一种牙周致病菌感染标记物检测试剂盒和检测方法
阅读说明：本技术 一种牙周致病菌感染标记物检测试剂盒和检测方法 (Detection kit and detection method for periodontal pathogen infection marker ) 是由 农高惠 何林声 于 2020-12-18 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种牙周致病菌感染标记物检测试剂盒,包括样本洗脱液、髓过氧化物酶检测试剂和牙龈蛋白酶检测试剂,样本洗脱液为三羟甲基氨基甲烷、3-吗啉丙磺酸、4-羟乙基哌嗪乙磺酸、哌嗪-N,N’-二(2-乙磺酸)或2-(N-吗啡啉)乙磺酸水溶液；髓过氧化物酶检测试剂包括氧化酶、氧化酶对应的底物和显色剂A,氧化酶和其对应的底物相遇后能够产生过氧化氢,显色剂A包括Trinder反应色原底物；牙龈蛋白酶检测试剂为牙龈蛋白酶检测试剂I或II,牙龈蛋白酶检测试剂I包括底物BAEE、乙醇氧化酶和显色剂B,显色剂B包括过氧化物酶和Trinder反应色原底物；牙龈蛋白酶检测试剂II包括BANA和重氮盐显色剂。(The invention discloses a detection kit for periodontal pathogen infection markers, which comprises a sample eluent, a myeloperoxidase detection reagent and a gingipain detection reagent, wherein the sample eluent is aqueous solution of tris (hydroxymethyl) aminomethane, 3-morpholine propanesulfonic acid, 4-hydroxyethyl piperazine ethanesulfonic acid, piperazine-N, N' -di (2-ethanesulfonic acid) or 2- (N-morpholine) ethanesulfonic acid; the myeloperoxidase detection reagent comprises oxidase, a substrate corresponding to the oxidase and a color-developing agent A, wherein the oxidase can generate hydrogen peroxide after meeting with the substrate corresponding to the oxidase, and the color-developing agent A comprises a Trinder reaction chromogen substrate; the gingival protease detection reagent is a gingival protease detection reagent I or II, the gingival protease detection reagent I comprises a substrate BAEE, an alcohol oxidase and a color-developing agent B, and the color-developing agent B comprises a peroxidase and a Trinder reaction chromogen substrate; the gingival protease detection reagent II comprises BANA and a diazonium salt color developing agent.)
技术领域
本发明涉及生物和医学检测技术领域，具体涉及一种牙周致病菌感染标记物检测试剂盒和检测方法。
背景技术
阿尔茨海默症(AD)是一种中枢神经退行性疾病，占老年性痴呆中的60-70％。临床主要表现为渐进性记忆障碍、认知功能障碍、人格改变及语言障碍等神经精神症状。特征性病理改变为β淀粉样蛋白(Aβ)沉积形成的细胞外老年斑，tau蛋白过度磷酸化形成的神经细胞内神经原纤维缠结(NFT)，以及神经元丢失伴胶质细胞增生等。
AD的确切病因和病机仍未完全阐明，但都认同AD的发生是遗传因素和环境因素共同作用的结果，感染是主要的环境因素，中枢神经系统的炎症反应在AD的发生和发展中起着关键作用。
已明确与AD相关的感染病原体包括病毒、细菌、螺旋体等，其中最重要且研究较透彻的是牙周致病菌，主要包括牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis，Pg)、齿垢密螺旋体(Treponema denticola，Td)、伴放线聚集杆菌(Aggregatibacteractinomycetemcomitans，Aa)、中间普氏菌(Prevotella intermedia，Pi)、具核梭杆菌(Fusobacterium nucleatum，Fn)等，这些菌都是革兰阴性厌氧菌，正常情况下可以菌斑生物膜的形式定植在牙菌斑处。当牙周局部免疫防御屏障破坏而感染时，牙周致病菌大量增殖，并释放牙龈蛋白酶等多种毒性产物，刺激局部中性粒细胞渗出，破坏牙龈和牙周组织，引起牙龈炎和牙周炎(合称牙周病)。病原菌及其毒性产物、中性粒细胞释放的胞外酶、炎症介质等可通过多种机制，引起中枢神经系统特征性病理改变。因此，牙周致病菌感染是AD发生的启动因子和病情恶化的促进因子。牙周致病菌感染的控制，对AD预防、AD病情发展控制措施的制订有重大指导意义。
通常临床通过神经精神症状特点、特征性病理标记物对AD进行诊断。例如通过对Aβ、Tau蛋白的检测来支持AD的诊断，通过对特定基因(如淀粉样蛋白前体蛋白基因(APP)、早老素1、2基因突变(PS1、PS2))的检测来判定家族性早发型AD的风险高低，通过对载脂蛋白APOE4基因的检测来作为散发性AD的确诊依据。
牙周致病菌的感染标志物包括病原菌标志物、炎症标志物两类。
病原菌标记物包括病原菌个体、基因、毒性产物三类。病原菌个体主要包括上述Pg、Td、Aa、Pi、Fn等牙周致病菌，常规通过培养法检测，但不能反映感染菌数量；致病菌特有基因可通过PCR检测，但也不能反映感染菌数量；致病菌的毒性产物包括脂多糖、蛋白酶、凝集素A等，其中的牙龈蛋白酶(gingipain)为牙周致病菌共有，可采用酶化学法、免疫学法检测，可定量，可直接反映感染菌数量。
炎症标记物包括中性粒细胞和炎症介质两种。中性粒细胞形态特殊，含特异酶(如弹性蛋白酶、碱性磷酸酶、髓过氧化物酶、β-葡萄糖苷酶、胶原酶(基质金属蛋白酶-8，MMP-8))，可通过形态学观察法、酶化学法、免疫学法等定量检测，标本中的中性粒细胞数量能直接反映局部炎症的严重程度。炎症介质包括细胞因子(如白细胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(tumornecrosis factor-α，TNF-α)、γ-干扰素(Interferon-γ，IFN-γ))和前列腺素E2(prostaglandinE2，PGE2)等，可用采用免疫学方法检测，可定量，能间接反映局部炎症程度。
当前AD的实验室检查仅限于特征性病理标志物检查，未对AD相关的感染标志物进行检测，检测结果仅对该病的诊断有支持作用，对该病的预防、病情发展的控制等治疗措施制订缺乏指导意义。
发明内容
本发明的一个目的是针对上述现有技术中存在的问题，提供一种牙周致病菌感染标记物检测试剂盒，包括样本洗脱液、髓过氧化物酶检测试剂和牙龈蛋白酶检测试剂，
所述样本洗脱液为三羟甲基氨基甲烷、3-吗啉丙磺酸、4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)、哌嗪-N,N'-二(2-乙磺酸)或2-(N-吗啡啉)乙磺酸(MES)的水溶液，优选4-羟乙基哌嗪乙磺酸或者2-(N-吗啡啉)乙磺酸的水溶液；
所述髓过氧化物酶检测试剂包括氧化酶、所述氧化酶对应的底物和显色剂A，所述氧化酶和其对应的底物相遇后能够产生过氧化氢，所述显色剂A包括Trinder反应色原底物；
所述牙龈蛋白酶检测试剂为牙龈蛋白酶检测试剂I或牙龈蛋白酶检测试剂II，
所述牙龈蛋白酶检测试剂I包括特异底物N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯(BAEE)、乙醇氧化酶和显色剂B，所述显色剂B包括过氧化物酶和Trinder反应色原底物，优选所述过氧化物酶为辣根过氧化物酶(HRP)；
所述牙龈蛋白酶检测试剂II包括特异底物N-苯甲酰-L-精氨酸萘酰胺(bengoyl-DL-arginine-naphthlamide，BANA)和重氮盐显色剂。
所述Trinder反应色原底物为氧化偶联底物对或者氧化还原色原；
所述氧化偶联底物对为底物A和底物B组成的底物对，所述底物A为4-氨基安替比林(4-AAP)或者3-甲基-2-苯并噻唑啉酮腙(MBTH)，所述底物B选自苯酚、3-羟基-2,4,6-三溴苯甲酸(TBHBA)、N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3-甲基苯胺钠盐(TOOS)、N-乙基-N-(3-磺丙基)-3-甲基苯胺钠盐(TOPS)、3,5-二氯-2-羟基苯磺酸钠(DHBS)、N-乙基-N-(3-磺丙基)-3-甲氧基苯胺钠盐一水合物(ADPS)、N-(2-羟基-3-磺丙基)-3-5-二甲氧基苯胺钠盐(HDAOS)中的一种；优选所述氧化偶联底物对为4-AAP和TBHBA组合，或者MBTH和TBHBA组合；
所述氧化还原色原选自3,3'-二氨基联苯胺(DAB)、3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)、3,3′,5,5′-四甲基联苯胺二盐酸盐(TMB.2HCL)、2,2'-二氮-双(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)(ABTS)中的一种，优选TMB.2HCl。
优选地，所述髓过氧化物酶检测试剂中的氧化酶为葡萄糖氧化酶、乙醇氧化酶、尿酸氧化酶或胆固醇氧化酶中的一种，所述氧化酶对应的底物为葡萄糖、乙醇、尿酸或胆固醇。
优选地，所述重氮盐显色剂选自固蓝B、固蓝BB盐、固蓝RR盐、固紫B盐、固红B、固深红GBC或者固黑K盐，优选固黑K盐。
优选地，所述样本洗脱液的浓度为20mMol/L–50mMol/L；
所述髓过氧化物酶检测试剂中所述氧化酶、氧化酶对应的底物、Trinder反应色原底物的用量比为0.1-0.5U﹕0.25-1mg﹕0.1-1mg；
所述牙龈蛋白酶检测试剂I中特异底物BAEE、乙醇氧化酶、过氧化物酶和Trinder反应色原底物的用量比为0.25-1mg﹕0.1-0.5U﹕0.02-0.2mg﹕0.1-1mg；
所述牙龈蛋白酶检测试剂II中特异底物BANA和重氮盐显色剂用量比为0.25-1mg﹕1.5-5mg。
优选地，所述髓过氧化物酶检测试剂和牙龈蛋白酶检测试剂均还包括海藻糖和Proclin-300；
所述髓过氧化物酶检测试剂中氧化酶、海藻糖的用量比为0.1-0.5U﹕0.1-1mg；
所述牙龈蛋白酶检测试剂中特异底物与海藻糖的用量比为0.25-1mg﹕0.1-1mg。
作为优选地，所述试剂盒的载体包括微孔板、样本洗脱液瓶、牙龈蛋白酶显色液瓶、髓过氧化物酶显色液瓶，
所述微孔板上设置有至少一组微孔，一组微孔包括两个微孔，其中一个微孔上包被牙龈蛋白酶检测孔包被液I或牙龈蛋白酶检测孔包被液II，另一个微孔上包被髓过氧化物酶检测孔包被液；
所述牙龈蛋白酶检测孔包被液I含有：特异底物BAEE、乙醇氧化酶、过氧化物酶、氧化偶联底物对的底物之一、去离子水；优选还含有海藻糖；
与牙龈蛋白酶检测孔包被液I对应的牙龈蛋白酶显色液瓶中含有：氧化偶联底物对的另外一个底物、去离子水；优选还含有Proclin-300；
所述牙龈蛋白酶检测孔包被液II含有：特异底物BANA、去离子水；优选还含有海藻糖；
与牙龈蛋白酶检测孔包被液II对应的牙龈蛋白酶显色液瓶中含有：重氮盐显色剂、去离子水；优选还含有Proclin-300；
所述髓过氧化物酶检测孔包被液含有：氧化酶、氧化偶联底物对的底物之一、去离子水；优选还含有海藻糖；
所述髓过氧化物酶显色液瓶中含有：氧化酶对应的底物、氧化偶联底物对的另外一个底物、去离子水；优选还含有Proclin-300；
所述样本洗脱液瓶中含有样本洗脱液。
在上述技术方案中，所述微孔板上包被牙龈蛋白酶检测孔包被液I的微孔中，包被有：特异底物BAEE 0.25-1mg/孔、乙醇氧化酶0.1-0.5U/孔、过氧化物酶0.02-0.2mg/孔、氧化偶联底物对的底物之一0.1-1mg/孔、海藻糖0-1mg/孔；与牙龈蛋白酶检测孔包被液I对应的牙龈蛋白酶显色液瓶中含有如下浓度的组分：0.05-0.15g/L的氧化偶联底物对的另外一个底物、0-0.03ml/L的Proclin-300；
所述微孔板上包被牙龈蛋白酶检测孔包被液II的微孔中，包被有特异底物BANA0.25-1mg/孔、海藻糖0-1mg/孔；与牙龈蛋白酶检测孔包被液II对应的牙龈蛋白酶显色液瓶中含有如下浓度的组分：30mg-100mg/L的重氮盐显色剂、0-0.03ml/L的Proclin-300；
所述微孔板上包被髓过氧化物酶检测孔包被液的微孔中，包被有：氧化酶0.1-0.5U/孔、氧化偶联底物对的底物之一0.1-1mg/孔、海藻糖0-1mg/孔；所述髓过氧化物酶显色液瓶中含有如下浓度的组分：10-30g/L的氧化酶对应的底物、0.05-0.15g/L的氧化偶联底物对的另外一个底物、0-0.03ml/L的Proclin-300；
所述样本洗脱液浓度为20mMol/L–50mMol/L；
优选所述Proclin-300的浓度均为0.01-0.03ml/L，所述海藻糖的浓度均为0.1-1mg/孔。
优选地，所述微孔板上的微孔容积为100-150ul。
本发明的另一目的在于提供一种牙周致病菌感染标记物检测方法，采用上述的试剂盒进行检测，采集牙菌斑或龈沟液待测样本，用样本洗脱液将待测样本从采样工具表面洗脱得到洗脱样本，将洗脱样本加入微孔板上的微孔内，然后加显色液瓶中的显色液，反应10-50分钟进行显色，
根据颜色变化即可判断待测样本在是否含有牙龈蛋白酶和髓过氧化物酶；
优选样本洗脱液的使用量为150-200ul/人份样本，显色液用量为30ul/孔。
本发明根据酶化学显色法原理设计试剂盒，可以以微孔板、样本处理液、显色液组合的形式提供，用于龈沟液或牙菌斑样本的牙龈蛋白酶和中性粒细胞特异酶的联合检测，通过颜色变化可判定待测物相对浓度。
所述的酶化学显色法原理为：待测酶催化特异底物分解，产生新产物；新产物与指示系统偶联显色，或与重氮盐系统偶联显色，颜色深浅与待测物浓度成正比。
牙龈蛋白酶检测试剂I中，待测样本中的牙龈蛋白酶与特异底物BAEE反应生成乙醇，乙醇在乙醇氧化酶的作用下产生过氧化氢，过氧化氢与过氧化物酶使得Trinder反应色原底物显色。
牙龈蛋白酶检测试剂II中待测样本中的牙龈蛋白酶与特异底物BANA反应后的产物促使重氮盐显色剂显色。
髓过氧化物酶检测试剂中氧化酶和其对应的底物相遇后产生过氧化氢，待测样本中的髓过氧化物酶在过氧化氢的作用下使得Trinder反应色原底物显色。
试剂中海藻糖作为稳定剂，Proclin-300作为防腐剂。
所述的显色结果可表现为蓝色、绿色、红色、紫色、灰色、黑色或其它颜色，肉眼可识别。
微孔板的微孔数根据单板可检测的人份数设定，可为4孔-22孔，分别用于1-10人份的同时检测，微孔体积可以为100-150ul。
本发明的有益效果是：本发明的试剂盒可以同时检测病原菌标志物、炎症标志物两类牙周致病菌的感染标志物，可以同时检测出是否感染病菌并且是否发生炎症，判断是否有牙周病，并且可以判断病原菌标志物、炎症标志物的相对含量，从而判断牙周病严重程度，非常适合于临床牙周病快速诊断。通过对病原菌标志物的检测，可以进行AD罹患风险评估，以便提前干预，预防AD发生；还可以进行AD病情进展关联指标评估，制订相应措施，防止病情恶化。
附图说明
图1是本发明的试剂盒对牙龈卟啉单胞菌的检测结果图。
图2是本发明的试剂盒对中性粒细胞髓过氧化物酶质控酶-辣根过氧化物酶的检测结果图。
图3是本发明试剂盒对牙周病患者牙菌斑样本的检测结果图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明，但并不因此而限制本发明。
下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。
主要试剂：
N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯BAEE(CAS:2645-08-1)
N-苯甲酰-L-精氨酸萘酰胺BANA(CAS：913-04-2)
4-氨基安替比林4-AAP(CAS:83-07-8)
3-甲基-2-苯并噻唑啉酮腙(MBTH)(CAS:1128-67-2)
3-羟基-2,4,6-三溴苯甲酸(TBHBA)(CAS:14348-40-4)
固黑K盐(CAS:27766-47-8)
Proclin-300:液体生物防腐剂
HRP：辣根过氧化物酶
MES:2-(N-吗啡啉)乙磺酸(CAS:4432-31-9)
以上试剂均为本领域常规试剂，可商购获得。
实施例中所用菌株为：牙龈卟啉单胞菌菌株，BNCC 337441，可商购获得。
实施例中所用培养基为哥伦比亚血平板。
实施例中其余试剂如未表明，均为本领域常规试剂，也可商购获得。
实施例1
配制下面的试剂供本发明各实施例中的检测实验使用。
一、样本洗脱液的制备
按以下组方配制样本洗脱液
MES 4.26g
去离子水 100ml
调节pH至6.5放置2-8℃冷藏备用。
二、微孔板微孔包被和对应显色液配制
按照表1所示配制检测孔包被液和对应的显色液：
表1
空白微孔板也称反应卡，可以从市面上直接购买得到。微孔板由底板和板盖组成，底板上设置有多个放置滤纸片的凹槽(即微孔)，使用前先在底板装入滤纸片，滤纸片用于附着包被液。
用包被液对微孔板的微孔进行包被：包被液包被微孔时，10ul包被液/孔，加入包被液后冷冻真空干燥，铝箔袋密封包装，放置2-8℃冷藏备用。不同的微孔可以包被不同的包被液，以检测牙龈蛋白酶或者髓过氧化物酶。
制成的微孔板可以分为单项目包被型和组合项目包被型两种。单项目包被型微孔板的所有微孔都用同种包被液(检测牙龈蛋白酶或检测髓过氧化物酶的包被液)包被，用于实施例中质控菌株、质控酶的试验；组合项目包被型微孔板的第1、3孔包被检测牙龈蛋白酶包被液，第2、4孔包被检测髓过氧化物酶的包被液，用于临床样本检测实施例中的试验。
实施例2对质控菌株-牙龈卟啉单胞菌菌株牙龈蛋白酶的检测
1.菌种扩增：
a)阳性菌株：牙龈卟啉单胞菌菌株复苏后，转种于哥伦比亚血琼脂平板，置厌氧袋，37℃恒温培养5-7天，直至培养基表面出现黑色菌落；
b)阴性菌株：甲型链球菌菌株复苏后，转种于哥伦比亚血琼脂平板，置37℃恒温培养24-48小时，直至培养基出现草绿色溶血菌落；
2.制备0.5个麦氏浊度单位菌液：分别刮取阳性菌株、阴性菌株放入无菌生理盐水中，调整浓度至0.5个麦氏浊度单位；
3.制备不同浓度菌液：按0.5麦氏浊度单位相当于1.5*108CFU/ml计算，用样本洗脱液分别稀释制备1*107、1*106、1*105、1*104、1*103、1*102、1*101、0CFU/ml菌液；
4.检测：用包被有牙龈蛋白酶检测孔包被液I的单项目包被型微孔板进行试验，第1-9孔分别加1.5*108、1*107、1*106、1*105、1*104、1*103、1*102、1*101、0CFU/ml菌液30ul，然后加入牙龈蛋白酶检测孔包被液I对应的显色液30ul；
4. 37℃恒温培养箱放置20min，观察微孔颜色变化。
结果显示，除0CFU/ml无颜色变化外，其余微孔由无色变紫红色，颜色深浅与菌液浓度成正比，菌液浓度为1*103CFU/ml时肉眼即可见明显的颜色变化。结果如图1所示，微孔右侧数字代表菌液浓度，0CFU/ml的为阴性对照。
实施例3对牙龈蛋白酶质控酶-胰蛋白酶的检测
1.制备浓缩质控液：用样本洗脱液配制256u/ml的胰蛋白酶酶液；
2.制备不同浓度的质控品：用样本洗脱液对浓缩质控液进行稀释，制备胰蛋白酶酶浓度分别为浓度为256u/ml、128u/ml、64u/ml、32u/ml、16u/ml、8u/ml、4u/ml、2u/ml、1u/ml、0.5u/ml的质控品；
3.用包被有牙龈蛋白酶检测孔包被液II的单项目包被型微孔板进行试验，第1-9孔分别加浓度为64u/ml、32u/ml、16u/ml、8u/ml、4u/ml、2u/ml、1u/ml、0.5u/ml、0u/ml的质控品30ul，牙龈蛋白酶检测孔包被液II对应的显色液30ul；
4. 37℃恒温培养箱放置20min，观察微孔颜色变化。
结果显示，除0u/ml孔无颜色变化外，其余微孔由橙红色变为蓝黑色，颜色深浅与胰蛋白酶浓度成正比，酶浓度2u/ml时肉眼即可见明显的颜色变化。由于胰蛋白酶和牙龈蛋白酶采用本发明的检测试剂盒能引起一样的显色反应，因此在生产中，可以用市售商品胰蛋白酶作为本发明的牙龈蛋白酶检测试剂的质控酶，用于检测本发明的牙龈蛋白酶检测试剂是否有效。
实施例4对中性粒细胞髓过氧化物酶质控酶-辣根过氧化物酶的检测
1.制备浓缩质控液：用样本洗脱液配制256u/ml的辣根过氧化物酶酶液；
2.制备不同浓度的质控品：用样本洗脱液对浓缩质控液进行稀释，制备辣根过氧化物酶浓度分别为256u/ml、128u/ml、64u/ml、32u/ml、16u/ml、8u/ml、4u/ml、2u/ml、1u/ml、0.5u/ml、0u/ml的质控品；
3.用包被髓过氧化物酶检测孔包被液I的单项目包被型微孔板进行试验，第1-9微孔分别加64u/ml、32u/ml、16u/ml、8u/ml、4u/ml、2u/ml、1u/ml、0.5u/ml、0u/ml的质控品30ul，髓过氧化物酶检测孔包被液I对应的显色液30ul；
4.37℃恒温培养箱放置20min，观察微孔颜色变化。
结果如图2所示，除0u/ml孔无颜色变化外，其它微孔均由无色变蓝紫色，颜色深浅与辣根过氧化物酶浓度成正比，1u/ml时肉眼可见明显的颜色变化。由于辣根过氧化物酶和髓过氧化物酶采用本发明的检测试剂盒能引起一样的显色反应，因此在生产中，可以用市售商品辣根过氧化物酶作为本发明的髓过氧化物酶检测试剂的质控酶用于检测本发明的髓过氧化物酶检测试剂是否有效。
实施例5对牙周病患者牙菌斑样本的检测
1.专科医师用无菌牙签采集已确诊牙周病患者龈下牙菌斑样本，放入样本管内；
2.加入样本洗脱液200ul，将带样牙签在样本洗脱液内反复碾压振洗等方式使牙菌斑脱落，再用洗液枪吸嘴将牙菌斑吹打分散得到待测样本液；
3.检测：用第1、3孔包被有牙龈蛋白酶检测孔包被液I，第2、4孔包被有髓过氧化物酶检测孔包被液II的组合项目包被型微孔板进行试验，使用未加采集样本的样本洗脱液作为对照，每个微孔加入30ul待测样本液或者对照，然后加入30ul对应的显色液。37℃恒温培养箱放置20min，观察微孔颜色变化。
结果如图3所示，牙周病患者样本液在牙龈蛋白酶检测孔(第1、3孔)呈紫红色，在髓过氧化物酶检测微孔(第2、4孔)呈蓝色，非牙周病患者样本液(图3上标注为S3)及对照孔无颜色变化。
实施例6临床样本检检测
取医院临床龈下牙菌斑样本36份，其中确诊为牙周病的样本26份，其它口腔疾病的样本10份。采用本发明的微孔板试剂盒对该36份样本进行检测，微孔板上包被有牙龈蛋白酶检测孔包被液I和髓过氧化物酶检测孔包被液I，每两个微孔为一组检测孔，其中一个微孔包被牙龈蛋白酶检测孔包被液I，另一个微孔包被髓过氧化物酶检测孔包被液I。
将龈下牙菌斑样本放入样本管内，加入样本洗脱液150ul，将带样牙签在样本液内反复碾压振洗等方式使牙菌斑脱落，再用洗液枪吸嘴将牙菌斑吹打分散得到待测样本液。取待测样本液30ul加入包被牙龈蛋白酶检测孔包被液I的微孔中，另取待测样本液30ul加入包被髓过氧化物酶检测孔包被液I的微孔中，37℃恒温培养箱放置20min，观察两个微孔的颜色变化。
结果显示：临床确诊为牙周病的26份样本，每组检测孔的两个微孔的牙龈蛋白酶检测孔颜色都由无色变为紫色/紫红色，髓过氧化物酶检测孔的颜色由无色变为蓝紫色，显示样本中牙龈蛋白酶、髓过氧化物酶都检测为阳性。另外10份其它口腔疾病的样本中，牙龈蛋白酶检测微孔均未发生颜色变化，髓过氧化物酶检测孔有3份显色，对该显色样本镜检，发现有中性粒细胞。
用本发明试剂盒检测结果与临床结果相符合，说明本发明试剂盒可以应用于牙龈蛋白酶和髓过氧化物酶同时检测，从而确诊是否为牙周病，还可以根据颜色深浅判断感染的严重程度，由于牙周致病菌感染是AD发生的启动因子和病情恶化的促进因子，因此通过本发明的试剂盒检测还能进行AD罹患风险评估，以便提前干预，预防AD发生；还可以进行AD病情进展关联指标评估，制订相应措施，防止病情恶化。
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