一种治疗中华囊状幼虫病的基因药物和制备及使用方法
阅读说明：本技术 一种治疗中华囊状幼虫病的基因药物和制备及使用方法 (Gene medicine for treating Chinese sacbrood and preparation and use method thereof ) 是由 王敦 余肖 于 2020-11-11 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种治疗中华囊状幼虫病的基因药物和制备及使用方法,其特征是：该药物是由CSBV-VP1-dsRNA溶液、PBS-S母液和水复配而成。本发明采用特异性的dsRNA和助剂复配,形成的基因药物组合能够有效且特异性地抑制中蜂囊状幼虫病病毒的复制,从而控制病害的发展与传播。本发明的一种治疗中华囊状幼虫病的基因药物属于生物制剂,对环境无污染、无药物残留,是防治中蜂囊状幼虫病的新型高效药剂。(The invention discloses a gene medicine for treating Chinese sacbrood and a preparation and use method thereof, which is characterized in that: the medicine is prepared by compounding CSBV-VP1-dsRNA solution, PBS-S mother solution and water. The invention adopts specific dsRNA and auxiliary agent to compound, and the formed gene drug combination can effectively and specifically inhibit the replication of Chinese bee sacbrood virus, thereby controlling the development and spread of diseases. The gene medicine for treating Chinese sacbrood disease belongs to a biological preparation, has no pollution to the environment and no medicine residue, and is a novel efficient medicine for preventing and treating Chinese sacbrood disease.)
技术领域
本发明属于经济昆虫病害防治领域，涉及一种治疗中华囊状幼虫病的基因药物和制备及使用方法。
背景技术
中蜂囊状幼虫病是危害我国中蜂产业的重要病害，主要发作于每年的3—4月份，SBV幼虫与成虫均可感染，特别是2-3日龄的蜜蜂幼虫。成虫感染CSBV后无明显症状，被感染后的蜜蜂幼虫则无法正常化蛹，体色从莹润的白色逐渐发黄、加深，幼虫表皮下会出现积液，虫体会慢慢干枯，最后变为深褐发黑的龙船状，所以又被蜂农称作“烂子病”、“龙船病”。中蜂囊状幼虫病的传播蔓延对于整个中华蜜蜂群体的影响是毁灭性的，甚至会导致整个蜂场的蜂群社会结构的崩塌、蜂群流失以及大量个体的死亡。因此迫切需要一种能够专门针对中华囊状幼虫病病毒的药物，用于解决上述问题。
发明内容
本发明的目的是提供一种治疗中华囊状幼虫病的基因药物和制备及使用方法，本发明是一种专门针对中蜂囊状幼虫病的基因药物。本发明针对CSBV全基因组中的VP1序列，应用特异性的dsRNA和助剂饲喂发病的蜂群，从根本上抑制病毒的复制，有效控制中蜂囊状幼虫病的危害。
本发明的技术方案是：一种治疗中华囊状幼虫病的基因药物，该基因药物至少包括：CSBV-VP1-dsRNA溶液、PBS-S母液和水复配而成。
进一步，所述的CSBV-VP1-dsRNA溶液、PBS-S母液和水是按如下配比，配制50mL的所述基因药物需要下述比例的原料复配而成：CSBV-VP1-dsRNA溶液中的dsRNA含量 100μg/mL-1000μg/mL、PBS-S母液百分比浓度为10%-50%，余量为水。
进一步，所述的CSBV-VP1-dsRNA溶液中的dsRNA含量 125μg/mL。
进一步，所述的PBS-S母液成分为蔗糖、氯化钠、维生素C、柠檬酸钠、磷酸氢二钠、山梨酸钾、磷酸二氢钾和氯化钾。
进一步，所述的基因药物在中华蜜蜂囊状幼虫病所发病的蜂箱中饲喂，在中华蜜蜂囊状幼虫病的发病各阶段皆可饲喂，每间隔1天饲喂1次，一共饲喂5次。
一种治疗中华囊状幼虫病的基因药物的制备方法：依次将配方量的CSBV-VP1-dsRNA溶液、PBS-S母液混合均匀，然后再添加配方量水，充分混合均匀装瓶即可。
进一步，所述的一种治疗中华囊状幼虫病的基因药物置于-20℃的条件下冷冻保存，开瓶前用力震荡摇匀，开启后蜂蜜水稀释10倍后饲喂。
本发明的有益效果是：本发明采用特异性的dsRNA和助剂复配，形成的基因药物组合能够有效且特异性地抑制中蜂囊状幼虫病病毒的复制，从而控制病害的发展与传播。由于本发明利用自然界中存在的微生物产物作为主要成分，不存在抗生素污染与化学药物残留问题，特别适合于中蜂囊状幼虫病的防治。同时，本发明可以采用常规饲喂即可。因此本发明具有无污染高效抑制病毒和施用方便的特点。
下面通过给出的具体实施例可以进一步清楚的说明本发明，但不作为对本发明的限定。
具体实施方式
所述的CSBV-VP1-dsRNA溶液：利用商业化的L4440-HT115 dsRNA表达系统构建出CSBV-VP1-dsRNA的表达菌，接种至LB液体培养基发酵2 h后加入IPTG诱导12h，然后在8000rpm的条件下3 min高速离心收集菌体；利用STE缓冲液（0.1M NaCl，10mM Tris HCl，1mMEDTA,PH 7.8）重悬后，超声波破碎细胞（频率为20 kHz，处理5 min）后，在12000 rpm，4℃的条件下高速离心，除去沉淀后，获得包含目的dsRNA的粗提液；加入无水乙醇至终浓度12%—20%，上样到用含有同样比例乙醇的STE缓冲液预平衡过的CC41纤维素层析柱中；用足量的含14%—18%乙醇的STE缓冲液冲洗层析柱，之后用STE缓冲液洗脱dsRNA，收集流出液；然后加入等量的预冷异丙醇与10%体积的NaAc溶液，12000rpm，在12000 rpm，4℃的条件下离心15分钟，用75%乙醇洗涤沉淀后，溶于TE缓冲液（10mM Tris HCl，1mM EDTA,PH 7.0）中。
PBS-S母液的中文名是：25%磷酸盐-蔗糖复合缓冲液。所述的1L的PBS-S母液包含：蔗糖50.0g、氯化钠16.0g、维生素C 10.0g、柠檬酸钠6.0g、磷酸氢二钠3.0g、山梨酸钾2.0g、磷酸二氢钾0.5g、氯化钾0.4g，溶于950mL的无菌水中，PH值调至6.5—7.4，定容至1000mL。
实施例1
一种治疗中华囊状幼虫病的基因药物，至少包括：CSBV-VP1-dsRNA溶液、PBS-S母液和水复配而成。
所述的CSBV-VP1-dsRNA溶液、PBS-S母液和水是按如下配比，配制50mL的一种治疗中华囊状幼虫病基因药物需要下述比例的原料复配而成：CSBV-VP1-dsRNA溶液中的dsRNA含量100μg/mL-1000μg/mL、PBS-S母液百分比浓度为10%—50%，余量为水。
制备方法是：依次将配方量的CSBV-VP1-dsRNA溶液、PBS-S母液混合均匀，然后再添加配方量水，充分混合均匀装瓶即可。
优选地，所述的CSBV-VP1-dsRNA溶液中的dsRNA含量 125μg/mL。
实施例2
配制50mL的一种治疗中华囊状幼虫病的基因药物：
取实施例1上述CSBV-VP1-dsRNA溶液1mL，加入PBS-S母液5mL，补水至50mL，充分混合均匀装瓶即可。（终浓度分别为：目的dsRNA含量为2.5mg/L，PBS-S母液含量为10%）。
实施例3
配制50mL的一种治疗中华囊状幼虫病的基因药物：
取实施例1上述CSBV-VP1-dsRNA溶液2mL，加入PBS-S母液10mL，补水至50mL，充分混合均匀装瓶即可。（终浓度分别为：目的dsRNA含量为5.0mg/L，PBS-S母液含量为20%）。
实施例4
配制50mL的一种治疗中华囊状幼虫病的基因药物：
取实施例1上述CSBV-VP1-dsRNA溶液4mL，加入PBS-S母液15mL，补水至50mL，充分混合均匀装瓶即可。（终浓度分别为：目的dsRNA含量为10mg/L，PBS-S母液含量为30%）。
实施例5
配制50mL的一种治疗中华囊状幼虫病的基因药物：
取实施例1上述CSBV-VP1-dsRNA溶液8mL，加入PBS-S母液20mL，补水至50mL，充分混合均匀装瓶即可。（终浓度分别为：目的dsRNA含量为20mg/L，PBS-S母液含量为40%）。
实施例6
配制50mL的一种治疗中华囊状幼虫病的基因药物：
取实施例1上述CSBV-VP1-dsRNA溶液16mL，加入PBS-S母液25mL，补水至50mL，充分混合均匀装瓶即可。（终浓度分别为：目的dsRNA含量为40mg/L，PBS-S母液含量为50%）。
上述实施例中的原料，CSBV-VP1-dsRNA溶液为本研究室自行发酵提取生产以外，其它材料均可以直接从市场购得。
药物疗效测定
本发明一种治疗中华囊状幼虫病的基因药物的实施例1-6，以中华蜜蜂囊状幼虫病（中华蜜蜂）为治疗对象，开瓶前用力震荡摇匀，开启后用蜂蜜水稀释10倍饲喂，在中囊病发病期施用，每间隔1天饲喂1次，一共饲喂5次。最后一次施药完成2周后，统计防治。本发明所述的一种治疗中华囊状幼虫病的基因药物置于-20℃的条件下冷冻保存。
（1）本发明一种治疗中华囊状幼虫病的基因药物工作液配制：
供试药剂：一种治疗中华囊状幼虫病的基因药物
加入适量蜂蜜后，按以下处理，每组3个发病蜂箱1个重复，每种处理3个重复：
a) 对照组：在傍晚饲喂等量的蜂蜜水。
b) 防治组：在傍晚饲喂加过蜂蜜的一种治疗中华囊状幼虫病的基因药物，每箱饲喂100mL-150mL即可。（防治组为5组，依次分别为实施例2－6的一种治疗中华囊状幼虫病的基因药物）。
c) 一种治疗中华囊状幼虫病的基因药物饲喂2周后，统计蜂箱中巢脾幼虫发病率与子脾封盖率。
（2）本发明一种治疗中华囊状幼虫病的基因药物防治效果：
对中蜂囊状幼虫病的控制作用
针对中华蜜蜂中常见的中蜂囊状幼虫病，一种治疗中华囊状幼虫病的基因药物最后一次施用2周后，打开蜂箱检查各个巢脾中发病幼虫的数量以及子脾的封盖数，最后计算出幼虫感病率与子脾封盖率，结果如表1与表2所示：实施例2－6都对中蜂囊状幼虫病产生了很好的控制作用，相比蜂蜜水对照，目的dsRNA对中蜂囊状幼虫病产生了很强的防治效果，用药后的子脾封盖率均在90%以上，最高达95.9%。
表1用药后的蜜蜂幼虫的感病率
表2用药后的子脾封盖率
上述防治效果说明本发明的一种治疗中华囊状幼虫病的基因药物，在生产中防治中华蜜蜂囊状幼虫病的效果显著。因为传统的化学药剂防治中蜂囊状幼虫病极易造成严重的药物残留，对于蜂产品影响极大，而且容易对蜂群造成不良刺激造成逃蜂离群的现象。本发明的一种治疗中华囊状幼虫病的基因药物，不仅能够有效防治中蜂囊状幼虫病，同时可以显著减少化学药剂的使用，减少蜂产品中的药物残留。对于提高蜂产品的质量，保护中华蜜蜂这一种质资源具有非常重要的现实意义。
所述的一种治疗中华囊状幼虫病的基因药物在发生中蜂囊状幼虫病的蜂箱中施用，发病的各个阶段皆可施用，每间隔1天饲喂1次，一共饲喂5次。
所述的一种治疗中华囊状幼虫病的基因药物开瓶前用力震荡摇匀，开启后用蜂蜜水稀释10倍饲喂。
本发明的优点是：（1）无污染高效抑制病毒：本发明利用特异性的dsRNA和助剂复配，形成的基因药物组合能够有效地抑制中蜂囊状幼虫病的发作，由于该发明利用自然界中存在的微生物产物作为主要成分，不存在抗生素污染与化学药物残留问题（2）施用方便：采用常规饲喂即可。
本发明利用特异性的dsRNA和助剂新技术，是一种生物体内本身存在的RNAi机制的绿色防治技术。应用特异性的dsRNA和助剂饲喂发病的蜂群，从根本上抑制病毒的复制，有效控制中蜂囊状幼虫病的危害。