阅读说明：本技术 去氧紫草素在制备宿主防御肽表达促进剂中的用途 (Application of deoxyshikonin in preparation of host defense peptide expression promoter ) 是由 王晶 季海峰 张伟 王四新 王雅民 于 2020-08-06 设计创作，主要内容包括：本发明“去氧紫草素在制备宿主防御肽表达促进剂中的用途”,属于化合物新用途,其特征在于,将去氧紫草素或其衍生物为药效活性成分制成需要的剂型；用于促进宿主防御肽基因上调表达；该化合物对多种宿主防御肽的表达均具有良好的促进作用,且不引起炎性反应,即具有调节宿主内源免疫,提高机体健康水平的能力,可作为新一代抗生素替代物的候选物。(The invention relates to an application of deoxyshikonin in preparing a host defense peptide expression promoter, belonging to a new application of a compound, and being characterized in that deoxyshikonin or a derivative thereof is used as a pharmacodynamic active ingredient to be prepared into a required dosage form; for promoting up-regulated expression of host defense peptide genes; the compound has good promotion effect on the expression of various host defense peptides, does not cause inflammatory reaction, namely has the capability of regulating the endogenous immunity of a host and improving the health level of an organism, and can be used as a candidate of a new generation of antibiotic substitutes.)

去氧紫草素在制备宿主防御肽表达促进剂中的用途

技术领域

本发明涉及化合物新用途技术，特别是去氧紫草素在制备宿主防御肽表达促进剂中的用途。

背景技术

宿主防御肽(Host defense peptides，HDPs)是机体先天免疫系统的重要效应分子，是机体抵抗外来致病菌侵袭的重要屏障。迄今为止，来源于动物的HDPs多达2385种(http://aps.unmc.edu/AP/main.php)。宿主防御肽是带有正电荷的两性小肽，能直接杀灭细菌、真菌和病毒，或抑制其生长。宿主防御肽还具有强大的免疫调节功能，包括刺激免疫细胞增殖、修饰相关基因表达、促进创面愈合、杀死癌细胞等。

诱导宿主内源HDPs的合成有益于机体对抗早期感染和炎症反应，因此通过营养手段调控内源HDPs表达以增强机体抗感染能力、提高畜禽肠道先天性免疫功能越来越被关注。尤其在养殖业中抗生素逐渐被限用和禁用的大背景下，研究开发提高动物免疫力和抗病力的新产品和策略迫在眉睫。

目前，具有HDPs诱导表达作用的候选物还较少，因此亟待研究和发现更多具有HDPs诱导表达作用的化合物。

发明内容

基于上述领域的需求，本发明的发明人利用细胞模型筛选得到了一种天然化合物去氧紫草素 (Deoxyshikonin)，并进行了猪体外细胞系和肠道组织宿主防御肽表达的验证试验，结果显示，该化合物对多种宿主防御肽的表达都有良好的促进作用，并能促进免疫细胞的抑菌活性。细胞水平实验显示，在其诱导宿主防御肽表达的有效浓度范围内不会引起炎性反应，可作为新一代抗生素替代物的候选物，因此，本发明请求保护以下技术方案：

去氧紫草素在制备宿主防御肽表达促进剂中的用途，其特征在于，将式I所示去氧紫草素或其衍生物为药效活性成分制成需要剂型的宿主防御肽表达促进剂；

所述宿主防御肽表达促进剂是指促进pBD1，pBD2，pBD3，pBD4，pBD123，pBD125，pBD129， pEP2C，PG1-5，PF1-2，PR-39，PMAP-23，PMAP-36和PMAP-37基因上调表达的制剂。

所述宿主防御肽表达促进剂的剂型为口服剂或注射剂。

所述宿主防御肽表达促进剂还包含药学上可接受的辅料。

本发明另一方面，提供式I所示去氧紫草素或其衍生物在制备饲用抗生素替代物的用途，其特征在于，以式I所示的去氧紫草素或其衍生物为活性成分制备成需要剂型的制剂。

所述饲用抗生素替代物的剂型为口服剂或注射剂。

所述饲用抗生素替代物还包含药学上可接受的辅料。

本发明再一方面，提供一种畜禽饲料添加剂，其特征在于，含有式I所示的去氧紫草素或其衍生物。

所述畜禽指仔猪，优选断奶仔猪。

基于上述成果，本发明提供一种断奶仔猪饲养方法，其特征在于，向其直接提供以式I所示的去氧紫草素或其衍生物为活性成分的口服制剂；或向其日粮中添加以式I所示的去氧紫草素或其衍生物为活性成分的制剂。

本发明发明人通过构建的高通量筛选筛选到的具有促进宿主防御肽上调表达作用的天然化合物去氧紫草素(Deoxyshikonin)，其结构式为：C₁₆H₁₆O₄，分子量为：272.3，CASNo.为：43043- 74-9，其述化学结构式如下式所示：是紫草的色素成分之一。

如

具体实施方式

部分的示例性实验数据显示，去氧紫草素能够诱导猪IPEC-J2细胞宿主防御肽pBD3基因表达。也能够诱导IPEC-J2细胞中宿主防御肽pBD2、pEP2C和PG1-5基因的表达。发明人进一步在猪空肠组织体外培养上验证了Deoxyshikonin诱导猪宿主防御肽表达的效果。

此外，发明人进行了抑菌试验，证实了采用Deoxyshikonin刺激后，猪肺泡巨噬细胞3D4/31 抑菌活性提高。最后发明人研究了Deoxyshikonin对促炎细胞因子表达的影响，结果显示，在能够提高宿主防御肽表达的浓度范围内，未观察到Deoxyshikonin引起炎症反应。

本发明筛选到的能够有效诱导猪肠道宿主防御肽表达的天然化合物去氧紫草素(Deoxyshikonin)，是常用中药材紫草的色素成分之一，将其作为饲用抗生素替代物提供给畜禽，无需担心其残留和安全性，其抗菌机理不是直接作用于病原菌，而是诱导宿主内源防御肽表达，从而提高抑菌活性和免疫功能，因此引起细菌耐药性的可能性非常小。综上，去氧紫草素 (Deoxyshikonin)有望开发为新型饲料添加剂，替代抗生素，满足现代畜牧业的需求。

附图说明

图1.Deoxyshikonin对pBD3基因的诱导表达效果

其中对照为不添加Deoxyshikonin的空白组，其余依次为相对于对照，Deoxyshikonin刺激终浓度为0.3125μM、0.625μM、1.25μM、2.5μM、5μM、10μM和20μM时引起的pBD3基因相对表达量；

图2.Deoxyshikonin对其它宿主防御肽的诱导表达效果

其中对照为不添加Deoxyshikonin的空白组，其余依次为相对于对照，Deoxyshikonin刺激终浓度0.3125μM、0.625μM、1.25μM、2.5μM、5μM、10μM和20μM时引起的pBD2、pEP2C 和PG1-5基因相对表达量；

图3.Deoxyshikonin对猪肠组织宿主防御肽的诱导表达效果

其中对照为不添加Deoxyshikonin的空白组，其余依次为相对于对照，去氧紫草素(Deoxyshikonin)刺激终浓度2.5μM、5μM和10μM时引起的pBD3、pBD2、pEP2C和PG1-5 基因相对表达量。

图4.猪肺泡巨噬细胞3D4/31经Deoxyshikonin处理后的抑菌活性

上图为携带F4菌毛的产肠毒素性大肠杆菌(F4⁺Enterotoxigenic Escherichiacoli，F4⁺ETEC) 的抑菌活性实验结果，下图为对金黄色葡萄球菌的抑菌活性实验结果。其中对照为不添加 Deoxyshikonin的空白组。

图5.Deoxyshikonin对促炎细胞因子表达的影响

其中白色柱形表示对照为不添加Deoxyshikonin的空白组，黑色柱形表示Deoxyshikonin处理细胞后促炎细胞因子IL-1β、IL-8和TNFα基因的相对表达量。

具体实施方式

实施例1.Deoxyshikonin的筛选获得

对属于生物碱、脂类、序萜、二萜、五环三萜、甾醇等30多种物质的1261种从植物、动物、微生物等中分离出的已知纯天然产物及其衍生物进行了筛选。

获得48种化合物在IPEC-J2/pBD3-luc稳定报告细胞中对pBD3基因具有诱导活性；通过剂量反应试验发现，其中，有21种化合物，其中包括Deoxyshikonin，在三种检测浓度(5μM、20μM、 80μM)中至少有一种浓度可使荧光素酶活性增加2倍以上。

实验试剂：

含有猪pBD3基因启动子的IPEC-J2/pBD3-luc荧光素酶报告细胞(记载于发明人发表的文章中：Deng，Z.，et al.2018.Development of a Cell-Based High-ThroughputScreening Assay to Identify Porcine Host Defense Peptide-InducingCompounds.Journal of Immunology Research，2018，5492941.)。

DMEM/F12培养基：购买自Gibco^TM，Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，USA。

购买自Gibco^TM，Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，USA。

待选化合物：购买自TargetMol，Boston，MA，USA。

筛选过程如下：

采用前期构建的含有猪pBD3基因启动子的IPEC-J2/pBD3-luc荧光素酶报告细胞，以2×10⁴个/孔接种，在96孔板上进行高通量筛选试验。采用的完全培养液组成为：DMEM/F12培养基+10％胎牛血清(FBS)+1％双抗(青霉素/链霉素)+1μg/mL嘌呤霉素。培养条件为37℃、5％CO₂。

细胞生长过夜贴壁之后，用终浓度为20μM的待选化合物进行刺激，培养24h后用L-Max II Luminescence Microplate Reader测定荧光素酶活性。在荧光素酶活性检测前4h加入以检测细胞活性。

采用Z-score的计算方法获得48个化合物的Z-score值大于2，说明这48个化合物有可能激活pBD3基因的启动子，从而引发其转录表达，可用于后续研究验证，其中包括Deoxyshikonin。

为了进一步验证上述48种化合物在IPEC-J2/pBD3-luc稳定报告细胞中对pBD3基因的诱导活性，发明人进行了剂量效应试验。其中，有21种化合物在三个检测浓度(5μM、2μM和80 μM)中至少在一个浓度上可使荧光素酶活性增加2倍以上。其中包括Deoxyshikonin。

表1天然化合物Deoxyshikonin筛选信息

*源自：MedChemExpress.URL(https://www.medchemexpress.cn/)

实施例2.Deoxyshikonin对pBD3基因的诱导表达效果在IPEC-J2细胞上的验证

实验试剂：

原始细胞系IPEC-J2：为健康仔猪小肠上皮细胞，由美国俄克拉荷马州立大学Guolong Zhang 惠赠，也可以通过其它商业途径获取该细胞系。

Deoxyshikonin原液：浓度为20mM，溶剂为二甲基亚砜(DMSO)，购买自TargetMol，Boston， MA，USA。

实验步骤：

1.IPEC-J2细胞的培养

IPEC-J2细胞培养采用DMEM/F12培养基，其完全培养液组成为：DMEM/F12培养基+10％胎牛血清(FBS)+1％双抗(青霉素/链霉素)。

将冻存细胞从液氮罐取出，迅速放入37℃水浴锅中解冻。在生物安全柜中，吸出细胞悬液完全转移至离心管内，加入4mL完全培养液稀释，1000×g离心7min，弃上清，加入完全培养液 10mL，轻轻吹打混匀细胞悬液，转移至10cm细胞培养皿内，置于37℃，5％CO₂细胞培养箱中培养。

待细胞贴壁生长至70～80％融合时用浓度为0.25％胰酶消化3～5min，加入5mL完全培养液终止消化后，经1000g离心7min，弃上清。用完全培养液重悬用于后续刺激或培养。

2.IPEC-J2细胞的刺激处理及检测

待培养细胞融合至70～80％时，消化计数，以1.25×10⁵个/孔的量接种于12孔细胞培养板中。贴壁过夜生长后进行刺激试验。

细胞刺激试验：Deoxyshikonin原液采用DMSO稀释到2mM后作为母液，母液按不同比例加入到12孔细胞培养板中的完全培养液中，得到刺激终浓度分别为0.375μM、0.75μM、1.25μM、 2.5μM、5μM、10μM和20μM。

细胞培养：处理结束后放入37℃，5％CO₂培养箱培养，培养时间为24h。

培养结束后，弃上清，用无菌PBS清洗3遍，每孔加入0.5mL RNAzol试剂，常温下裂解5 min，吹打完全后转移至1.5mL无RNA酶离心管内，-80℃保存。

细胞总RNA的提取：按试剂盒(RNAzol RT，Molecular Research Center，Cincinnati，OH， USA)说明书的步骤进行。使用NanoDrop分光光度计测定RNA浓度，按A260∶A280和A260∶A230 比值确定RNA质量。

使用iScript^TM cDNA合成试剂盒将1μg RNA反转录为cDNA。

采用iTaqTM UniversalGreen Supermix在QuantStudio 3 Real-Time PCR系统上进行 qPCR的测定。

相对表达量采用2^-ΔΔct法计算。

所使用的引物序列如下：

GAPDH，F：5′-GCTACACTGAGGACCAGGTTG(SEQ ID No.1)，

R：5′-CCTGTTGCTGTAGCCAAATTC(SEQ ID No.2)；

pBD3，F：5′-CCTTCTCTTTGCCTTGCTCTT(SEQ ID No.3)，

R：5′-GCCACTCACAGAACAGCTACC(SEQ ID No.4)。

3.检测结果

用原始细胞系IPEC-J2，进行了Deoxyshikonin诱导pBD3基因表达的验证。

结果显示，Deoxyshikonin能够诱导原始细胞系IPEC-J2细胞pBD3基因的表达，且呈明显的浓度梯度效应。

如图1所示，在Deoxyshikonin刺激终浓度为5μM时，pBD3基因的表达量达到最高，与空白对照相比提高了约23倍。

结果证明了用IPEC-J2/pBD3-luc荧光素酶报告细胞筛选出的化合物Deoxyshikonin对原始 IPEC-J2细胞系pBD3基因的诱导表达效果。

实施例3.Deoxyshikonin对其它宿主防御肽的诱导表达效果

细胞的培养和刺激，总RNA的提取，以及mRNA表达量的测定等同实施例2，所使用的引物序列如下：

GAPDH，F：5′-GCTACACTGAGGACCAGGTTG-3′(SEQ ID No.1)，

R：5′-CCTGTTGCTGTAGCCAAATT-3′C(SEQ ID No.2)；

pBD2，F：5′-TGTCTGCCTCCTCTCTTCC-3′(SEQ ID No.5)，

R：5′-AACAGGTCCCTTCAATCCTG-3′(SEQ ID No.6)；

PG1-5，F：5′-ACGGTGAAGGAGACTGTG-3′(SEQ ID No.7)，

R：5′-CGCAGAACCTACGCCTACAA-3′(SEQ ID No.8)；

pEP2C，F：5′-ACTGCTTGTTCTCCAGAGCC-3′(SEQ ID No.9)，

R：5′-TGGCACAGATGACAAAGCCT-3′(SEQ ID No.10)。

检测结果如下：化合物Deoxyshikonin除对猪IPEC-J2细胞宿主防御肽pBD3基因的表达具有诱导作用外，还对宿主防御肽pBD2基因，pEP2C基因和PG1-5基因的表达有明显诱导作用。

如图2所示，其中，与空白对照相比，Deoxyshikonin浓度为2.5μM、5μM和10μM时PG1- 5基因的表达量均提高了100倍以上，其中浓度为5μM时表达量最高，提高了近150倍。Deoxyshikonin对pBD2和pEP2C基因的诱导表达能力相对较低一些，在浓度为5μM和1.25μM时分别达到最高表达量，与空白对照相比分别提高了5.0倍和6.6倍。

结果说明，化合物Deoxyshikonin不仅对pBD3基因的表达具有诱导作用，还对其它HDPs具有显著的诱导表达效果。

实施例4.Deoxyshikonin在猪肠组织上对宿主防御肽的诱导表达效果

实验试剂：

RPMI1640：购买来源Gibco^TM，Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，USA。

HEPES：购买来源Solarbio Life Sciences，Beijing，China。

实验步骤：

1.猪肠组织的获取

仔猪空肠组织取自5周龄断奶仔猪(长白/大白；7.85±0.23kg)，断奶日龄为28天。仔猪屠宰后，取空肠中段，移除外肌层，用剪刀将其空肠组织剪至0.5×0.5cm²大小，用预冷的PBS充分冲洗后备用。

PBS中含有100μg/mL的庆大霉素、100U/mL的青霉素和100μg/mL的链霉素。

将剪切好的组织置于6孔细胞培养板中，加入4mL RPMI1640完全培养液进行培养。

其中RPMI1640完全培养液的组成为RPMI 1640+10％FBS+20mM HEPES+100μg/mL庆大霉素+100U/mL青霉素+100μg/mL链霉素。

2.猪肠组织的刺激处理及检测

用终浓度为2.5μM、5μM、10μM的Deoxyshikonin刺激猪空肠组织，每浓度3个重复。

猪肠组织培养条件为37℃、95％0₂+5％C0₂，培养时间为24h。

培养后移除上清，添加适量的RNAzol试剂充分裂解猪空肠组织，吹打完全后转移至1.5mL 无RNA酶离心管内，后续总RNA的提取同前述细胞总RNA的提取。

目的基因检测步骤同实施例2。

3.检测结果

结果如图3所示，Deoxyshikonin的添加同样能够诱导猪肠组织HDPs的表达。Deoxyshikonin 在浓度为2.5μM时对猪空肠组织pBD3基因的诱导表达效果最佳，且与空白对照差异显著。

浓度为2.5μM、5μM和10μM的Deoxyshikonin能显著诱导猪空肠组织PG1-5基因的表达，相对表达量均提高了近30倍以上。

Deoxyshikonin对猪空肠组织pBD2和pPE2C基因表达的诱导未达到显著水平，但均表现出提高的趋势。

结果说明，体外细胞筛选获得的化合物Deoxyshikonin，对模拟体内组织的猪肠组织宿主防御肽也具有诱导表达作用。

实施例5.猪肺泡巨噬细胞经Deoxyshikonin处理后的抑菌活性

实验试剂：

F4⁺ETEC：获取自中国兽医微生物菌种保藏管理中心(China Veterinary CultureCollection Center)，菌株编号CVCC225。

金黄色葡萄球菌：来自中国兽医微生物菌种保藏管理中心(China VeterinaryCulture Collection Center)，菌株编号CVCC546。

TSA/TSB培养基：出品。

3D4/31细胞：为猪肺泡巨噬细胞，由美国俄克拉荷马州立大学GuolongZhang惠赠，其也是常规细胞系，可以商购获得。

Hank’s平衡盐溶液(HBSS)：购自Gibco^TM，Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA。

实验步骤：

1.细菌的准备

抑菌试验所用致病菌为携带F4菌毛的产肠毒素性大肠杆菌(F4⁺EnterotoxigenicEscherichia coli，F4⁺ETEC，菌株编号CVCC225)和金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus，菌株编号 CVCC546)，分别代表革兰氏阴性致病菌和革兰氏阳性致病菌。

致病菌的培养使用TSA/TSB培养基。挑取从TSA平板上划线生长的原始菌落，放入3mL含有25mMNaHCO₃和1mM NaH₂PO₄的20％的TSB培养基中，250rpm，37℃震荡培养约2.5h。1000×g离心10min后弃上清，用上述培养基重悬后在OD₆₀₀下测定吸光度值，根据曲线公式(指吸光度值和实际菌数拟合的曲线)用上述培养基将细菌稀释至2.5×10⁵CFU/mL，备用。

2. 3D4/31细胞的培养、刺激和裂解液的制备

猪3D4/31细胞的培养采用RPMI1640培养基，其完全培养液组成为：RPMI1640培养基+ 10％胎牛血清(FBS)+1％双抗(青霉素/链霉素)+1mM丙酮酸钠。

3D4/31细胞解冻与培养步骤同IPEC-J2细胞。培养条件为37℃，5％C0₂。待3D4/31细胞培养至70～80％融合时，消化计数，以4×10⁵个/孔的量接种于12孔细胞培养板中。

过夜生长贴壁后用终浓度为5μM的Deoxyshikonin进行刺激，此时培养液更换为无抗生素培养液。培养24h后，收集所有细胞，用不含钙离子和镁离子的Hank’s平衡盐溶液清洗2次，之后用纯水重悬至100μL。

收集的细胞冻至-80℃的冰箱中20min后冰上解冻，超声裂解30s，12,000×g 4℃离心10 min后取上清备用。

3.抑菌检测

取50μL上述制备好的细胞裂解液，加入50μL步骤1制备好的细菌悬液，放入96孔板中 37℃培养。分别于3h、6h和12h在OD₆₀₀条件下测定细菌浊度。

4.检测结果

结果表明，Deoxyshikonin处理3D4/31细胞后能够提高其对革兰氏阴性致病菌(F4⁺ETEC) 和革兰氏阳性致病菌(金黄色葡萄球菌)的抑菌能力。

如图4所示，经终浓度为5μM的Deoxyshikonin处理后的细胞裂解液分别在3h和6h显著降低F4⁺ETEC的数量，在3h、6h和12h显著降低金黄色葡萄球菌的数量。

推测，Deoxyshikonin可能通过诱导3D4/31细胞产生抑菌物质宿主防御肽，降低了致病菌的数量。

实施例6.Deoxyshikonin对促炎细胞因子表达的影响

细胞的培养和刺激，总RNA的提取，以及mRNA表达量的测定等同实施例2。

所使用的引物序列如下：

GAPDH，F：5′-GCTACACTGAGGACCAGGTTG-3′(SEQ ID No.1)，

R：5′-CCTGTTGCTGTAGCCAAATTC-3′(SEQ ID No.2)；

IL-8，F：5′-TTCGATGCCAGTGCATAAATA-3′(SEQ ID No.11)，

R：5′-CTGTACAACCTTCTGCACCCA-3′(SEQ ID No.12)；

TNF-α，F：5′-CCCCTCTGAAAAAGACACCA-3′(SEQ ID No.13)，

R：5′-TCGAAGTGCAGTAGGCAGAA-3′(SEQ ID No.14)；

IL1β，F：5′-GCCCTGTACCCCAACTGGTA-3′(SEQ ID No.15)，

R：5′-CCAGGAAGACGGGCTTTTG-3′(SEQ ID No.16)。

检测结果显示：Deoxyshikonin对猪IPEC-J2细胞促炎细胞因子IL-1β、IL-8和TNFα的表达均未表现出诱导促进作用；

其中图5示例了浓度为5μM时，Deoxyshikonin对猪IPEC-J2细胞促炎细胞因子IL-1β，IL-8 和TNFα的相对表达量。

因此，可以推测，Deoxyshikonin在能够有效诱导宿主防御肽表达的浓度条件下不易引起肠道内的炎症反应，是理想的抗生素替代候选物，作为饲料添加剂添加，具有安全性。

SEQUENCE LISTING

<110> 北京市农林科学院

<120> 去氧紫草素在制备宿主防御肽表达促进剂中的用途

<130> P190848-NLK

<160> 16

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> GAPDH 正向引物

<400> 1

gctacactga ggaccaggtt g 21

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> GAPDH 反向引物

<400> 2

cctgttgctg tagccaaatt c 21

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> pBD3 正向引物

<400> 3

ccttctcttt gccttgctct t 21

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> pBD3 反向引物

<400> 4

gccactcaca gaacagctac c 21

<210> 5

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> pBD2 正向引物

<400> 5

tgtctgcctc ctctcttcc 19

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> pBD2 反向引物

<400> 6

aacaggtccc ttcaatcctg 20

<210> 7

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> PG1-5 正向引物

<400> 7

acggtgaagg agactgtg 18

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> PG1-5 反向引物

<400> 8

cgcagaacct acgcctacaa 20

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> pEP2C 正向引物

<400> 9

actgcttgtt ctccagagcc 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> pEP2C 反向引物

<400> 10

tggcacagat gacaaagcct 20

<210> 11

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> IL-8 正向引物

<400> 11

ttcgatgcca gtgcataaat a 21

<210> 12

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> IL-8 反向引物

<400> 12

ctgtacaacc ttctgcaccc a 21

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> TNF-α 正向引物

<400> 13

cccctctgaa aaagacacca 20

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<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

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<223> TNF-α 反向引物

<400> 14

tcgaagtgca gtaggcagaa 20

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<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

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<223> IL1β 正向引物

<400> 15

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<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> IL1β 反向引物

<400> 16

ccaggaagac gggcttttg 19