阅读说明：本技术 紫花地丁指纹图谱的检测方法 (Method for detecting fingerprint spectrum of Chinese violet ) 是由 郑艳萍 刁和芳 成俊 赵开军 于 2020-10-31 设计创作，主要内容包括：本发明公开了紫花地丁指纹图谱的检测方法,紫花地丁指纹图谱建立包括以下步骤：步骤1、紫花地丁供试品溶液的制备；步骤2、参照物的制备的制备：步骤3、分别精密吸取供试品溶液注入液相色谱仪,记录色谱图；步骤4,将步骤3中获得的紫花地丁供试品溶液的指纹图谱导出,并导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A；选择不同批次紫花地丁的色谱图中均存在的色谱峰作为共有峰；用平均值计算法生成紫花地丁的对照指纹图谱,并以2号峰为参照峰,计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积。本发明所提供的紫花地丁指纹图谱,能全面,客观地表征紫花地丁的质量。本发明提供的指纹图谱的检测方法具有方法简便、稳定、精密度高、重现性好等优点。(The invention discloses a method for detecting a viola yedoensis fingerprint, which comprises the following steps of: step 1, preparing a test solution of Chinese violet; step 2, preparation of reference substance: step 3, precisely absorbing the test solution to be injected into a liquid chromatograph, and recording a chromatogram; step 4, exporting the fingerprint of the viola philippica test sample solution obtained in the step 3, and importing the viola philippica test sample solution into a traditional Chinese medicine chromatographic fingerprint similarity evaluation system 2004A; selecting chromatographic peaks existing in chromatograms of Chinese violet in different batches as common peaks; and generating a control fingerprint of the viola yedoensis by using an average value calculation method, and calculating the relative retention time and the relative peak area of each common peak by using the No. 2 peak as a reference peak. The fingerprint spectrum of the Chinese violet provided by the invention can comprehensively and objectively characterize the quality of the Chinese violet. The fingerprint detection method provided by the invention has the advantages of simplicity, convenience, stability, high precision, good reproducibility and the like.)

紫花地丁指纹图谱的检测方法

技术领域

本发明涉及一种中药的检测方法，具体涉及紫花地丁指纹图谱的检测方法。

背景技术

紫花地丁，味苦、辛、寒，无毒；归心、肝经，可入药，其性寒味微苦，清热解毒，凉血消肿。主治黄疸、痢疾、乳腺炎、目赤肿痛、咽炎；外敷治跌打损伤、痈肿、毒蛇咬伤等。

紫花地丁有效成分复杂，主要含黄酮类、香豆素类、有机酸类、糖类等有效成分。现有技术分析紫花地丁常采用高效液相色谱测定其个别有效成分，且分析时间长，不能全面全面、客观、准确的评价紫花地丁的质量。

发明内容

发明目的：本发明的目的是解决现有技术的不足，提供一种紫花地丁的指纹图谱检测方法，该检测方法可以客观、全面、准确的评价紫花地丁的质量，对控制紫花地丁的质量和保证临床疗效具有重要意义。

技术方案：为了实现上述目的，本发明采取的技术方案为：

一种紫花地丁指纹图谱的检测方法，包括以下步骤：

步骤1、紫花地丁供试品溶液的制备：

精密称取不同批次的紫花地丁药材粉末，置具塞锥形瓶中，加入甲醇，称重，超声提取，冷却至室温，称重，以甲醇补足减失的重量，摇匀，静置，取上清过0.45μm微孔滤膜，取续滤液，即得；

步骤2、参照物的制备：选择内标物作为参照物，参照峰为2号峰；

步骤3、精密吸取供试品溶液，注入高效液相色谱仪，记录色谱图；

步骤4，将步骤3中获得的紫花地丁供试品溶液的指纹图谱导出，并导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A；选择不同批次紫花地丁的色谱图中均存在的色谱峰作为共有峰；用平均值计算法生成紫花地丁的对照指纹图谱，并以2号峰为参照峰，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积。

作为优选方案，以上所述的紫花地丁指纹图谱的检测方法，步骤1：精密称取紫花地丁药材粉末1.0g，置250ml具塞锥形瓶中，加入80ml的80％甲醇，称重，超声30min，冷却至室温，称重，以80％甲醇补足减失的重量，摇匀，静置，取上清过0.45μm微孔滤膜，取续滤液，即得得供试品溶液。

作为优选方案，以上所述的紫花地丁指纹图谱的检测方法，步骤2的内标物为秦皮乙素。

作为优选方案，以上所述的紫花地丁指纹图谱的检测方法，步骤3中，液相色谱条件为：色谱柱：YMC-Pack ODS-A柱，规格250×4.6mm,5μm；流动相：乙腈为A相，0.1％磷酸水溶液为B相，流速：0.8mL/min，柱温30℃，梯度洗脱，检测波长为330nm梯度洗脱程序如下表：

。

作为优选方案，以上所述的紫花地丁指纹图谱的检测方法，指纹谱图中共有峰6个。

指纹图谱检测条件的优化实验：

1、供试品溶液的制备方法的筛选

本发明通过对不同提取方法(超声提取法、回流、渗漉等)及不同提取溶剂(甲醇、水、70％乙醇水溶液、80％乙醇水溶液、90％乙醇、无水乙醇)、进行紫花地丁提取实验比较，结果发现超声提取与回流提取所得的紫花地丁谱图差异较小，且超声提取效率高，有效成分种类多，故采用超声提取的方法；另外本发明对提取溶剂的考察中发现80％甲醇提取物色谱图信息量最多，成分含量最高；所以选用80％甲醇进行提取。

2、在色谱条件进行筛选实验

本发明筛选了提取254nm、280nm、300nm、330nm处的色谱图，发现检测波长为330nm时，80％甲醇提取物色谱图所包含的信息量最全面且基线平稳，故选330nm为检测波长；

并且，本发明对流速(1mL/min、0.8mL/min、0.7mL/min、0.6mL/min、0.5mL/min)进行筛选，故高流速下无法将其分开，故在低流速下分离效果较好，最终在流速为0.8mL/min进行梯度条件下将极性相似的物质分开。

本发明比较了乙腈-0.1％磷酸水，乙腈和0.05％磷酸水，甲醇-水，乙腈-水，乙腈-0.1％甲酸5个不同洗脱系统在不同梯度下的洗脱效果。结果发现以乙腈-0.1％磷酸水为流动相时，紫花地丁中各成分能达到很好的分离效果，故最终选定以乙腈和水，为流动相。因紫花地丁中的成分中多存在多个极性接近的黄酮、有机酸及其它极性极为相似的香豆素成分，采用等度洗脱无法达到良好的分离度，本发明通过大量实验筛选不同的梯度洗脱，最终得到的最佳梯度洗脱程序为：0mim,90％B、0至20min，90％至80％B、20至40min，80％至75％B、40至52min,75％至70％B，52至52.01min，70％至90％B、52.01至60min，90％至90％B。

有益效果：

1、本发明根据紫花地丁中所含的活性成分的结构性质特点，通过大量实验筛选出最佳的流动相组成，梯度洗脱程序、流速、检测波长、色谱柱和柱温等分析条件，经多次实验验证表明，本发明提供的紫花地丁指纹图谱检测方法，可以全面、客观、准确的检测和评价紫花地丁的质量，为保证临床紫花地丁疗效具有重要意义。

2、本发明提供的紫花地丁指纹图谱的检测方法，具有方法简便、稳定性好、精密度高、重现性好等优点。

附图说明

图1为本发明16批次紫花地丁样品的指纹图谱。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例用到的仪器与试剂如下：

实验器材

1.1仪器

日本岛津公司双波长扫描高液相色谱系统，包括全自动在线脱气系统，全自动进样系统SIL-20A，紫外检测器SPD-20A和自动温控柱温箱CTD-20AC，KH-500E型超声波清洗器(昆山禾创超声仪器有限公司)，ML104/02电子分析天平(Mettler Toledo)。

1.2药品与试剂

紫花地丁样品来源见表1；甲醇(分析纯)；乙腈(色谱纯)；水(娃哈哈纯净水)。

表1紫花地丁样品信息表

样品标号	批号	厂家
			S1	191201	南京中山制药有限公司
S2	191202	南京中山制药有限公司
			S3	191203	南京中山制药有限公司
S4	191204	南京中山制药有限公司
			S5	191205	南京中山制药有限公司
S6	200101	南京中山制药有限公司
			S7	200102	南京中山制药有限公司
S8	200201	南京中山制药有限公司
			S9	200202	南京中山制药有限公司
S10	200401	南京中山制药有限公司
			S11	200402	南京中山制药有限公司
S12	200502	南京中山制药有限公司
			S13	200502	南京中山制药有限公司
S14	200601	南京中山制药有限公司
			S15	200602	南京中山制药有限公司
S16	200603	南京中山制药有限公司

。

实施例1一种紫花地丁指纹图谱的检测方法，包括以下步骤：

步骤1、紫花地丁供试品溶液的制备：

精密称取以上表1的16批次的紫花地丁药材粉末1.0g，置250ml具塞锥形瓶中，加入80ml的80％甲醇，称重，超声30min，冷却至室温，称重，以80％甲醇补足减失的重量，摇匀，静置，取上清过0.45μm微孔滤膜，取续滤液，即得得供试品溶液；

步骤2、参照物的制备：选择内标物秦皮乙素作为参照物，参照峰为2号峰；

步骤3、精密吸取供试品溶液，注入高效液相色谱仪，记录色谱图；

步骤4，将步骤3中获得的16批次紫花地丁供试品溶液的指纹图谱导出，并导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A；16批次紫花地丁样品的指纹图谱相似度计算结果如表3，选择16批次紫花地丁的色谱图中均存在的6个色谱峰作为共有峰；用平均值计算法生成紫花地丁的对照指纹图谱，并以2号峰为参照峰，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积如表4所示。

以上步骤3中，液相色谱条件为：色谱柱：YMC-Pack ODS-A柱，规格250×4.6mm,5μm；流动相：乙腈为A相，0.1％磷酸水溶液为B相，流速：0.8mL/min，柱温30℃，梯度洗脱，检测波长为330nm梯度洗脱程序如下表2：

表2梯度洗脱程序

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表316批次紫花地丁样品的指纹图谱相似度计算结果

，

表4共有指纹峰相对保留时间及相对峰面积

实施例2指纹图谱检测方法学研究

本发明按指纹图谱的要求进行了方法学考察，包括稳定性、精密度和重复性，结果共有峰相对保留时间的RSD均小于3％，峰面积大于5％的共有峰的RSD也均小于3％，说明使用该检测方法进行指纹图谱检测色谱峰的相对保留时间、相对峰面积的一致性，即溶液配制后8小时内成分稳定，供试品进样精密度及重复性良好。

(1)稳定性实验：精密称取紫花地丁药材粉末1.0g，置250ml具塞锥形瓶中，加入80ml的80％甲醇，称重，超声30min，冷却至室温，称重，以80％甲醇补足减失的重量，摇匀，静置，取上清过0.45μm微孔滤膜，取续滤液，即得。溶液分别于配制后0、2、4、6、8小时依法测定，结果表明，供试品溶液在8小时内稳定，结果见表5。

表5指纹图谱稳定性实验结果

(2)精密度实验：精密称取紫花地丁药材粉末1.0g，置250ml具塞锥形瓶中，加入80ml的80％甲醇，称重，超声30min，冷却至室温，称重，以80％甲醇补足减失的重量，摇匀，静置，取上清过0.45μm微孔滤膜，取续滤液，即得。重复进样5次，求得相对标准偏差，结果见表6。

表6指纹图谱精密度实验结果

(3)重复性实验：精密称取紫花地丁药材粉末1.0g，置250ml具塞锥形瓶中，加入80ml的80％甲醇，称重，超声30min，冷却至室温，称重，以80％甲醇补足减失的重量，摇匀，静置，取上清过0.45μm微孔滤膜，取续滤液，即得。制备5份供试品溶液进行测定，求得相对标准偏差，结果见表7。

表7指纹图谱重复性实验结果

以上实验结果表明，本发明提供的紫花地丁指纹图谱检测方法，稳定性好，精密度高，重复性好，能全面客观评价紫花地丁的质量，为保证临床疗效具有重要的意义。

以上实施例仅为本发明的示例性实施例，不用于限制本发明，本发明的保护范围由权利要求书限定。本领域技术人员可以在本发明的实质和保护范围内，对本发明做出各种修改或等同替换，这种修改或等同替换也应视为落在本发明的保护范围内。