一种补血生乳制剂的检测方法
阅读说明：本技术 一种补血生乳制剂的检测方法 (Detection method of blood-replenishing and milk-producing preparation ) 是由 颜冬兰 叶惠煊 黄胜 徐向平 袁莉 陈波 于 2019-08-21 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种补血生乳制剂的检测方法,所述方法包括：(1)对照品溶液的制备；(2)供试品溶液的制备；(3)HPLC-ELSD检测。本发明方法的操作简便、准确度高、专属性好、精密度较高、重现性良好,有利于全面控制该制剂。(The invention discloses a detection method of a blood-enriching and milk-producing preparation, which comprises the following steps: (1) preparing a reference substance solution; (2) preparing a test solution; (3) and (5) detecting by HPLC-ELSD. The method has the advantages of simple operation, high accuracy, good specificity, high precision and good reproducibility, and is favorable for overall control of the preparation.)
技术领域
本发明属于药物检测技术，尤其涉及一种补血生乳制剂的检测方法。
背景技术
如何有效地评价中药质量是中药现代化研究面临的关键问题之一。中药成分复杂，现行的用1～2种化学成分评价中药质量的模式，无法表征中药化学成分的整体性和复杂性，不能有效地评价中药的质量。
补血生乳颗粒系从《古今中医效验秘方宝典》之“玉露饮”方加减化裁而成[1]，由黄芪、当归、白芍、茯苓、甘草、王不留行、川芎、枳壳、桔梗九味中药组成，属原国家中药三类新药(国药证字Z0000082)，主要用于气血亏虚所致的产后缺乳病。
近年，补血生乳颗粒的药理、毒理研究及临床应用均有报道，但未见相关的质量标准研究。目前，补血生乳颗粒执行的质量标准中(WS3-575(Z-082)-2003(Z))其含量测定采用薄层色谱法测定黄芪甲苷的含量。从质量控制方面看，该方法简单，仅对君药黄芪进行定量控制，对方中其他药材均未建立质量控制指标。
发明内容
本发明的目的就是针对补血生乳制剂的检测现状，为有效地控制补血生乳制剂的内在质量，缩短检测时间，节约检测成本，提供一种HPLC-ELSD法，同时测定补血生乳颗粒中黄芪甲苷、阿魏酸、甘草酸、王不留行黄酮苷、柚皮苷、新橙皮苷、桔梗皂苷D的含量，有利于全面控制该产品的质量。
一种补血生乳制剂的检测方法，包括如下步骤：
(1)对照品溶液的制备：
分别称取王不留行黄酮苷、芍药苷、阿魏酸、柚皮苷、新橙皮苷、桔梗皂苷D、黄芪甲苷、甘草酸对照品，置于容量瓶中，加甲醇，超声溶解并定容至刻度，摇匀，制成对照品溶液；
(2)供试品溶液的制备：
取定量补血生乳制剂，置锥形瓶或容量瓶中，加甲醇，超声或回流提取10～20min，放冷，取上清液，重复提取2-3次，合并上清液，减压浓缩至干，加入甲醇溶液定容，用微孔滤膜滤过，取续滤液，即得补血生乳制剂供试品溶液；
(3)HPLC-ELSD检测：
分别吸取步骤(1)和(2)所得的对照品溶液和供试品溶液，分别注入HPLC-ELSD色谱仪中进行测定；
其中，色谱条件为：色谱柱为C18反相色谱柱；检测器为ELSD(漂移管温度：40℃)；柱温为30～35℃；流动相A为0.1～0.2％甲酸水溶液，流动相B为乙腈，流速为0.8～1.2ml/min；分析时间52分钟；梯度洗脱，洗脱顺序如下表1：
表1梯度洗脱程序
所述步骤(1)对照品溶液的制备优选下述方法进行：
精密称取各对照品适量，置于容量瓶中，加甲醇，超声溶解并定容至刻度，制成分别含王不留行黄酮苷2500μg/ml、芍药苷2500μg/ml、阿魏酸2500μg/ml、柚皮苷2500μg/ml、新橙皮苷2500μg/ml、桔梗皂苷D 2500μg/ml、黄芪甲苷2500μg/ml、甘草酸2500μg/ml的溶液，即得。
所述步骤(2)供试品溶液的制备优选下述方法进行：
补血生乳制剂供试品溶液的制备：
a、补血生乳制剂为片剂、胶囊剂、颗粒剂：取补血生乳制剂内容物，研细，精密称取1-2g，置锥形瓶或容量瓶中，加入30-40mL甲醇，超声10-15min，取上清液，重复提取2-3 次，合并上清液，减压浓缩至干，加入1mL甲醇溶解定容，0.45μm微孔滤膜过滤，取续滤液，即得补血生乳剂供试品溶液；
b、补血生乳制剂为合剂、口服液：取补血生乳制剂混匀，精密量取5～10ml，置25～100ml 容量瓶中，加甲醇，超声或回流提取10～20min，放冷，用甲醇稀释至刻度，摇匀，用0.45μm 微孔滤膜滤过，取续滤液，即得补血生乳制剂供试品溶液。
所述步骤(2)中超声处理时间优选为10分钟。
所述步骤(3)中的色谱柱优选为Diamonsil C18色谱柱，色谱柱规格为：250x4.6mm，5μm。
所述步骤(3)中流动相A为0.1％甲酸水溶液。
所述步骤(3)中流速为1.0ml/min。
所述步骤(3)中，进样量为10μL。
本发明的有益效果：本发明检测方法能同时测定补血生乳制剂中黄芪甲苷、阿魏酸、甘草酸、王不留行黄酮苷、柚皮苷、新橙皮苷、桔梗皂苷D的含量，该方法简便、快速、准确，有利于全面控制该制剂。
本发明的技术方案是方法学考察过程如下：
1材料
1.1仪器
岛津高效液相色谱仪(Shimadzu 20A)带ELSD(LTⅡ)，日本岛津公司；KQ5200B型超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；MS205DU型电子天平，梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司，精度精度0.01mg；ATX224型电子天平，日本岛津公司，精度0.1mg。
1.2试药
王不留行黄酮苷(批号111853-201704)、芍药苷(批号110736-201842)、阿魏酸(批号 110773-201614)、柚皮苷(批号B0002972)、新橙皮苷(批号111857-201703)、桔梗皂苷D(批号111851-201708)、黄芪甲苷(批号110781-201616)、甘草酸(批号MUST-18060805) 对照品分别购自中国食品药品检定研究院、成都曼思特生物科技有限公司和北京曼哈格生物科技有限公司。甲醇为分析纯(国药集团)；甲酸为色谱纯(国药集团)；乙腈为色谱纯(国药集团)；水为超纯水。补血生乳颗粒由九芝堂股份有限公司提供，批号20180401、20180402、20180507。
2方法与结果
2.1色谱条件、样品前处理方式、色谱柱的选择
2.1.1色谱条件的考察
由于补血生乳颗粒中成分种类复杂，其中黄芪甲苷和桔梗皂苷D在紫外区为末端吸收，而王不留行黄酮苷和芍药苷色谱行为类似，分离较为困难。经多次反复摸索重复，故本实验最终采用0.1％甲酸水溶液-乙腈作为流动相，在C18色谱柱上进行梯度洗脱，使用蒸发光检测器进行检测，8个目标色谱峰的峰形良好，拖尾因子、灵敏度和分离度均符合定量技术要求。
2.1.2样品前处理的考察
在样品前处理优化中，分别采用乙腈、甲醇及50％甲醇溶液对补血生乳颗粒样品进行了提取比较。
①50％甲醇提取
取0.5g样品，加入10mL 50％甲醇，超声提取10min，取上清液，重复三次，合并上清液，减压浓缩至干，加入甲醇溶液定容，用微孔滤膜滤过，取续滤液，其色谱图见图1。
②乙腈提取
取0.5g样品，加入10mL乙腈，超声提取10min，取上清液，重复三次，合并上清液，减压浓缩至干，加入甲醇溶液定容，用微孔滤膜滤过，取续滤液，其色谱图见图2。
③甲醇提取
取1g样品，加入10mL甲醇，超声提取10min，取上清液，重复三次，合并上清液，减压浓缩至干，加入甲醇溶液定容，用微孔滤膜滤过，取续滤液，其色谱图见图3。
结果表明，乙腈作为提取溶剂时，8个成分的提取效率非常低，有些成分甚至在色谱条件下无法检测，可能为各成分溶解度差所致。采用50％甲醇溶液提取时，其色谱图比甲醇提取的更为复杂，且存在较多影响目标色谱峰的干扰峰，不利于定量分析。因此，选择甲醇作为最终的提取溶剂。
2.1.3色谱柱的考察
本实验考察了两种不同品牌的色谱柱[Diamonsil C18(250x4.6mm，5μm)和Hypersil C18 ODS，(250x4.6mm，5μm)]，结果使用后者时王不留行黄酮苷和芍药苷的色谱峰分离度较差，，而使用前者则分离度良好。
2.1.4梯度洗脱顺序的考察
本实验考察了不同洗脱梯度，
样品处理方式：取1g样品，加入30mL甲醇，超声提取10min，取上清液，重复提取3次，合并上清液，减压浓缩至干，加入1mL甲醇溶解定容，0.45μm微孔滤膜过滤，取续滤液；色谱柱：Hypersil C18 ODS，5μm(250x 4.6mm)；流动相：A 0.1％甲酸水溶液，B乙腈；流量：1mL/min；进样量：10μL；柱温：30℃；检测器：ELSD；漂移管温度：40℃
梯度洗脱顺序1：
0.01min(10％B)---30min(40％B)---45min(95％B)---55min(95％B)---55.01min (10％B)---62min(stop)
所得色谱图见图4。
梯度洗脱顺序2：
0.01min(10％B)---5min(12％B)---10min(15％B)---15min(20％B)---20min(25％ B)---35min(40％B)---50min(95％B)---52min(95％B)---52.01min(10％B)---55min(stop)
所得色谱图见图5。
梯度洗脱顺序3：
0.01min(10％B)---30min(40％B)---45min(95％B)---48min(95％B)---48.01min (10％B)---52min(stop)
所得色谱图见图6。
结果表明，梯度洗脱顺序1和2所得色谱图中王不留行黄酮苷和芍药苷的色谱峰分离度较差，因此选择梯度洗脱顺序3。
2.2色谱条件
通过考察流动相体系、样品前处理方式、漂移管温度、色谱柱、洗脱条件等条件，经过反复优化，得到的补血生乳颗粒的最佳色谱条件为色谱柱：Diamonsil C18(250x4.6mm，5μm)；流动相0.1％甲酸水溶液-乙腈，梯度洗脱(程序见表2)；体积流量1mL/min；柱温：30 ℃；检测器为ELSD(漂移管温度：40℃)；进样量10μL。
表2梯度洗脱程序
2.3供试品溶液制备颗粒研细，精密称取约1g，加入30mL甲醇，超声10min，取上清液，重复提取3次，合并上清液，减压浓缩至干，加入1mL甲醇溶解定容，0.45μm微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。
2.4对照品溶液的制备精密称取各对照品适量，加甲醇制成分别含王不留行黄酮苷2500 μg/ml、芍药苷2500μg/ml、阿魏酸2500μg/ml、柚皮苷2500μg/ml、新橙皮苷2500μg/ml、桔梗皂苷D 2500μg/ml、黄芪甲苷2500μg/ml、甘草酸2500μg/ml的溶液，即得。
2.5方法学考察
2.5.1线性关系考察精密吸取按“2.4”项下方法制备的混合对照品储备液，
0.25、2、2.5、4、5ml分别置10ml量瓶中，以甲醇定容，摇匀，即得系列质量浓度的混合对照品溶液。分别吸取上述系列混合对照品溶液各10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图。以峰面积自然对数对浓度的自然对数做图，得各成分校正曲线方程，见表3。
表3各成分线性关系
2.5.2精密度试验取同一批供试品(批号20180401)，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，在“2.2”项色谱条件下进样6次，测得王不留行黄酮苷、芍药苷、阿魏酸、柚皮苷、新橙皮苷、桔梗皂苷D、黄芪甲苷、甘草酸峰面积RSD分别为0.56％、1.34％、1.85％、1.02％、0.89％、 1.21％、1.53％、2.01％，表明该仪器精密度良好。
2.5.3重复性试验取同一批供试品(批号20180401)，按“2.3”项下方法平行制备6份供试品溶液，在“2.2”项色谱条件下进行测定，测得王不留行黄酮苷、芍药苷、阿魏酸、柚皮苷、新橙皮苷、桔梗皂苷D、黄芪甲苷、甘草酸含量RSD分别为1.06％、2.11％、0.94％、1.38％、 1.45％、2.33％、0.95％、1.74％，表明该方法重复性良好。
2.5.4稳定性试验取经“2.3”项方法制备的样品(批号20180401)供试品溶液，按照“2.2”项下的液相色谱条件进行分析，采用0、2、6、12、18、24h不同时间点进样分析，进样量为10μl，以王不留行黄酮苷、芍药苷、阿魏酸、柚皮苷、新橙皮苷、桔梗皂苷D、黄芪甲苷、甘草酸的峰面积RSD值分别为1.32％、2.01％、1.42％、2.11％、2.04％、3.01％、2.14％、3.27％，结果表明供试品溶液在24h内色谱峰面积变化较少，稳定性良好。
2.5.5加样回收率试验精密称取统一供试品(批号20180401)约1g，共6份，置于50ml 量瓶中，加入各对照品适量，按“2.3”项方法制备供试品溶液，在“2.2”项下的液相色谱条件下进行测定，计算回收率。结果，王不留行黄酮苷、芍药苷、阿魏酸、柚皮苷、新橙皮苷、桔梗皂苷D、黄芪甲苷、甘草酸平均加样回收率分别为97.72％、97.67％、95.87％、96.70％、 99.47％、96.31％、95.51％、96.06％，RSD分别为3.69％、2.44％、0.31％、3.44％、1.63％、 0.82％、3.70％、2.89％。
表4加样回收率试验结果
2.5.6样品含量测定取3批颗粒，按“2.3”项方法制备供试品溶液，在“2.2”项下的液相色谱条件下进行测定，计算含量，结果见表5。
表5样品含量测定结果(n＝3)
附图说明
图1：50％甲醇提取样品得到的色谱图；
图2：乙腈提取样品得到的色谱图；
图3：甲醇提取样品得到的色谱图；
图4：洗脱梯度顺序1所得的色谱图；
图5：洗脱梯度顺序2所得的色谱图；
图6：洗脱梯度顺序2所得的色谱图；
图7为实施例1中混合标准品色谱图，其中各峰分别为1：王不留行黄酮苷、2：芍药苷、3：阿魏酸、4：柚皮苷、5：新橙皮苷、6：桔梗皂苷D:、7：黄芪甲苷、8：甘草酸；
图8为实施例1补血生乳颗粒样品色谱图，其中各峰分别为1：王不留行黄酮苷、2：芍药苷、3：阿魏酸、4：柚皮苷、5：新橙皮苷、6：桔梗皂苷D:、7：黄芪甲苷、8：甘草酸。
具体实施方式
实施例1一种补血生乳颗粒的检测方法
1.1药品与试剂
王不留行黄酮苷(批号111853-201704)、芍药苷(批号110736-201842)、阿魏酸(批号 110773-201614)、柚皮苷(批号B0002972)、新橙皮苷(批号111857-201703)、桔梗皂苷D(批号111851-201708)、黄芪甲苷(批号110781-201616)、甘草酸(批号MUST-18060805)对照品分别购自中国食品药品检定研究院、成都曼思特生物科技有限公司和北京曼哈格生物科技有限公司。甲醇为分析纯(国药集团)；甲酸为色谱纯(国药集团)；乙腈为色谱纯(国药集团)；水为超纯水。补血生乳颗粒由九芝堂股份有限公司提供，批号20180301。
1.2仪器
岛津高效液相色谱仪(Shimadzu 20A)带ELSD(LTⅡ)，日本岛津公司；KQ5200B型超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；MS205DU型电子天平，梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司，精度精度0.01mg；ATX224型电子天平，日本岛津公司，精度0.1mg。
2检测方法与结果
2.1对照品溶液制备
精密称取各对照品(王不留行黄酮苷、芍药苷、阿魏酸、柚皮苷、新橙皮苷、桔梗皂苷 D、黄芪甲苷、甘草酸)适量，置于容量瓶中，加甲醇，超声溶解并定容至刻度，制成分别含王不留行黄酮苷2500μg/ml、芍药苷2500μg/ml、阿魏酸2500μg/ml、柚皮苷2500μg/ml、新橙皮苷2500μg/ml、桔梗皂苷D 2500μg/ml、黄芪甲苷2500μg/ml、甘草酸2500μg/ml的溶液，即得对照品溶液。
2.2供试品溶液制备
取补血生乳颗粒内容物，研细，精密称取1g，置锥形瓶或容量瓶中，加入30mL甲醇，超声10min，取上清液，重复提取3次，合并上清液，减压浓缩至干，加入1mL甲醇溶解定容，0.45μm微孔滤膜过滤，取续滤液，即得补血生乳剂供试品溶液。
2.3色谱条件
色谱柱：Diamonsil C18(250x4.6mm，5μm)；流动相0.1％甲酸水溶液-乙腈，梯度洗脱(程序见表6)；体积流量1mL/min；柱温：30℃；检测器为ELSD(漂移管温度：40℃)；进样量10μL。
表6梯度洗脱程序
2.4含量测定
分别吸取2.1和2.2所得的对照品溶液和供试品溶液，分别注入HPLC-ELSD联用仪中进行测定，对照品色谱图和供试品色谱图分别为图7和图8，其含量测定结果见下表7：
表7各成分含量测定结果(mg/g，n＝3)