阅读说明：本技术 一种高灵敏度的单组分tmb显色液及其制备方法 (High-sensitivity single-component TMB color developing solution and preparation method thereof ) 是由 周志鹏 于 2020-10-23 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种高灵敏度的单组分TMB显色液,包括以下组分：聚乙烯醇0.001g/L-20g/L,木糖0.16g/L-30g/L,柠檬酸1mM-100mM,乙二胺四乙酸二钠1mM-20mM,30％过氧化氢水溶液1mM-10mM,TMB 1mM-3mM,DMSO 20ml/L-30ml/L,Proclin300 0.04％,磷酸氢二钠1mM-25mM,超纯水定容至1L。一种高灵敏度的单组分TMB显色液的制备方法,包括以下步骤：步骤一：试剂母液配制：1.1：50g/L低粘度聚乙烯醇1788配制：准确称取5g 1788低粘度型聚乙烯醇于烧杯中,加入适量超纯水,置于65℃恒温水浴锅中,通过玻璃棒持续搅拌使颗粒分散均匀,溶解后继续保温2小时,超纯水定容至100ml,使用0.45μm滤膜过滤。本发明具有检测本底低的特点,有效提高了低浓度样本的检出率,不需要进行传统A液、B液的混合,为用户的操作提供了便利,使得本发明整体上具有突出性的进步。(The invention discloses a high-sensitivity single-component TMB color developing solution, which comprises the following components: 0.001-20 g/L of polyvinyl alcohol, 0.16-30 g/L of xylose, 1-100 mM of citric acid, 1-20 mM of ethylene diamine tetraacetic acid, 1-10 mM of 30% aqueous hydrogen peroxide, 1-3 mM of TMB, 20-30 ml/L of DMSO, 3000.04% of proclin, 1-25 mM of disodium hydrogen phosphate and the volume of ultrapure water is up to 1L. A preparation method of high-sensitivity single-component TMB color developing solution comprises the following steps: the method comprises the following steps: preparing a reagent mother solution: 1.1: 50g/L of low-viscosity polyvinyl alcohol 1788: accurately weighing 5g of 1788 low-viscosity polyvinyl alcohol in a beaker, adding a proper amount of ultrapure water, placing in a constant-temperature water bath kettle at 65 ℃, continuously stirring through a glass rod to uniformly disperse particles, continuously preserving heat for 2 hours after dissolution, fixing the volume of the ultrapure water to 100ml, and filtering by using a 0.45 mu m filter membrane. The invention has the characteristic of low detection background, effectively improves the detectable rate of low-concentration samples, does not need to mix the traditional liquid A and the traditional liquid B, provides convenience for the operation of users, and makes the invention have prominent progress on the whole.)

一种高灵敏度的单组分TMB显色液及其制备方法

技术领域

本发明涉及TMB显色液技术领域，尤其涉及一种高灵敏度的单组分TMB显色液及其制备方法。

背景技术

在酶联免疫吸附测定试验(ELISA)中，辣根过氧化物酶(HRP)催化过氧化物分解，释放出氧气，将显色液底物氧化，溶液变蓝。加入强酸后终止反应，蓝色溶液变黄，在450nm处有最大吸收峰，通过测量该吸光度值，结合标准曲线显色情况，便可定量计算出被检测物的含量。

常用的显色液底物有邻苯二胺(OPD)，2,2'-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS)及3,3',5,5'-四甲基联苯二胺(TMB)，研究表明，OPD有潜在的致癌性，而ABTS在显色灵敏度上表现不佳，而TMB作为一种新型安全的色原试剂，以显色高效、无毒、不致癌及稳定性好等特点，成为ELISA检测的主流显色剂。

由于TMB易被空气环境中氧气及溶液中过氧化物氧化，所以TMB显色液的生产受到一定限制；当前市售的EILSA试剂盒所采用的TMB显色液大多数为双组分，分为A液和B液，这最大限度的减少了TMB与过氧化物的接触，保证了显色液的稳定性，但该显色液使用时需先预混合，给操作造成不便，同时混合液使用后丢弃，造成一定程度的浪费。市售的ELISA试剂盒也有采用单组分TMB显色液的，但现有单组分TMB显色液存在存储时间短、显色背景高等问题；在检测低目的蛋白表达丰度的样本时，显色背景高将直接导致样本难以被检测，造成部分漏检情况。

综上所述，需要一种高灵敏度的单组分TMB显色液及其制备方法来解决现有技术中所存在的不足之处。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供了一种高灵敏度的单组分TMB显色液及其制备方法，旨在解决上述TMB显色液存在存储时间短、显色背景高以及样本难以被检测，造成部分漏检等问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种高灵敏度的单组分TMB显色液，包括以下组分：聚乙烯醇0.001g/L-20g/L，木糖0.16g/L-30g/L，柠檬酸1mM-100mM，乙二胺四乙酸二钠1mM-20mM，30％过氧化氢水溶液1mM-10mM，TMB 1mM-3mM，DMSO 20ml/L-30ml/L，Proclin3000.04％，磷酸氢二钠1mM-25mM，超纯水定容至1L。

进一步的，所述单组分TMB显色液采用柠檬酸和磷酸氢二钠缓冲液，且缓冲液的pH值为3.1-3.6。

进一步的，所述聚乙烯醇为1788低粘度型聚乙烯醇，且聚乙烯醇的聚合度为1700，醇解度为88％。

一种高灵敏度的单组分TMB显色液的制备方法，包括以下步骤：

步骤一：试剂母液配制：

1.1：50g/L聚乙烯醇配制：准确称取5g 1788低粘度型聚乙烯醇于烧杯中，加入适量超纯水，置于65℃恒温水浴锅中，通过玻璃棒持续搅拌使颗粒分散均匀，溶解后继续保温2小时，超纯水定容至100ml，使用0.45μm滤膜过滤；

1.2：TMB母液配制：准确称取TMB粉末于离心管中，加入适量的DMSO，涡旋振荡使其充分溶解，并在避光条件下待用；

1.3：其他试剂分别按照配方所用浓度要求配制；

步骤二：TMB体系配制：

2.1：首先在烧杯中加入适量超纯水，加入1788低粘度型聚乙烯醇母液，接着在磁力搅拌器上搅拌均匀，再依次加入木糖、柠檬酸及乙二胺四乙酸二钠，搅拌混匀；

2.2：然后，加入30％过氧化氢水溶液并搅拌均匀；

2.3：随后，将烧杯用锡箔纸包裹住，加入TMB母液并搅拌均匀；

2.4：接着，加入Proclin300并搅拌混匀，用磷酸二氢钠溶液调整体系pH值为3.1-3.6，超纯水定容至1L；

2.5：最后，使用0.22μm尼龙滤膜过滤，获得均一溶液，保存在棕色塑料瓶中，密封避光2-8℃存储。

进一步的，所述TMB显色液配制过程采用配制母液的方式配制各个组分，且木糖除外，再按次序混合。

进一步的，所述TMB显色液配制过程所使用的烧杯、玻璃棒以及超纯水均经过高温高压灭菌处理。

进一步的，所述TMB体系配制的前一个组分混匀后再添加后一个。

进一步的，所述尼龙滤膜为有机溶剂耐受型。

本发明的有益效果：

1、本发明中，通过单组分TMB显色液，具有检测本底低的特点，有效提高了低浓度样本的检出率；并且采用1788低粘度型聚乙烯醇，聚合度为1700，醇解度为88％，对人体无毒，具有良好的生物相容性，可用作稳定剂、分散剂等，溶解度良好，成本较低，同时，使用1788低粘度型聚乙烯醇能够更好的满足制备需求；

2、本发明中，TMB显色液为单组分液，不需要进行传统A液、B液的混合，为用户的操作提供了便利，使得本发明整体上具有突出性的进步。

附图说明

图1为按照表2数据绘制随存储时间变化的显色活性趋势图。

具体实施方式

实施例1：

一种高灵敏度的单组分TMB显色液，包括以下组分：聚乙烯醇0.2g/L，木糖2g/L，柠檬酸10mM，乙二胺四乙酸二钠2mM，30％过氧化氢水溶液4mM，TMB 2.5mM，DMSO 20ml/L，Proclin3000.04％，磷酸氢二钠2.5mM，超纯水定容至1L。

进一步的，单组分TMB显色液采用柠檬酸和磷酸氢二钠缓冲液，且缓冲液的pH值为3.3。

进一步的，聚乙烯醇为1788低粘度型聚乙烯醇，且聚乙烯醇的聚合度为1700，醇解度为88％。

一种高灵敏度的单组分TMB显色液的制备方法，包括以下步骤：

步骤一：试剂母液配制：

1.1：50g/L聚乙烯醇配制：准确称取5g 1788低粘度型聚乙烯醇于烧杯中，加入适量超纯水，置于65℃恒温水浴锅中，通过玻璃棒持续搅拌使颗粒分散均匀，溶解后继续保温2小时，超纯水定容至100ml，使用0.45μm滤膜过滤；

1.2：TMB母液配制：准确称取TMB粉末于离心管中，加入适量的DMSO，涡旋振荡使其充分溶解，并在避光条件下待用；

1.3：其他试剂分别按照配方所用浓度要求配制；

步骤二：TMB体系配制：

2.1：首先在烧杯中加入适量超纯水，加入1788低粘度型聚乙烯醇母液，接着在磁力搅拌器上搅拌均匀，再依次加入木糖、柠檬酸及乙二胺四乙酸二钠，搅拌混匀；

2.2：然后，加入30％过氧化氢水溶液并搅拌均匀；

2.3：随后，将烧杯用锡箔纸包裹住，加入TMB母液并搅拌均匀；

2.4：接着，加入Proclin300并搅拌混匀，用磷酸二氢钠溶液调整体系pH值为3.3，超纯水定容至1L；

2.5：最后，使用0.22μm尼龙滤膜过滤，获得均一溶液，保存在棕色塑料瓶中，密封避光2-8℃存储。

进一步的，TMB显色液配制过程采用配制母液的方式配制各个组分，且木糖除外，再按次序混合。

进一步的，TMB显色液配制过程所使用的烧杯、玻璃棒以及超纯水均经过高温高压灭菌处理。

进一步的，TMB体系配制的前一个组分混匀后再添加后一个。

进一步的，尼龙滤膜为有机溶剂耐受型。

实施例2：

对实施例1所配制的单组分TMB显色液与市售的单组分TMB进行对比，采用杭州联科生物技术股份有限公司人γ干扰素ELISA试剂盒(目录号：70-EK180-96)、大鼠血管内皮生长因子ELISA试剂盒(目录号：70-EK383-96)分别进行人血清样本及大鼠血清样本检测验证(不采用试剂盒中TMB显色液)；严格按照产品说明书进行操作，在显色时，分别加入100μl/孔市售TMB及实施例1中配制的TMB；显色结束后，按100μl/孔加入终止液；使用酶标仪进行双波长检测，测定450nm最大吸收波长和570nm或630nm参考波长下的OD值。校准后的OD值为450nm的测定值减去570nm或630nm的测定值；人γ干扰素样本结果见下表1，大鼠血管内皮生长因子样本结果见下表2：

表1：采用实施例1中配制的TMB与某知名厂家单组分TMB对Human IFN-γ进行样本检测对比。

表2：采用实施例1中配制的TMB与某知名厂家单组分TMB对Rat VEGF进行样本检测对比。

根据表1、表2可知，由实施例1所配制的单组分TMB显色液比市售的单组分TMB相比，Human IFN-γ样本检出率由37.5％提高到50％；Rat VEGF样本检出率由56.3％提高到75％，说明了本专利配方的TMB能检测出更多的低浓度样本，具有更高的检测灵敏度。

实施例3：

将实施例1中所述的单组分TMB显色底物置于4℃进行显色活性及本底实时测试，分别测试0个月、3个月、6个月、12个月、18个月和24个月；具体实施方法如下：

以链霉亲和素标记的辣根过氧化物酶(SA-HRP)(5μg/ml)稀释800倍作为最高浓度R1，使用超纯水按四倍倍比稀释的方式进行稀释，得到后续两个浓度梯度，R2及R3；按50μl/孔加入到96孔酶标板一列中，使用超纯水作为阴性对照，各孔分别加入50μl TMB显色液，振荡孵育5-10分钟，加入100μl 0.2M硫酸进行终止；使用酶标仪进行双波长检测，测定450nm最大吸收波长和570nm或630nm参考波长下的OD值，校准后的OD值为450nm的测定值减去570nm或630nm的测定值。

使用各个时间节点的显色OD值除以“0个月”相应浓度下的OD值，得到显色活性百分比，以R1，R2，R3的活性百分比绘制活性曲线(见图1)。

表3：采用实施例1中配制的TMB在特定时间点测定固定浓度SA-HRP显色情况。

	0个月	3个月	6个月	9个月	12个月	18个月	24个月
								R1	1.610	1.591	1.596	1.597	1.603	1.575	1.550
R2	0.195	0.190	0.197	0.191	0.186	0.185	0.182
								R3	0.028	0.027	0.028	0.028	0.027	0.029	0.027
Blank	0.006	0.005	0.007	0.007	0.006	0.008	0.007

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换或改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。