阅读说明：本技术 miR-325核酸类似物在制备治疗血窦内皮细胞病理性功能异常相关产品中的应用 (Application of miR-325 nucleic acid analogue in preparation of related product for treating pathological dysfunction of blood sinus endothelial cells ) 是由 李丽雅 刘文佳 于 2020-11-18 设计创作，主要内容包括：本发明提供了miR-325核酸类似物在制备治疗血窦内皮细胞病理性功能异常相关产品中的应用。通过miR-325直接和间接影响的信号通路,包括恢复细胞stabilin-2,PTPRM,YWHAQ等基因的表达,使血窦内皮细胞重新分化,促进血窦内皮细胞调节炎症,抗星状细胞激活的能力,从而使所述血管性病变得到有效缓解。(The invention provides application of miR-325 nucleic acid analogues in preparation of products related to treatment of pathological dysfunction of blood sinus endothelial cells. The signal path directly and indirectly influenced by miR-325, including the expression of genes such as cell stabilin-2, PTPRM, YWHAQ and the like, is restored, so that the endothelial cells of the blood sinuses are re-differentiated, the capacity of the endothelial cells of the blood sinuses to regulate inflammation and resist stellate cell activation is promoted, and the vascular lesion is effectively relieved.)

miR-325核酸类似物在制备治疗血窦内皮细胞病理性功能异 常相关产品中的应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及miR-325核酸类似物在制备治疗血窦内皮细胞病理性功能异常相关产品中的应用。

背景技术

血窦内皮细胞（sinusoidal endothelial cell，SEC）是无基底膜，具有窗孔（fenestrations）和筛板(sieve plates) 结构的特殊毛细血管内皮细胞。肝血窦内皮细胞（Liver sinusoidal endothelial cell，LSEC）主要通过窗孔和筛板结构超滤血液，实现快速的营养和物质交换，以满足健康肝脏的代谢需求。研究证实，LSEC可以抑制肝星状细胞的激活，从而抑制肝脏中胶原沉积的主要来源。此外LSEC通过表达，分泌，或响应肝细胞生长因子（HGF）,血管内皮细胞生长因子受体2（VEGFR2），趋化因子受体7（CXCR7）等受体和细胞因子控制肝脏实质细胞的扩增。LSEC也是肝脏细胞接触到流经肝脏血液的第一道免疫豁免屏障，血液中受炎性趋化因子募集来的炎性细胞需要黏附和穿越LSEC到达肝脏发挥作用。动物体内实验证实在无肝损伤情况下诱导LSEC内皮化病变后，LSEC丢失窗孔和筛板，上述功能紊乱，肝脏出现胶原沉积。因此，肝血窦内皮细胞在维持健康肝脏稳态方面发挥重要作用，同样在慢性肝损伤等导致的肝纤维化过程中扮演重要角色。临床上肝纤维化病人肝脏出现血管和血窦周的胶原沉积，病人出现乏力，食欲不振，肝功能异常程度较肝硬化低。由于病人并无明显的异常表现，导致诊断出肝功能异常时往往已经十分严重，常见一经诊断已为肝硬化或肝癌。然而，目前临床上治疗肝纤维化或肝硬化患者没有特效药，采用的常规方案只能针对肝病成因进行抗病毒等使肝脏胶原沉积进程减缓，或对肝纤维化的并发症进行保肝护肝治疗，而肝脏胶原沉积无法被逆转，肝脏正常功能难以恢复，发展到肝脏功能失代偿期的患者只有进行肝移植来尽可能延长生存期。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了miR-325核酸类似物在制备治疗血窦内皮细胞病理性功能异常相关产品中的应用。

为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

一方面，提供一种miR-325核酸类似物在制备治疗血窦内皮细胞病理性功能异常相关产品中的应用。

优选地，所述血窦内皮细胞病理性功能异常包含脑血窦内皮化病变、内分泌器官血窦内皮化病变、造血器官血窦内皮化病变或系统性血窦内皮化病变。

优选地，所述脑血窦内皮化病变相关疾病包括阿尔兹海默症、脑血管硬化。

优选地，所述内分泌器官血窦内皮化病变包括糖尿病、慢性肾炎、胰腺炎。

优选地，所述造血器官血窦内皮化病变包括衰老导致的造血障碍、再生障碍性贫血、骨髓炎或脾炎。

优选地，所述系统性血窦内皮化病变包括高血压、脉管炎、血管炎、血栓症或动脉粥样硬化。

第二方面，提供一种用于治疗血窦内皮细胞病理性功能异常的药物，所述药物包含治疗有效量的miR-325核酸类似物。

优选地，所述药物的活性组分包括miR-325核酸类似物和CXCR7激动剂。

优选地，所述miR-325核酸类似物浓度为20nM，所述CXCR7激动剂的浓度为300nM。

第三方面，提供上述的药物在调控蛋白mannose receptor、stabilin-2、alpha-SMA、F4/80、PTPRM或YWHAQ 表达水平方面的应用。

本发明第四方面，提供一种间充质干细胞有效性检测方法，包括以下步骤：在静脉注射间充质干细胞前，使用qPCR检测间充质干细胞或者其细胞外囊泡中miR-325表达水平（表达水平参考值：U6 Ct=19时，miR-325 Ct<30），确保间充质干细胞具备恢复血窦分化的能力。

本发明第五方面，提供一种用于治疗血窦内皮细胞病理性功能异常的间充质干细胞制剂，所述间充质干细胞制剂包含间充质干细胞，所述间充质干细胞经过miR-325转染。

本发明第六方面，提供一种用于治疗血窦内皮细胞病理性功能异常的药物，所述药物包含药物载体和miR-325核酸类似物，所述药物载体选自外泌体、脂质体或凋亡小体。

本发明第七方面，提供了一种改善肝内血窦细胞的抗胶原沉积功能从而抑制血管性病变的方法，包括以下步骤：使用上述的药物或间充质干细胞制剂对所述血管性病变病人进行静脉注射治疗。

本发明第八方面，提供了一种调控蛋白Mannose receptor，Stabilin-2，Alpha-SMA, F4/80，PTPRM，YWHAQ表达水平的方法，包括以下步骤：使用miR-325模拟物对所述蛋白Mannose receptor，Stabilin-2，PTPRM，YWHAQ表达水平异常的血窦细胞进行诱导分化，使其获得抑制星状细胞Alpha-SMA, 和巨噬细胞F4/80表达水平的能力。

优选地，所述诱导分化过程为：将离体的分化能力异常的血窦内皮细胞进行体外无菌培养，当所述骨血窦内皮细胞的融合度到达70%以上，去除正常细胞培养液，更换含miR-325模拟物的分化诱导液，向具有筛板结构的血窦内皮细胞方向诱导分化24小时到72小时即可。

上述分化能力异常的血窦内皮细胞的特征体现在：与正常血窦内皮细胞相比，细胞胞膜增厚，细胞胞膜表面的窗孔和筛板结构丢失或减少，细胞Mannose receptor，Stabilin-2表达水平低，PTPRM，YWHAQ表达水平高，细胞自身增殖能力减弱，细胞抑制巨噬细胞的能力减弱，细胞抑制星状细胞激活的能力减弱，细胞内Cell adhesion molecular信号通路异常。

相对于现有技术，本发明的有益效果在于：

衰老，慢性炎症，心血管疾病个体的组织中血窦内皮细胞出现病理性的去分化，该去分化状态被逆转后可以显著降低相应病变。本发明通过实验证明，使用miR-325核酸类似物可以逆转血窦内皮细胞的病理去分化状态，本发明采用miR-325核酸类似物静脉注射作用于血窦内皮细胞去分化状态的个体或者所述血管性病变个体，通过miR-325直接和间接影响的信号通路，包括恢复细胞stabilin-2, PTPRM, YWHAQ等基因的表达，使血窦内皮细胞重新分化，促进血窦内皮细胞调节炎症，抗星状细胞激活的能力，从而使所述血管性病变得到有效缓解；而且本发明采用了一种miR-325的核酸类似物，具有操作简单、成本低廉、效果显著等特点，实现了功能缺陷的血窦内皮细胞的重新分化，同时为临床上具有血窦去分化相关疾病的患者治疗提供潜在的思路和方案。

附图说明

图1A为实施例中肝病组扫描电镜拍摄的肝血窦内皮细胞表面，由于肝损伤导致丢失分化特征性结构；

图1B实施例中miR-325静脉注射的肝病组扫描电镜拍摄的肝血窦内皮细胞表面，重新出现多个分化特征性筛板结构；

图2A为实施例中组织的免疫荧光检测血窦分化标志物stabilin-2指示健康肝脏血窦分化情况；

图2B为实施例中组织的免疫荧光检测血窦分化标志物stabilin-2指示肝纤维化模型肝血窦的分化情况；

图2C为实施例中组织的免疫荧光检测血窦分化标志物stabilin-2指示miR-325类似物系统注射治疗后肝血窦分化情况；

图3A为实施例中健康肝脏中F4/80阳性巨噬细胞的分布情况；

图3B为实施例中血窦恢复前F4/80阳性巨噬细胞（炎症）的浸润情况；

图3C为实施例中血窦恢复后调节F4/80阳性巨噬细胞（炎症）的情况；

图4A为实施例中健康肝脏α-SMA阳性肝星状细胞分布情况；

图4B为实施例中血窦恢复前α-SMA阳性肝星状细胞（抗胶原分泌）的情况；

图4C为实施例中血窦恢复后抗α-SMA阳性肝星状细胞（抗胶原分泌）的情况；

图5实施例中正常组（WT），肝病组（PBS+CCl₄），miR-325静脉注射的肝病组(miR-325+CCl₄)的肝功水平；

图6为实施例中Western blot检测发育期肝再生相关信号active YAP在病理组，miR-325模拟物处理组，和miR-325抑制组中蛋白水平的表达情况。

具体实施例

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行详细地描述。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中细胞培养皿购自美国Corning公司。

下述实施例中的PBS缓冲液购自北京康为世纪生物科技有限公司。

下述实施例中的细胞培养基(DMEM培养基)购自美国gibco公司。

下述实施例中的谷草转氨酶(AST)活性检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所（96T，C010-2）。

下述实施例中的active YAP抗体购自美国Abcam公司（ab205270）。

下述实施例中的stabilin-2抗体购自MBL International公司（D317-3）。

下述实施例中的α-SMA抗体购自美国Abcam公司（ab5694）。

下述实施例中的F4/80抗体购自美国Abcam公司（ab111101）。

下述实施例中miR-325核酸类似物购自锐博生物，产品编号（miR40004640-4-5，miR10000771-1-5），纯度80%。

下述实施例中细胞培养条件可采用：CO₂浓度为5%，O₂浓度为20%，温度为37℃的加湿细胞培养箱。

实施例

一、血窦功能异常的检测：

1.血窦原代细胞分离培养后进行分化表征检测

将新鲜个体活检组织剪碎，用Liberase^TM溶解于2%胎牛血清的DMEM培养基中消化1小时，轻轻吹打成为单细胞，在含有10%的胎牛血清的DMEM培养基中培养，根据贴壁情况约4到7天后换液，得到贴壁伸展开的原代血窦内皮细胞。待培养到合适拍摄单个细胞的密度后（约20%），将培养皿中的细胞固定，脱水，喷金后，在扫描电镜下检测细胞表面是否已经丢失分化特征结构-筛板和窗孔，结果如图1A-图1B所示。

活检组织进行血窦分化和血窦功能标志物染色

取1平方厘米左右小块的较新鲜活检组织，用PBS冲洗干净血液，4%多聚甲醛在四度过夜固定。30%蔗糖溶液4度沉降1到2天后，进行冰冻切片，免疫荧光染stabilin-2, F4/80和α-SMA。结果如图2A-2C所示，分化异常的肝组织中血窦内皮细胞分化标志物stabilin-2（图2B）较健康肝脏（图2A）减少，而miR-325治疗后stabilin-2显著增多（图2C）；如图3A-3C所示，纤维化肝组织内F4/80阳性的巨噬细胞（图3B）较健康肝脏（图3A）增多显示炎症浸润增强，而miR-325治疗后F4/80（图3C）显著减少至接近健康肝脏水平；如图4A-4C所示，纤维化肝脏胶原的主要来源：活跃星状细胞标志物α-SMA（图4B）较健康肝脏（图4A）增多，而miR-325治疗后α-SMA（图4C）显著减少至接近健康肝脏水平。

进行血窦功能改善后的肝功检测

取静脉血，常温静置半小时后，将析出的上层血清转移至无菌Eppendorf管，4℃，2000rpm离心20分钟，小心不碰到管底的红细胞沉淀，将最终获得的血清转移至无菌Eppendorf管。取5微升血清，使用AST活性检测试剂盒进行常规AST活性检测，结果如图5所示，miR-325静脉注射的肝病组较对照肝病组血清中AST活性显著下调，提示肝功得到缓解。

二、miR-325核酸类似物或组合物治疗血窦功能异常相关的应用

1.去分化病理血窦的再生关键信号通路的检测

将新鲜个体活检组织剪碎，用Liberase^TM溶解于2%胎牛血清的DMEM培养基中消化1小时，轻轻吹打成为单细胞，在含有10%的胎牛血清的DMEM培养基中培养，根据贴壁情况约4到7天后换液，得到贴壁伸展开的原代血窦内皮细胞。待培养到合适取蛋白单个细胞的密度后（约80%），使用蛋白裂解液进行常规Western blot检测，如图6所示，经miR-325处理后原代血窦细胞中激活的YAP蛋白水平上调，提示发育期表达，调节器官大小的信号通路Hipposignaling被激活。

核算类似物或组合物治疗肝纤维化中的血窦异常

可以根据实施范例步骤一中检测结果判断功能异常严重程度，决定使用miR-325核酸类似物。具体实施即是对血窦功能异常相关的肝纤维化病患个体，进行静脉注射。miR-325核酸模拟物浓度为20nM。实施时，所述产品和斯达汀类药物，褪黑素，和其他干预血管功能的药物不可混用。表1为蛋白质谱检测的miR-325直接和间接调节的YWHAQ和PTPRM蛋白表达水平的变化情况，蛋白ID为所列蛋白在Uniprot数据库的唯一编号，蛋白名称为所列为蛋白常用名称，Mean_Ratio为所列蛋白的表达量之比（miR-325静脉注射的肝病组的均值比肝病组的均值），小于0.8为在miR-325注射后所列蛋白显著下调。

表1

蛋白ID	蛋白名称	Mean_Ratio	Pvalue	SD
					P28828	PTPRM	0.80	0.02323	0.073
P68254	YWHAQ	0.74	0.03696	0.122

以上所述，仅为本申请的

具体实施方式

，但本申请的保护范围并不局限于此，任何在本申请揭露的技术范围内的变化或替换，都应涵盖在本申请的保护范围之内。因此，本申请的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。