阅读说明：本技术 人血浆中缬沙坦和沙库巴曲的浓度的测定方法及其用途 (Method for determining concentration of valsartan and sabotarol in human plasma and application thereof ) 是由 余珊 曹媛媛 古珑 房成伟 于 2021-01-22 设计创作，主要内容包括：本发明涉及人血浆中缬沙坦和沙库巴曲的浓度的测定方法及其用途。提供一种人血浆中缬沙坦和沙库巴曲的浓度的测定方法,所述方法包括：血浆样品的配制工序,和高效液相色谱串联质谱分析的工序,其中所述高效液相色谱串联质谱分析采用体积比为90/10的含0.1%甲酸的水-含10%甲醇的乙腈的混合液作为流动相,采用粒径为3.5μm的色谱柱进行梯度洗脱。(The invention relates to a method for determining the concentration of valsartan and sabotarol in human plasma and application thereof. There is provided a method of determining the concentration of valsartan and sabotarol in human plasma, the method comprising: the method comprises a plasma sample preparation process and a high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry analysis process, wherein the high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry analysis adopts 90/10 mixed liquid of water containing 0.1% formic acid and acetonitrile containing 10% methanol as a mobile phase, and adopts a chromatographic column with the particle size of 3.5 mu m for gradient elution.)

人血浆中缬沙坦和沙库巴曲的浓度的测定方法及其用途

技术领域

本发明涉及一种人血浆中药物浓度的检测方法。具体地，本发明涉及一种通过高效液相色谱串联质谱分析(high performance liquid chromatography-tandem massspectrometry，HPLC-MS/MS)测定人血浆中缬沙坦和沙库巴曲的浓度的方法。

背景技术

血管紧张素II(Ang II)是由血管紧张素I在血管紧张素转化酶的作用下，水解产生的多肽物质。人体的血管平滑肌、肾上腺皮质球状带细胞以及脑的一些部位、心脏和肾脏器官的细胞上存在有血管紧张素受体。血管紧张素Ⅱ与血管紧张素受体结合，引起相应的生理效应，包括①使全身微动脉、静脉收缩，血压升高，回心血量增多；②增加交感缩血管纤维递质释放量；③使交感缩血管中枢紧张；④刺激肾上腺合成和释放醛固酮；⑤引起或增强渴觉、导致饮水行为。

血管紧张素II受体拮抗剂(Angiotensin II receptor antagonist)，也被称为血管紧张素受体阻滞剂(angiotensin receptor blockers, ARBs)，现已广泛用于临床高血压病及其他心肾疾病如糖尿病肾病和充血性心力衰竭等的治疗。“沙坦”类药物即血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂(ARB)类抗高血压药物，其药理作用大体都是通过与血管紧张素1型受体(AT₁受体)特异性结合而拮抗Ang II的升血压和损害靶器官作用，但拮抗AT₁受体的强度、选择性作用和化学活性物质(母体或其代谢物)等不尽相同。目前已应用于临床的种类繁多，例如氯沙坦、缬沙坦、伊普沙坦、厄贝沙坦、坎地沙坦等，其中以氯沙坦和缬沙坦在国内的应用最为广泛。

缬沙坦(Valsartan)属于非肽类、口服有效的血管紧张素II受体拮抗剂，它对AT₁受体有高度选择性，可竞争性地拮抗而无任何激动作用，还可抑制AT₁受体所介导的肾上腺球细胞释放的醛固醇，但对钾所致的释放没有抑制作用，这也说明缬沙坦对AT₁受体的选择性作用。从分子水平上看，缬沙坦使AT₁受体封闭、血管紧张素II血浆水平升高、刺激未封闭的AT₂受体同时抗衡AT₁受体的作用，从而达到扩张血管降低血压的效果。各种类型的高血压动物模型的体内试验也表明缬沙坦具有良好的降压作用，对心收缩功能及心率无明显影响，而对血压正常的动物则不产生降压作用。良好的耐受性、较低的毒副作用和AT₁受体的高效选择作用使缬沙坦成为一个有前景的抗高血压药物。

沙库巴曲缬沙坦钠含有脑啡肽酶抑制剂沙库巴曲(sacubitril)和血管紧张素受体拮抗剂缬沙坦。沙库巴曲缬沙坦钠通过LBQ657(前药沙库巴曲的活性代谢产物)抑制脑啡肽酶(中性肽链内切酶；NEP)，同时通过缬沙坦阻断血管紧张素II的AT₁受体。通过LBQ657增加脑啡肽酶所降解的肽类水平(例如利钠肽)，同时通过缬沙坦抑制血管紧张素II作用，在心力衰竭患者中沙库巴曲缬沙坦钠可产生心血管和肾脏作用。缬沙坦可通过选择性阻断AT₁受体抑制血管紧张素II作用，还可抑制血管紧张素II依赖性醛固酮释放。

通常而言，检测血液或其他生物样本中的药物浓度是药动学、药效学研究和临床治疗的基础。用于检测血浆药物浓度的方法应当具备高灵敏度、能够快速获得结果，和能够使用少量样品进行。然而，由于血液中存在包括磷脂、蛋白等多种组分，检测易受基质效应等各种因素的影响，以及药物的各种物化性质，如何最大可能减少基质效应及残留，尽可能获得血液中药物的准确浓度，是本领域必须进行深入研究的课题。

高效液相色谱法是目前检测血药浓度常用的方法，应用范围广泛。但是，由于使用色谱柱进行分离耗费时间较长、灵敏度较低，并不适用于高通量的生物样品分析。

超高效液相色谱质谱联用法(Ultra Performance Liquid Chromatography，UPLC-MS/MS)提高了分析通量，节省了样品和溶剂分析时间。然而，UPLC-MS/MS对流动相、色谱柱、样品前处理、质谱接口、数据采集系统都提出了特别的要求，即，需要对包括样品前处理、内标、流动相、色谱柱选择、质谱条件设置等各项条件进行大量试验，才能实现UPLC-MS/MS快速检测分析，过程时间较长且复杂。

例如，CN110031568A(专利文献1)提供了一种通过超高效液相色谱串联质谱法(UPLC-MS/MS)测定人血浆中沙库巴曲、去乙基沙库巴曲和缬沙坦浓度的方法。其中，为了降低对色谱柱的毒性，通过采用甲醇水进行样品前处理、采用分析物的氘代衍生物作为内标、调整流动相为0.1%甲酸水/乙腈等一系列操作同时检测沙库巴曲、去乙基沙库巴曲和缬沙坦三种药物(代谢物)在血浆中的浓度。

高效液相色谱串联质谱法(High Performance Liquid Chromatography，HPLC-MS/MS)对流动相、色谱柱、样品前处理、质谱接口、数据采集系统都比UPLC-MS/MS要求少，且分析通量、样品和溶剂分析时间完全在合理的需求范围内，所以实验方法重现性好，且在各种实验条件(如流动相、复溶液)固定时，残留比UPLC-MS/MS少。质谱检测与色谱检测不同，对于流动相组成、流速等多种方面也需要额外的注意，因此对实验条件包括例如流动相选择、质谱参数的设定等进行具体深入研究才能获得分离状况良好、残留小、灵敏度高、耐受性好的HPLC-MS/MS方法。

目前已有的检测大鼠血浆中缬沙坦和沙库巴曲浓度的方法并不适用于临床药代动力学研究的大批量的样本检测。

因此，本领域急需能够用于检测人血浆中缬沙坦和沙库巴曲的浓度的快速、灵敏的方法。

发明内容

发明要解决的问题

鉴于背景技术的上述主要缺陷，本发明的目的是提供简便高效灵敏地检测血浆中缬沙坦和沙库巴曲的浓度的方法。

生物等效性研究旨在获得更可靠的临床样本浓度用于药代动力学研究，因此需要建立合理的线性范围，残留满足接受标准(小于20%定量下限)的生物分析检测法，尽可能减少样本的再稀释和样品的色谱污染。

作为本发明人深入研究的结果，已经建立了快速、灵敏的通过高效液相色谱串联质谱技术检测人血浆中缬沙坦和沙库巴曲的浓度的方法。本发明的方法具有的优点包括例如样本处理简单、快捷、灵敏度高、残留小等。鉴于缬沙坦和沙库巴曲的同时用药及其代谢的不同，本发明实现了对缬沙坦和沙库巴曲的浓度的同时检测，具有重要意义。

用于解决问题的方案

本发明提供一种人血浆中缬沙坦和沙库巴曲的浓度的测定方法，所述方法包括：血浆样品的配制工序，和高效液相色谱串联质谱分析的工序，其中所述高效液相色谱串联质谱分析采用体积比为90/10的含0.1%甲酸的水-含10%甲醇的乙腈的混合液作为流动相，采用粒径为3.5µm的色谱柱进行梯度洗脱。

根据本发明的人血浆中缬沙坦和沙库巴曲的浓度的测定方法，在所述高效液相色谱串联质谱分析中，所用内标为待分析物的氘代衍生物。

根据本发明的人血浆中缬沙坦和沙库巴曲的浓度的测定方法，所述内标为缬沙坦-d₃和沙库巴曲-d₄。

根据本发明的人血浆中缬沙坦和沙库巴曲的浓度的测定方法，所述血浆样品的配制工序包括血浆样品的前处理工序。

根据本发明的人血浆中缬沙坦和沙库巴曲的浓度的测定方法，所述前处理工序通过使用乙腈沉淀所述血浆样品中的蛋白质来进行。

根据本发明的人血浆中缬沙坦和沙库巴曲的浓度的测定方法，所述血浆样品的配制工序还包括在所述前处理工序后的稀释工序。

根据本发明的人血浆中缬沙坦和沙库巴曲的浓度的测定方法，所述稀释工序通过使用含30%乙腈的纯化水稀释来进行。

本发明还提供根据前述人血浆中缬沙坦和沙库巴曲的浓度的测定方法在缬沙坦和沙库巴曲的药代动力学研究中的用途。

发明的效果

本发明的方法采用含甲酸的水-含10%甲醇的乙腈的混合液作为流动相的梯度洗脱进行分析时，能够快速、充分地分离待测物质，获得良好的峰形，分析时间较快，基线噪音低，残留也有所减小。

本发明中，采用特定的色谱柱能够充分分离待测物质，获得良好的峰形和分析时间较快，且残留大大降低。

本发明中，采用缬沙坦-d₃和沙库巴曲-d₄能够提供线性关系良好、精密度、基质效应、提取回收率以及稳定性符合要求的检测方法。

本发明中，采用蛋白沉淀法对样本进行前处理时，获得令人惊讶的高回收率，从而可以避免繁琐耗时的液液萃取过程，并且能够获得高的灵敏度和避免基质效应，进而避免了大量生物样本分析中内标异常引起的复测。进一步地，本发明人发现蛋白沉淀后加入含30%乙腈的纯化水进行稀释，优选接近流动相比例的溶剂比例，可以获得更好的峰形，并减小残留，尤其能够获得提高的灵敏度。

本发明的方法具有良好的重现性，有效降低了残留效应的出现。适用于100mg沙库巴曲缬沙坦钠片的生物等效性研究，有效避免了过多样本的稀释，减少了样本分析的工作量且不影响其PK参数。

本发明的方法的特异性、基质效应、提取回收率以及稳定性均进行了验证，所述方法已经成功应用于临床药代动力学样本的检测。

附图说明

图1A-1D示出二级质谱图。图1A：缬沙坦的二级质谱图；图1B：沙库巴曲子离子扫描图；图1C：缬沙坦-d₃子离子扫描图；图1D：沙库巴曲-d₄子离子扫描图。

图2A-2F示出4个目标化合物的空白血浆、含内标空白血浆和低定量下限的特征性色谱图。图2A：缬沙坦空白基质图谱，上图对应于缬沙坦，下图对应于缬沙坦-d₃；图2B：沙库巴曲空白基质图谱，上图对应于沙库巴曲，下图对应于沙库巴曲-d₄；图2C：缬沙坦的添加内标的空白血浆典型色谱图，上图对应于缬沙坦，下图对应于缬沙坦-d₃；图2D：沙库巴曲的添加内标的空白血浆典型色谱图，上图对应于沙库巴曲，下图对应于沙库巴曲-d₄；图2E：缬沙坦最低定量限图谱，上图对应于缬沙坦，下图对应于缬沙坦-d₃；图2F：沙库巴曲最低定量限图谱，上图对应于沙库巴曲，下图对应于沙库巴曲-d₄。

图3为显示本发明的实施方案的缬沙坦标准曲线。

图4为显示本发明的实施方案的沙库巴曲标准曲线。

具体实施方式

在一些实施方案中，本发明提供通过高效液相色谱串联质谱分析(HPLC-MS/MS)测量人血浆中缬沙坦和沙库巴曲的浓度的方法，其中所述方法采用含甲酸的水-含10%甲醇的乙腈的混合液作为流动相进行。

本发明人已经发现尽管使用甲醇作为流动相可获得更好的响应，但是基线噪音也相应增高，而且目标化合物的信号较高，存在较为严重的残留。而采用用含甲酸的水-含10%甲醇的乙腈的混合液作为流动相进行分析时，洗脱能够快速、充分分离待测物质，获得良好的峰形，基线噪音低，残留也有所减弱。

在一些实施方案中，本发明的方法中采用的流动相中，含甲酸的水与含10%甲醇的乙腈的体积比(v/v)可以为90/10~10/90。

在一些实施方案中，本发明的方法中采用的流动相可以为含0.1%甲酸的水(下文中简称为0.1%甲酸水)-含10%甲醇的乙腈的混合液。在一些实施方案中，所述流动相采用上述体积比进行。

在一些实施方案中，本发明的方法可以采用梯度洗脱或等度洗脱进行。在一些具体的实施方案中，本发明的方法通过梯度洗脱进行。在一些实施方案中，本发明的方法中流动相采用0.3-0.8mL/min的流速进行。在一些优选的实施方案中，本发明的方法中流动相优用0.50mL/min的流速进行。在一些具体的实施方案中，本发明的方法可以采用下述梯度洗脱进行：A：0.1%甲酸水；B：含10%甲醇的乙腈，洗脱梯度为：0～0.3min：60%B；2.5min：85%B；2.6～4.0min：100%B，4.1～6.0min：60%B，洗脱流速设为0.5mL/min。

为了改善色谱分离选择性，在一些实施方案中，向流动相中加入流动相改性剂等来进一步调节流动相的极性。已经观察到采用所述流动相进行洗脱能够充分分离待测物质，获得良好的峰形且分析时间较快。

在一些实施方案中，本发明的方法的高效液相色谱串联质谱分析中，发现粒径为3.5µm的色谱柱可在兼顾色谱峰形的同时最大化减少残留。在色谱分析中，色谱柱的选择十分重要，对色谱柱的要求是柱效高、选择性好，分析速度快等。色谱柱的内径在上述范围内时，可以获得缬沙坦和沙库巴曲的良好分离和峰型，且洗脱时间适当。如果低于上述内径，则对于目标化合物的保留较差，峰形的对称性欠佳，而且有较严重的残留。如果高于上述内径，则保留时间降低，柱效也同时降低。作为色谱柱的实例，可以例举Agilent ZORBAX SB-Aq (100×3.0 mm, 3.5µm)(产品名称，由安捷伦科技有限公司制造)。

在一些实施方案中，本发明的高效液相色谱串联质谱分析中，采用分析物的氘代衍生物作为内标。在采用内标法时，内标物的选择是一项十分重要的工作。理想的内标物应当能以准确、已知的量加到样品中去，和被分析的样品有基本相同或尽可能一致的物理化学性质(如化学结构、极性、挥发度及在溶剂中的溶解度等)、色谱行为和响应特征；在色谱分析条件下，内标物必须能与样品中各组分充分分离。在一些实施方案中，采用分析物的氘代衍生物、优选缬沙坦-d₃和沙库巴曲-d₄能够提供线性关系良好、精密度、基质效应、提取回收率以及稳定性符合要求的检测方法。

在一些实施方案中，本发明的方法采用蛋白沉淀法进行前处理。本发明人已经发现通过液液萃取进行样品前处理时，操作繁琐耗时，提取回收率低，并且检测的灵敏度也较低，不能满足临床药代动力学中大样本检测人血浆中缬沙坦和沙库巴曲的浓度的要求。本发明的研究结果显示在本发明的条件下能够采用蛋白沉淀法进行样品前处理，并且获得令人惊讶的高回收率，从而可以避免繁琐耗时的液液萃取过程。然而，本发明人发现，血浆样品用甲醇蛋白沉淀后并进一步用50%甲醇稀释后直接进样时，标准曲线最高点后的空白样品残留峰面积较高，且色谱峰存在拖尾。在本发明中，优选通过乙腈进行蛋白沉淀处理。

在一些实施方案中，本发明的方法能够获得提高的回收率。在一些实施方案中，本发明的方法获得高达80%以上的回收率。在一些实施方案中，本发明的方法获得高达85%以上的回收率。在一些实施方案中，本发明的方法获得高达90%以上的回收率。在一些实施方案中，本发明的方法获得高达95%以上的回收率。在一些实施方案中，本发明能够得令人吃惊的高达99%的提取回收率。在一些实施方案中，本发明的方法获得的提取率能够高达99%，并且能够获得高的灵敏度和避免基质效应。

在一些实施方案中，待测人血浆样品通过蛋白沉淀法前处理后，通过含30%乙腈的纯化水进行稀释。在一些实施方案中，待测人血浆样品通过蛋白沉淀法如乙腈蛋白沉淀法前处理后，通过含30%乙腈的纯化水进行稀释至接近流动相比例的溶剂比例。在一些实施方案中，通过含30%乙腈的纯化水进行稀释至选自下述的溶剂比例：水:乙腈(80/20,v/v)~水:乙腈(20/80,v/v)，优选水: 乙腈(60/40,v/v) ~ 水:乙腈(40/60,v/v)，更优选水:乙腈(47/53,v/v)。本发明人发现蛋白沉淀后加入含30%乙腈的纯化水进行稀释，优选接近流动相比例的溶剂比例，可以获得更好的峰形，并减小残留，尤其能够获得提高的灵敏度。由后述实施例部分可知，本发明的方法检测血浆中的缬沙坦的灵敏度为大于7.5ng/mL，沙库巴曲的灵敏度为大于5ng/mL。

在一些具体的实施方案中，待测人血浆样品前处理采用乙腈蛋白沉淀，经含30%乙腈的纯化水进一步稀释后用Agilent ZORBAX SB-Aq (100×3.0 mm, 3.5µm)色谱柱，以含甲酸的水-含10%甲醇的乙腈的混合液进行分离。

为了更加清楚地对本发明进行说明，以下通过具体实施例对本发明的具体实施方式进行更为详细的说明。但是应该理解，以下所述具体实施例仅用于本发明进行示例性说明，而非用于本发明进行任何性质限定，其中所用材料、试剂、仪器及操作条件仅为代表性的，其并不限于所列举的情况。所属技术领域的技术人员通过阅读以下说明可以对本发明做出不脱离本发明权利要求所限定的保护范围的改动和改进，这些改动和改进也处于本发明所要求保护的范围内。

本发明人已经建立高效液相色谱串联质谱分析(HPLC-MS/MS)的缬沙坦和沙库巴曲浓度测定方法，并按照2015年《中国药典》中《生物样品定量分析方法验证指导原则》进行了方法学的考察。

1. 材料与方法

1.1 试剂与药品

缬沙坦和沙库巴曲标准品均由南京优科生物技术有限公司提供，内标缬沙坦-d₃和沙库巴曲-d₄购自中国食品药品检定研究院。高效液相色谱纯级甲醇、异丙醇和乙腈购自Merck公司，高效液相色谱纯级甲酸购自Sigma公司，实验用水为ELGA Classic UV纯水系统所制超纯水。

1.2. 实验仪器和分析条件

液相色谱仪：岛津公司的高效液相色谱；

色谱柱：安捷伦ZORBAXSB-Aq (100×3.0 mm, 3.5µm)；

液相条件：

流动相：0.1%甲酸水：含10%甲醇的乙腈(90/10,v/v)；

流速：0.50mL/min；

进样量：5µL；

柱温：40℃；

进样器内温度：5℃。

质谱条件：

用Sciex公司API 4000三重四级杆质谱进行分析检测。电喷雾电离(ESI)，正离子模式，多反应监测模式(MRM)，喷雾电压为5500V；

离子源温度：600℃，气帘气：30psi，雾化气：40psi，辅助雾化气：65psi。

缬沙坦、沙库巴曲、内标缬沙坦-d₃和沙库巴曲-d₄检测离子对分别为：

m/z 436.4→235.4，DP、EP、CXP和CE分别为60V、10V、12V、28V；

m/z 412.3→309.1，DP、EP、CXP和CE分别为80V、10V、12V、26V；

m/z 439.4→235.4，DP、EP、CXP和CE分别为60V、10V、12V、28V；

m/z 416.3→309.1，DP、EP、CXP和CE分别为52V、10V、12V、26V。

缬沙坦、沙库巴曲、内标缬沙坦-d₃和沙库巴曲-d₄的二级质谱图示于图1A-1D。

1.3.储备液和工作液的配制

精密称取约2mg缬沙坦和沙库巴曲标准品于体积合适的玻璃瓶中，加入适量的甲醇/水(4/1，体积比)混合溶液，将其溶解、混匀后配成浓度为1mg/mL的储备液。精密称取约1mg缬沙坦-d₃和沙库巴曲-d₄标准品于体积合适的玻璃瓶中，加入适量的甲醇/水(4/1，体积比)混合溶液，将其溶解、混匀后配成浓度为1mg/mL的储备液。

内标工作液用50%甲醇水稀释，浓度为800/200ng/mL的缬沙坦-d₃/沙库巴曲-d₄内标工作液。

缬沙坦和沙库巴曲储备液按一定比例，进一步用50%甲醇稀释，配制成缬沙坦和沙库巴曲浓度为150/100、300/200、750/500、3000/2000、15000/10000、30000/20000、120000/80000、150000/10000ng/mL的标准曲线工作液，以及114000/76000、12000/8000、450/300、150/100ng/mL质控工作液。

储备液置于-20℃保存，工作液置于-20℃保存。

1.4. 血浆样品的配制

在1.5mL EP管中加入20µL 稀释液2(甲醇/水，50/50，体积比)稀释得到的工作液和380µL空白K₂EDTA血浆得到血浆样品，在96孔板中加入50µL血浆样品和50µL内标工作液，再加入500µL乙腈，涡旋混匀15min，6000g，5°C离心10min，取100µL上清于新的96孔板中，加入200µL 30%乙腈水稀释，涡旋15min，6000g，5°C离心5min，取5µL进样检测。

方法学验证

参照2015年《中国药典》中的《生物样品定量分析方法验证指导原则》，对检测方法进行验证，验证内容包括特异性、精密度、灵敏度、标准曲线、提取回收率、基质效应、稳定性。

(1) 特异性

分别取6个个体空白血浆50µL，加入50µL 50%甲醇，随后按“1.4血浆样品处理”项下操作，进样检测获得空白血浆图谱(图2A和图2B)。

分别取6个个体空白血浆50µL，按照按“1.4血浆样品处理”项下操作，进样检测获得仅加内标的空白血浆图谱(图2C和图2D)。

分别取6个个体空白血浆380µL，加入20µL 150/100ng/ml的标准曲线工作液，再加入50µL内标工作液，随后按照按“1.4血浆样品处理”项下操作，进样检测获得低定量下限的图谱(图2E和图2F)。

由图2A-图2F可知，其中，缬沙坦的保留时间为1.736min，峰形对称，其定量下限(7.5ng/mL)色谱峰的信噪比大于5，缬沙坦的同位素内标(浓度800ng/mL)经过前处理稀释后，对待测物缬沙坦的干扰小于其定量下限的20%，且由图2A可知，空白人K₂EDTA血浆的色谱图中，缬沙坦和缬沙坦-d₃的色谱峰保留时间处未见影响缬沙坦定量的干扰峰，故本发明方法中缬沙坦和缬沙坦-d₃的选择性和特异性良好；沙库巴曲的保留时间为1.839min，峰形对称，其定量下限(5ng/mL)色谱峰的信噪比大于5，沙库巴曲的同位素内标(浓度200ng/mL)经过前处理稀释后，对待测物沙库巴曲的干扰小于其定量下限的20%，且由图2B可知，空白人K₂EDTA血浆的色谱图中，沙库巴曲和沙库巴曲-d₄的色谱峰保留时间处未见影响沙库巴曲定量的干扰峰。本发明方法中沙库巴曲和沙库巴曲-d₄的选择性和特异性良好，符合生物分析的定量检测的各项要求。

(2) 精密度和准确度

380µL空白血浆加入20µL相应浓度的工作液配制成7.5/5ng/mL (缬沙坦/沙库巴曲，LLOQ，下文同样适用)、22.5/15ng/mL (缬沙坦/沙库巴曲，LQC，下文同样适用)、600/400ng/mL (缬沙坦/沙库巴曲，MQC，下文同样适用)、5700/3800ng/mL(缬沙坦/沙库巴曲，HQC，下文同样适用)的血浆样品各1份，每份加入96孔板中6个孔中，作为精密度和准确度样品，随后按照“1.4血浆样品处理”项下处理。不同天测定3批样品，缬沙坦/沙库巴曲峰面积和内标峰面积的比值，代入当天的标准曲线求得实测浓度，计算批内和批间精密度和准确度。准确度偏差和精密度分别用RE%和RSD%表示，标准偏差用SD表示，低浓度质控样品(LQC)、中浓度质控样品(MQC)、高浓度质控样品(HQC)其准确度偏差和精密度绝对值小于15%为合格，定量下限质控样品(LLOQ)其准确度偏差和精密度绝对值小于20%为合格。结果见表1A和表1B。

表1A缬沙坦批内、批间精密度与准确度。

表1B沙库巴曲批内、批间精密度与准确度。

与配制浓度对照，采用单因素方差分析方法求得本法的精密度与准确度，表1A显示缬沙坦的批内RE≤3.6%，批内RSD≤8%，批间RE≤2.6%，批间RSD≤6%；表1B显示沙库巴曲的批内RE≤4.5%，批内RSD≤11.2%，批间RE≤5.3%，批间RSD≤6.5%，所有结果符合药典接受标准。

(3) 标准曲线

380µL空白血浆加入20µL相应浓度的标准曲线工作液，配制成相当于血浆中缬沙坦和沙库巴曲浓度分别为7.5/5、15/10、37.5/25、150/100、750/500、1500/1000、6000/4000、7500/5000ng/mL的模拟血浆样品，随后按“1.4血浆样品的处理”项下操作，进样检测。验证三批，以配制成相当于血浆中缬沙坦/沙库巴曲浓度与内标浓度比值(X)为横坐标，缬沙坦/沙库巴曲与内标物的峰面积比值f为纵坐标，用加权(W＝1/X²)最小二乘法进行回归运算，求得的直线回归方程即为标准曲线。缬沙坦标准曲线见图3，沙库巴曲标准曲线见图4。

由图3和图4可知，本发明的方法中缬沙坦在血浆7.50～7500ng/mL范围内，沙库巴曲在血浆5.00～5000ng/mL范围内线性关系良好。

(4) 提取回收率和基质效应

对照组(SET1)样品的制备：于1.5mL离心管中加入380µL稀释液2(甲醇/水，1/1，体积比)，加入20µL的质控混合工作液(低浓度质控工作溶液/中浓度质控工作溶液/高浓度质控工作溶液)得到缬沙坦和沙库巴曲浓度分别为22.5/15ng/mL、600/400ng/mL、5700/3800ng/mL的样品溶液，于96孔板中加入50µL样品溶液以及内标溶液50µL，精密加入500µL的30%乙腈水溶液，涡旋混匀，于6000g离心10min，吸取100µL上清液加入到新的96孔板中，加入200µL 30%乙腈水稀释，涡旋混匀后，6000g，5°C离心5min，取5µL进行HPLC-MS/MS分析。每浓度制备3份样品，记录色谱图，记录缬沙坦峰面积(A)，计算其平均值As，沙库巴曲峰面积(B)，计算其平均值Bs，记录各组内标缬沙坦-d₃峰面积(C)，求其平均值(Cs)，沙库巴曲-d₄峰面积(D)，求其平均值(Ds)。

对照组(SET2)样品的制备：1.5mL的Ep管中精密加入50µL 6个不同个体空白血浆，加入500µL乙腈，涡旋振荡15min，于6000g离心10min，吸取100µL上清液加入到新的96孔板中，再加入100µL对照组(SET1)样品的制备中上清液，加入100µL 30%乙腈水稀释，涡旋混匀后，6000g，5℃离心5min，取5µL进行HPLC-MS/MS分析。记录色谱图，记录各浓度缬沙坦的峰面积Am，求其平均值Am′，沙库巴曲的峰面积Bm，平均值Bm′；记录所有浓度中的内标缬沙坦-d₃峰面积Cm，求其平均值Cm′，沙库巴曲-d₄峰面积Dm，求其平均值Dm′。

实验组(SET3)样品的制备：按“血浆样品标准曲线”测定方法配制成血浆缬沙坦和沙库巴曲浓度分别为22.5/15ng/mL、600/400ng/mL、5700/3800ng/mL的低、中、高三种不同浓度的血浆样本各6份，按“1.4血浆样品的处理”项下操作，进行HPLC-MS/MS分析，记录色谱图。记录各浓度样品的缬沙坦的峰面积Ai，沙库巴曲的峰面积Bi，记录所有内标缬沙坦-d₃峰面积Ci，沙库巴曲-d₄峰面积Di，分别将Ai、Bi、Ci、Di和As、Bs、Cs、Ds代入下式即可求得缬沙坦和沙库巴曲，内标缬沙坦-d₃和沙库巴曲-d₄的绝对提取回收率(AR%)：

缬沙坦：AR%＝Ai/As×100%；

沙库巴曲：AR%＝Bi/Bs×100%；

内标缬沙坦-d₃：AR%＝Ci/Cs×100%；

沙库巴曲-d₄：AR%＝Di/Ds×100%；

将Ai、Bi、Ci、Di和Am′、Bm′、Cm′、Dm′代入下式即可求得缬沙坦，沙库巴曲，内标缬沙坦-d₃和沙库巴曲-d₄的相对提取回收率(RR%)：

缬沙坦：RR%＝Ai/Am′×100%；

沙库巴曲：RR%＝Bi/Bm′×100%；

内标缬沙坦-d₃：RR%＝Ci/Cm′×100%；

内标沙库巴曲-d₄：RR%＝Di/Dm′×100%。

将Am、Bm、Cm、Dm和As、Bs、Cs、Ds代入下式即可求得缬沙坦、沙库巴曲，内标缬沙坦-d₃和沙库巴曲-d₄的基质因子(MF%)：

缬沙坦：MF%＝Am/As×100%；

沙库巴曲：MF%＝Bm/Bs×100%；

内标缬沙坦-d₃：MF%＝Cm/Cs×100%；

内标沙库巴曲-d₄：MF%＝Dm/Ds×100%。

待测物缬沙坦和沙库巴曲的基质因子与内标的基质因子之比为内标归一化基质因子(MF%)，6个个体内标归一化基质因子CV应小于15%。

结果见表2A、表2B、表2C、表2D、表2E、表2F、表2G、表2H。

表2A缬沙坦提取回收率。

表2B沙库巴曲提取回收率。

表2C缬沙坦-d₃提取回收率。

表2D沙库巴曲-d₄提取回收率。

表2E缬沙坦基质效应。

表2F沙库巴曲基质效应。

表2G缬沙坦-d₃基质效应。

表2H沙库巴曲-d₄基质效应。

表2A结果显示缬沙坦的血浆样本经甲醇提取后，高浓度质控样品(HQC)回收率为92.2%，中浓度质控样品(MQC)回收率为91.5%，低浓度质控样品(LQC)回收率为89.2%，低、中、高浓度的平均回收率为91.0%，相对变异系数为1.7%，同位素内标缬沙坦-d₃的回收率为91.7%，表2B结果显示沙库巴曲的血浆样本经甲醇提取后，高浓度质控样品(HQC)回收率为100.9%，中浓度质控样品(MQC)回收率为99.1%，低浓度质控样品(LQC)回收率为98.8%，低、中、高浓度的平均回收率为99.6%，相对变异系数为1.1%，同位素内沙库巴曲-d₄的回收率为100.1%，缬沙坦/沙库巴曲在本发明方法中的回收率高，低中高浓度回收率变异系数小，符合药典要求。

表2E-2H显示，缬沙坦/沙库巴曲的基质因子均在0.85-1.15之间，表明本发明的分析方法受个体基质差异影响小，方法可靠性高。

(5) 稳定性考察

稳定性考察包括：血浆样品室温放置17h，6次反复冻融稳定性(-70℃冷冻/室温解冻)、处理后样品进样器放置72h。配制低、高浓度质控样品各6个，置于相应环境条件后，处理后进样检测，以新鲜配制的标准曲线和质控样品进行定量，计算测得浓度与理论值的偏差。结果见表3A-3F。

表3A：缬沙坦生物样品的短期稳定性。

试验条件：在室温下放置17小时的短期稳定性。

表3B：沙库巴曲生物样品的短期稳定性。

试验条件：在室温下放置17小时的短期稳定性。

表3C：缬沙坦冻融稳定性。

试验条件：在超低温冷冻冰箱（-70°C）冻存首次至少24小时，之后至少12小时，室温解冻至少30分钟。

表3D：沙库巴曲冻融稳定性。

试验条件：在超低温冷冻冰箱（-70°C）冻存首次至少24小时，之后至少12小时，室温解冻至少30分钟。

表3E：缬沙坦处理后样品稳定性。

试验条件：在5°C放置72小时后的稳定性。

表3F：沙库巴曲处理后样品稳定性。

试验条件：在5°C放置72小时后的稳定性。

本发明的分析方法验证了缬沙坦/沙库巴曲血浆样品室温放置17h， 6次冻融稳定性(-70℃冷冻/室温解冻)、处理后样品进样器放置72h均稳定。

通过上述方法学的验证，本发明的方法符合药典的规定，适用于高通量的生物样品分析。

实施例：沙库巴曲缬沙坦钠片人体生物等效性研究

以中国健康志愿者为受试对象，评价空腹口服某公司研发生产的沙库巴曲缬沙坦钙钠片(100mg：1片，受试制剂)和诺华公司生产的沙库巴曲缬沙坦钠片，商品名诺欣妥®(100mg：1片，参比制剂)的相对生物利用度，评价受试制剂与参比制剂是否具有或可能具有生物等效性。该项研究是在健康受试者中进行的单中心、随机、开放、两制剂、单次给药、三周期部分重复交叉、空腹、餐后生物等效性实验。

设计采血点：在给药0小时(给药前60分钟内)和给药后0.167(10min)、0.333(20min)、0.5、0.75、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、5、6、8、12、24、36、48、72小时共20个时间点采集静脉血，每次取血大约4mL置于K₂EDTA抗凝剂真空采血管中，所有离心后血浆样品将被分成两份，储存于超低温冰箱(冰箱温度范围-80±10℃)，以供药代动力学分析。

根据该生物等效性实验的采血时间点以及给药剂量，按“1.4血浆样品的处理”项下操作，进行HPLC-MS/MS分析。

本实施例利用质谱仪(AB sciex 4000)，应用特定的色谱柱(Agilent ZORBAX SB-Aq ,100 x 3.0 mm, 3.5µm)，优化并固定流动相梯度为0.1%甲酸水：含10%甲醇的乙腈的混合液(90/10,v/v)，以0.5mL/min的流速，设计特定的检测范围(缬沙坦的线性范围为7.5-7500ng/mL，沙库巴曲的线性范围为5-5000ng/mL)，高效地进行了多个独立的沙库巴曲缬沙坦钠片人体生物等效性研究，实现了一万多个临床样本的检测分析，且临床样本再分析(ISR)100%通过。

参考例

以与专利文献1(CN110031568A)中记载的实施例8和实施例1相同的方式，测定沙库巴曲缬沙坦钠片的人体生物等效性，作为本发明的参考例。

以下示出专利文献1中的测量条件，将其全部内容引入本文以作参考。

液相条件：流动相：乙腈-0.1%甲酸水溶液(v/v,60:40)，流速：0.4mL/min。

质谱条件：用AB公司的TRIPLE QUAD 5500型三重四级杆串联质谱仪(配有电喷雾离子化ESI源、Analyst 1.6.3软件)。

血浆样品前处理：采用甲醇进行前处理。

本发明的实施例的优势在于在0.5mL/min的流速下能够较好地将目标化合物进行分离，并获得良好的峰形和合理的分析时间。在大量临床样本的检测中，通过本发明方法的合理的色谱梯度程序，有效避免了临床样本中未知代谢产物的干扰，保证了临床样本浓度监测的准确性与真实性。本发明的通过HPLC-MS/MS测定缬沙坦和沙库巴曲的浓度的方法，样本处理简单、快捷，适合大通量的临床样品检测。相比于参考例，本发明采用了更普通的质谱型号(AB sciex 4000)，常规型号色谱柱(Agilent ZORBAX SB-Aq ,100 x 3.0 mm,3.5µm)，即，使用常规低端质谱仪实现了沙库巴曲缬沙坦钠片人体生物等效性研究，方法更实用。并且，本发明优化了前处理的蛋白沉淀剂，使用乙腈(乙腈的磷脂去除效率高)取代参考例中的甲醇，使得缬沙坦/沙库巴曲的绝对基质因子在(0.97～1.07)之间，而参考例中绝对基质因子在(0.788～1.23)之间，从而体现出本发明方法专属性及选择性更高，受个体差异影响更小。

本发明设计的缬沙坦/沙库巴曲的检测范围，有效避免了大量样本的稀释，并保证了消除相样本浓度依然能被检测到，且本发明方法设计的质控样本浓度涵盖了临床样本浓度分布，有效监控了临床样本的准确性。

本发明并不旨在限于具体公开的实施方案的范围，提供所述实施方案来说明本发明的各方面。从本发明的描述和教导，对所述方法的各种修改将变得明显。可以在不脱离本发明的真正范围和精神的情况下实践这类变化，并且这类变化旨在落入本发明的范围内。