多肽。Mpro蛋白酶在病毒复制和转录的生命周期过程中起着关键作用，并且，缺乏与人类密切相关的同源基因；因此，Mpro蛋白酶是一个极具潜能的抗病毒药物设计靶标。本发明中利用黄腐酚制备靶向新型冠状病毒Mpro蛋白酶靶点抑制剂，黄腐酚与新型冠状病毒引发肺部等炎症靶点Mpro蛋白酶具有较强结合强度，能够抑制Mpro蛋白酶活性，从而抑制病毒的转录和复制，对新型冠状病毒所致肺炎有潜在治疗作用。

在另一个方面，本发明提供了一种黄腐酚在制备新型冠状病毒抑制剂中的应用。

本发明的黄腐酚在制备新型冠状病毒抑制剂中含有黄腐酚，黄腐酚(Xanthohumol)是查尔酮类化合物的一员，在4,2'和4'位被羟基取代，在6'位有甲氧基，在3'位有一个戊烯基的反式查尔酮。黄腐酚从啤酒花中分离得到，是DGAT、COX-1和COX-2的抑制剂，具有抗肿瘤、抗血管生成的作用，还具有抗BVDV、HSV-1、HSV-2和CMV的抗病毒活性。黄腐酚的结构式如式(I)所示：

黄腐酚与新型冠状病毒引发肺部等炎症靶点Mpro蛋白酶具有较强结合强度，能够抑制Mpro蛋白酶活性，从而制备新型冠状病毒抑制剂。

在再一个方面，本发明提供了一种黄腐酚在制备预防和/或治疗新型冠状病毒炎症药物中的应用。

本发明的预防和/或治疗新型冠状病毒炎症药物含有黄腐酚，黄腐酚与新型冠状病毒引发肺部等炎症靶点Mpro蛋白酶具有较强结合强度，能够抑制Mpro蛋白酶活性，从而制备预防和/或治疗新型冠状病毒炎症的药物。

进一步地，所述药物为胶囊、片剂、丸剂、颗粒剂、冲剂、注射药剂或喷剂中的任意一种。本发明的预防和/或治疗新型冠状病毒炎症药物的剂型可以是多种多样的，例如胶囊、片剂、丸剂、颗粒剂、冲剂、注射药剂或喷剂，也就是说黄腐酚配以各种辅料制成不同剂型的预防和/或治疗新型冠状病毒炎症的药物，从而满足不同的需求。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明中黄腐酚与新型冠状病毒引发肺部等炎症靶点Mpro蛋白酶具有较强结合强度，能够抑制Mpro蛋白酶活性，进而抑制病毒的转录和复制，因而，可以利用黄腐酚制备靶向新型冠状病毒Mpro蛋白酶靶点抑制剂，也可以利用黄腐酚制备新型冠状病毒抑制剂，从而利用黄腐酚制备预防和/或治疗新型冠状病毒炎症的药物，这种药物对新型冠状病毒所致肺炎有潜在治疗作用。

附图说明

图1为本发明中黄腐酚与新型冠状病毒靶点Mpro蛋白酶的结合模式图；

图2为黄腐酚与Mpro蛋白酶平均结合自由能测试图；

图3为不同浓度下黄腐酚对Mpro蛋白酶活性的抑制作用测试图；

图4为黄腐酚对Mpro蛋白酶活性的抑制直线图；

图5为不同浓度下磷酸氯喹对Mpro蛋白酶活性的抑制作用测试图。

具体实施方式

下面将结合本发明的具体实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1黄腐酚对新型冠状病毒主蛋白酶Mpro结合模式

(1)实验材料

本实施例采用蛋白质数据库(RCSB PDB)中由上海科技大学团队解析的SARS-CoV-2病毒主蛋白酶Mpro的三维结构(PDB ID:6LU7)为受体；采AutoDock Vina、Gromacs 2019和g_MMPBSA等软件计算；PyMol、Grace和R做可视化分析；采用青岛海洋生物医药研究院中的上市药物和临床研究药物库中的药物进行虚拟筛选。

(2)实验方法

依托青岛海洋科学与技术试点国家实验室高性能科学计算与系统仿真平台的超级计算机，以青岛海洋生物医药研究院中的上市药物和临床研究药物库中的药物为筛选对象，首先，采用AutoDock Vina将药物分子与Mpro蛋白酶进行分子对接，计算原子之间的距离，得到药物分子与Mpro蛋白酶的相互作用；根据药物分子与Mpro蛋白酶的相互作用(氢键)和对接评分(<-6kcal/mol)的一致性评价，进行初步筛选，筛选出黄腐酚；其次，采用Gromacs程序进行10ns的分子动力学模拟，根据模拟结果，取采样结构的均方根误差RMSD值(<0.2)，截取平衡后的2ns的结构；最后，使用g_MMPBSA程序，利用MM-PBSA方法，计算平衡后2ns结构上黄腐酚的平均结合能(也即平均结合自由能)。

(3)实验结果

经计算发现：黄腐酚与Mpro蛋白酶有较高的亲和力，分子对接预测的平均结合能为-7.0kcal/mol，并且，黄腐酚能够与Mpro蛋白酶的底物结合位点相结合。参阅附图1，黄腐酚的对羟基苯基乙烯酮部分的羟基与Mpro蛋白酶190位的苏氨酸(THR-190)形成一对氢键，黄腐酚的6-甲氧基-3-(3-甲基-2-丁烯)-间苯二酚部分的C4位的羟基与Mpro蛋白酶143位的甘氨酸(GLY-143)、Mpro蛋白酶144位的丝氨酸(SER-144)和Mpro蛋白酶145位的半胱氨酸(CYS-45)各形成一对氢键。其中，145位的半胱氨酸是Mpro蛋白酶产生催化活性的关键残基，充分证实了黄腐酚与Mpro蛋白酶的相互作用直接影响其活性。

参阅附图2，使用MM-PBSA方法计算得到：黄腐酚与Mpro蛋白酶的平均结合自由能是：-63.427KJ/mol，这表明黄腐酚与新型冠状病毒靶点Mpro蛋白酶有较强的结合能，从而抑制Mpro蛋白酶活性，并影响病毒的转录和复制。因此，黄腐酚对新型冠状病毒所致肺炎有潜在治疗作用。

实施例2黄腐酚对新型冠状病毒靶点Mpro蛋白酶抑制活性测试

(1)实验材料

含有Mpro蛋白酶基因的重组质粒由武汉普健生物公司合成；Ni Beads购自SmartLifeScience公司；多功能酶标仪SpectraMax i3购自美国Molecular Device公司；96孔黑板购自美国Corning；黄腐酚及其它常用试剂购自Sigma。

(2)实验方法

a.重组Mpro蛋白酶的表达与纯化

将包含SARS-CoV-2来源的Mpro蛋白酶重组质粒(pET28a(+))转化入大肠杆菌菌株BL21(codonplus)，再将菌株在LB培养基中生长至OD₆₀₀为0.6-0.8，然后，加入0.4mM异丙基-1-硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)在16℃继续生长12小时进行低温诱导表达。按照体积比为1：5的比例加入裂解液，将菌液重悬，经超声和高压破碎等方式破碎菌体之后，离心，取上清，经Ni Beads按照生产商的说明进行亲和层析纯化，采用SDS-PAGE的方法对蛋白纯度进行验证，得到纯化后的Mpro蛋白酶，置于冰箱内保存。

b.黄腐酚的Mpro蛋白酶抑制活性测试

向含1mg底物的试管内加入230μL二甲基亚砜(DMSO)，使底物终浓度为1mM；室温避光震荡10分钟后，分装20μL/每管，备用，剩余于-20℃下冻存。从冰箱中取出步骤a步骤的纯化后的Mpro蛋白酶，并置于室温下，解冻5分钟，开始活性测试。

IC50测试方法为：首先，每孔加入48μL反应缓冲液(50mM Tris-HCl(pH 7.3)，1mMEDTA)和1μL纯化后的Mpro蛋白酶制成混合物，纯化后的Mpro蛋白酶在混合液中的终浓度为100nM；其次，加入1μL不同浓度的黄腐酚，黄腐酚的浓度分别为0、0.63、1.25、2.5、5、7.5、10、12.5、25μM，充分混匀，室温静置30分钟；接着，加入49μL反应缓冲液和1μL底物组成的混合物，底物在混合液中的终浓度为2μM；最后，使用多功能酶标仪测量，激发波长320nm，发射波长405nm，每30秒读数1次，连续记录15分钟，取线性区间内斜率作为V₀，并计算黄腐酚对Mpro蛋白酶的IC₅₀。

Ki测试方法为：首先，每孔加入48μL反应缓冲液(50mM Tris-HCl(pH 7.3)，1mMEDTA)和1μL纯化后的Mpro蛋白酶制成混合物，纯化后的Mpro蛋白酶在混合液中的终浓度为100nM；其次，加入1μL不同浓度的黄腐酚，黄腐酚的浓度分别为0、0.63、1.25、2.5、5、7.5、10、12.5、25μM，充分混匀，室温静置30分钟；接着，使用多孔道移液器分别加入49μL反应缓冲液和1μL底物(终浓度为2μM)的混合物和49μL反应缓冲液和1μL底物(终浓度为4μM)的混合物；最后，测定不同浓度的底物在黄腐酚存在时被酶水解的初速度，按Lineweaver-Burk作图，求出加入黄腐酚前后的Km及V_max，抑制常数Ki可通过两条直线斜率的比值求出。

(3)实验结果

黄腐酚的Mpro蛋白酶抑制活性测试试验结果发现，参阅附图3，黄腐酚对Mpro蛋白酶的IC₅₀为：4.97±1.79μM；参阅附图4，黄腐酚对Mpro蛋白酶的抑制常数Ki值为：2.14μM。

由上述实验结果得到的结论为：黄腐酚与新型冠状病毒主蛋白酶Mpro有较强的结合，黄腐酚具有抑制冠状病毒Mpro蛋白酶活性的作用，因此，黄腐酚具有防治新型冠状病毒引发肺炎的作用，可以在制备抗肺炎药物中进行应用。

对比例1氯喹对新型冠状病毒靶点Mpro蛋白酶抑制活性测试

磷酸氯喹(Chloroquine Phosphate)作为一款正在开展新冠病毒临床实验中的候选药物，初步显示出一定的治疗效果。在与黄腐酚相同的实验条件下，将磷酸氯喹对Mpro蛋白酶抑制活性进行测试试验。

参阅附图5，磷酸氯喹对Mpro蛋白酶的IC50为：11.95±0.54μM。因此，与磷酸氯喹相比，黄腐酚与新型冠状病毒主蛋白酶Mpro有更高的抑制活性，对防治新型冠状病毒引发肺炎的作用更强。

因此，本发明首先利用分子对接和分子模拟等方法预测了黄腐酚与新型冠状病毒主蛋白酶Mpro靶点的结合模式，接着，使用g_MMPBSA计算了黄腐酚与Mpro蛋白酶的结合自由能。通过酶活性测试实验验证了黄腐酚对Mpro蛋白酶的抑制作用，活性测试实验得到了黄腐酚对Mpro蛋白酶的IC50和Ki值；这表明黄腐酚能够结合在新型冠状病毒Mpro蛋白酶靶点的底物结合位点，抑制Mpro蛋白酶活性，从而抑制病毒的复制和转录；因此，黄腐酚具有预防和/或治疗新型冠状病毒炎症的作用，可以在制备预防和/或治疗新型冠状病毒炎症药物进行应用。

本发明以新型冠状病毒引发肺部等炎症的Mpro蛋白酶为靶点，通过基于结构的虚拟筛选得到了具有与Mpro蛋白酶结合能力强的抗病毒的活性化合物——黄腐酚。黄腐酚通过与靶点Mpro蛋白酶结合，抑制Mpro蛋白酶活性，从而抑制病毒的复制和转录，达到抗击新型冠状病毒感染的效应。黄腐酚可以在制备新型冠状病毒Mpro蛋白酶抑制剂中进行应用，黄腐酚也可以在制备新型冠状病毒抑制剂中进行应用，从而在制备预防和/或治疗新型冠状病毒炎症的药物中进行应用。本发明的黄腐酚与Mpro蛋白酶的平均结合自由能是-63.427KJ/mol，黄腐酚对Mpro蛋白酶的IC₅₀为4.97±1.79μM，黄腐酚对Mpro蛋白酶的抑制常数Ki值为2.14μM。

所以，与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明中黄腐酚与新型冠状病毒引发肺部等炎症靶点Mpro蛋白酶具有较强结合强度，能够抑制Mpro蛋白酶活性，进而抑制病毒的转录和复制，因而，可以利用黄腐酚制备靶向新型冠状病毒Mpro蛋白酶靶点抑制剂，也可以利用黄腐酚制备新型冠状病毒抑制剂，从而利用黄腐酚制备预防和/或治疗新型冠状病毒炎症的药物，这种药物对新型冠状病毒所致肺炎有潜在治疗作用。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。