环(-his-pro)的新多晶型形式
阅读说明：本技术 环(-his-pro)的新多晶型形式 (New polymorphic forms of cyclo (-HIS-PRO) ) 是由 K·奥姆斯特德 D·皮尔森 E·麦克弗森 于 2019-06-21 设计创作，主要内容包括：本发明涉及环(-His-Pro)(“CHP”)的新多晶型形式的合成和表征。本发明提供了环(-His-Pro)水合物结晶形式(“CHP水合物”或“模式2”化合物),其能够使用各种分析技术来表征并且区别于CHP的其它固体形式,所述分析技术包括但不限于X射线粉末衍射(XRPD)、固态核磁共振(NMR或13C SSNMR)、拉曼光谱、差示扫描量热法(DSC)、动态蒸汽吸附(DVS)和热重分析(TGA)。(The present invention relates to the synthesis and characterization of novel polymorphic forms of cyclo (-His-Pro) ("CHP"). The present invention provides crystalline forms of cyclo (-His-Pro) hydrate ("CHP hydrate" or "mode 2" compounds) that can be characterized and distinguished from other solid forms of CHP using various analytical techniques including, but not limited to, X-ray powder diffraction (XRPD), solid-state nuclear magnetic resonance (NMR or 13C SSNMR), raman spectroscopy, Differential Scanning Calorimetry (DSC), dynamic vapor adsorption (DVS), and thermogravimetric analysis (TGA).)
相关申请
本申请要求在2018年7月10日提交的美国临时申请号为62/696,190的优先权，其通过以法律允许的最大程度整体引用并入本文。
技术领域
本发明涉及环(-His-Pro)(“CHP”)的新颖的多晶型形式。
背景技术
环(-His-Pro)，C11H14N4O2，被称为是一种无水二肽，CAS注册号为53109-32-3。它是一种内源性环状二肽，衍生自下丘脑促甲状腺素释放激素的氨基末端的焦谷氨酸残基在体内的水解去除。环(-His-Pro)均能通过常规化学方法体外合成。它在调节神经胶质细胞所贡献的性质中是重要的。Grotelli等人，环(His-Pro)在神经变性中的作用，Int J MolSci.2016.8月；17(8)：1332。环(His-Pro)在中枢神经系统中普遍存在，并且是有机阳离子转运蛋白的关键底物，其与神经保护作用强烈相关。环状二肽也能穿过脑-血-屏障，并且一旦进入脑中，能通过修饰Nrf2-NF-κB信号传导轴影响不同的炎症和应激反应。
环(-His-Pro)的结晶无水形式(“无水CHP”或“模式1”)是迄今为止文献中报道的形式，并具有潜在的治疗应用。然而，某些无水形式可能是不稳定的。使用模式1的可能缺点包括：(1)在环境为高湿度条件下明显的物理不稳定性；和(2)潜在化学不稳定性，源于水活性导致形成了所需的L,L-二肽，例如D,L-CHP、L,D-CHP或D,D-CHP的非对映异构体。因此，本领域需要CHP更稳定的形式。
发明内容
本发明提供了环(-His-Pro)水合物结晶形式(“CHP水合物”或“模式2”化合物)，其能够使用各种分析技术来表征并且区别于CHP的其它固体形式，所述分析技术包括但不限于X射线粉末衍射(XRPD)、固态核磁共振(NMR或13C SSNMR)、拉曼光谱、差示扫描量热法(DSC)、动态蒸汽吸附(DVS)和热重分析(TGA)。
申请人出乎意料地发现CHP水合物(CAS RN：2254826-95-2(2019年1月))具有优于无定形环(-His-Pro)或模式1的稳定性。基于这一惊人发现，模式2能够作为单组分药物单独使用，而不是使用模式1或模式1和模式2的混合物。
在一种实施方式中，本发明涉及一种通过使用溶剂结晶分离模式2的方法，而不是目前用于分离无水CHP的柱色谱法。
在另一种实施方式中，在典型的室温储存条件下模式2稳定约6个月、或约12个月、或约18个月、或约24个月、或约36个月。
在又一种实施方式中，本发明涉及基本上纯的模式2材料。在一些实施方式中，模式2材料纯度至少约90％，或至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％。
在一种实施方式中，样品的纯度通过任何分析方法测量。在一种实施方式中，纯度通过高压液相色谱(HPLC)、X-射线粉末衍射(XRPD)、pKa分析、偏振光显微镜(PLM)、热重分析/差热分析(TG/DTA)、差示扫描量热法(DSC)、傅里叶变换红外光谱(FT-IR)、动态蒸气吸附(DVS)、可变温度和湿度X-射线粉末衍射法(VT-/VH-XRPD)、1H核磁共振(NMR)和/或异核单量子相干(HSQC)NMR来测量。在另一种实施方式中，通过HPLC测量样品的纯度。
在一种实施方式中，通过HPLC测得模式2材料纯度至少约90％，或至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％。
在另一种实施方式中，模式2材料可以具有以下特征中的至少两个：
(a)X-射线粉末衍射图包括至少两个选自以下列举的峰：10、13.7、17、18.1、20.2和27.3度(2θ±0.2°)；
(b)pKa为约6.4；
(c)当通过偏振光显微镜分析时具有碎裂的棒状形态的双折射；
(d)初始重量损失为约6.5％(0.9当量的水)，随后当通过热重分析技术分析时，样品在约280℃下降解；
(e)在DSC的第一次热循环中，吸热在约99℃开始且在约102℃处出峰；
(f)在40℃动态蒸气吸附分析中，在低于约10％相对湿度(RH)下开始脱水，从10％至0％RH(0.8当量的水)损失约5.8重量％，并且从0％至约40％RH水合；
(g)在50℃动态蒸气吸附分析中，在低于约20％RH下开始脱水，从约20至0％RH(0.8当量的水)损失约6.1重量％，并且从0至约40％RH再水合；以及
(h)在60℃动态蒸气吸附分析中，在低于约20％RH下开始脱水，从约20至0％RH(1.0当量的水)损失约7重量％，并且从0至约40％RH再水合。
本发明还提供了包括含有模式2材料和赋形剂的药物组合物。这种组合物可以包括CHP水合物约1％至约50％、约5％至约45％、约10％至约40％、约15％至约35％、约20％至约30％、至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、约1％、约2％、约2％、约3％、约4％、约5％、约6％、约7％、约8％、约9％或约10％(w/w)。在一种实施方式中，该组合物可以包括CHP水合物约1％至约10％(w/w)。在一个具体的实施方式中，该组合物可以包括CHP水合物约4％(w/w)。
在另一种实施方式中，组合物能够制成片剂、胶囊、囊片、溶液凝胶、鳟鱼、可注射无菌溶液等形式。
或者，本文教导的组合物能够配制成粉末形式，用于在使用前用合适的载体如无菌无热原水重构。例如，适于肠胃外给药的化合物可以包括无菌等渗盐水溶液，所述溶液包含0.1％-90％重量/体积(0.1percent and 90percent weight per volume)的化合物。例如，溶液可以含有约5％至约20％，更优选约5％至约17％，更优选约8％至约14％，并且还更优选约10％的化合物。
本发明的组合物、方法等的其它实施方式将从以下描述、附图、实施例和权利要求中显而易见。从以上和以下描述中能够理解，本文所述的每个特征以及两个或更多个这种特征的每个组合都包括在本发明的范围内，只要这种组合中所包括的特征不相互矛盾。此外，任何特征或特征的组合能够从任何实施方式或方面中明确排除。在以下说明和权利要求中，特别是当结合所附示例和附图考虑时，阐述了其他方面和实施方式。
附图说明
专利或申请文件包含至少一个彩色附图。具有彩色附图的本专利或专利申请公开的副本根据请求并支付必要的费用后由官方提供。
通过参考以下详细描述并参考附图，将更容易理解实施方式的前述特征，在附图中：
图1是结晶模式1的X-射线粉末衍射图。
图2是(a)动态蒸汽吸附(DVS)后的模式1和(b)CHP的模式2的XRPD比较。这些结果确认所制备的CHP材料是模式2(即CHP水合物)并且模式1转变为DVS后的模式2。
图3是模式2在40％RH下DVS前和DVS后的X射线粉末衍射图的比较。
图4是模式2在VT-DVS后的X-射线粉末衍射图的分析。其显示该材料是模式1和2的混合物。
图5是在40℃/75％RH、80℃和环境光三个条件下储存七天的约30mg的模式2的X射线粉末衍射图的比较。
图6是在玻璃小瓶中称重并放入设定为50℃的真空烘箱中1小时的约2.2g的CHP水合物(模式2)的XRPD分析。
图7是被返回到真空炉中再进行30分钟的CHP水合物或模式2(蓝线：图5的样品)的XRPD分析。换句话说，图7中的紫色线是CHP水合物(模式2材料)在50℃真空下储存1.5小时后的产物的XRPD分析，主要显示了模式2中混入了一些模式1。
图8是被返回到烘箱中的CHP水合物或模式2(蓝线：来自图5的样品)的XRPD分析，在烘箱中温度升高到80℃。将小瓶置于烘箱内另外18小时。换句话说，图8中的粉色线是CHP水合物(模式2材料)在80℃下储存18小时后的产物的XRPD分析，主要显示了模式1中混入了一些模式2。
图9是模式2在不同温度下变化的比较。该图是图5-7的样品干燥三个不同时长的产物XRPD分析的叠加，并通过XRPD分析结果。绿线代表模式2样品在50℃储存1小时，紫色线代表模式2样品在50℃储存90分钟，粉红色线代表模式2样品(粉红色线)在80℃储存18小时。
图10示出了得到的材料(主要是模式1)的初始分析。pKa值为6.4。
图11示出了得到的CHP(主要是模式1)的非偏振显微镜分析。
图12示出了得到的CHP(主要是模式1)的偏振光显微镜分析。
图13示出了模式2的非偏振显微镜和PLM分析。
图14示出了得到的CHP(主要是模式1)的热重分析。
图15示出了模式2的热重分析/差热分析(TG/DTA)。
图16示出了得到的CHP(主要是模式1)在第一个热循环中的DSC分析。
图17示出了得到的CHP(主要是模式1)在冷却循环中的DSC分析。
图18示出了得到的CHP(主要是模式1)在第二个加热循环中的DSC分析。
图19示出了模式2在第一加热循环中的DSC分析。
图20示出了模式2在冷却循环中的DSC分析。
图21示出了模式2在第二个热循环中的DSC分析。
图22示出了CHP水合物的FR-IR光谱结果。
图23示出了模式1的DVS等温线图的结果，显示在60％RH和90％RH之间重量增加6.3％。
图24示出了模式1的DVS的等温曲线结果，接着在第一加热循环中重结晶显示在0-90％RH之间轻微吸湿，重量增加0.8％。
图25示出了模式1的DVS的动力学曲线的结果。
图26示出了DVS之前和之后材料的XRPD。DVS后XRPD分析显示了一种新形式，指定为模式2。
图27示出了CHP水合物、模式2的TG/DTA。
图28是DVS的等温线图，显示CHP水合物、模式2材料从40％RH到90％RH和10％RH到90％RH没有变化。
图29示出了CHP水合物、模式2的DVS的动力学图。
图30示出了CHP水合物、模式2在40℃进行单个循环之后的VT-DVS分析，显示材料在10％以下开始脱水，损失5.8％重量(相当于0.8摩尔水)。该材料在0-40％RH下再水合。
图31示出了CHP水合物、模式2在50℃下进行单循环之后的VT-DVS分析，显示材料在低于20％开始脱水，损失6.1％重量(相当于0.8摩尔水)。该材料在0-40％RH下再水合。
图32示出了CHP水合物、模式2在60℃进行单循环之后的VT-DVS分析，显示材料在低于20％开始脱水，损失7％重量(相当于1.0摩尔水)。该材料在0-40％RH下再水合。
图33示出了CHP水合物、模式2和模式1的VT-/VH-XRPD分析结果。
图34示出了在VT/DVS的各种条件之后，CHP水合物、模式2材料的XRPD衍射图。提供模式1的XRPD衍射图用于比较。
图35示出了模式1在DMSO-d6中的1H-NMR光谱。
图36示出了模式2在DMSO-d6中的1H-NMR光谱。
图37示出了模式1(蓝线)和模式2(红线)的1H-NMR光谱比较。
图38示出了模式1的HSQC-NMR谱。
图39示出了模式1和2的混合物的HSQC-NMR谱。
图40示出了在模式1的初始冷冻干燥之后的XRPD。
图41示出了模式1在延长冻干(72小时)后的XRPD，由XRPD发现从冷冻干燥回收的材料主要是无定形。
图42示出了模式2在初始冻干(72小时干燥)后的XRPD，发现从冷冻干燥返回的材料在干燥72小时后是模式2。
图43示出了模式1在各种溶剂中的近似溶解度。
图44示出了模式1基于加入的溶剂体积的溶剂溶解度结果。
图45示出了当模式1用各种溶剂处理时的多晶型物(polymorph)(模式1或模式2)。
图46示出了初级多晶型物筛选溶剂。
图47示出了在各种溶剂-部分1中形成的多晶型物的XRPD衍射图。
图48示出了在各种溶剂-部分2中形成的多晶型物的XRPD衍射图。
图49示出了在各种溶剂-部分3中形成的多晶型物的XRPD衍射图。
图50示出了初级多晶型物筛选温度循环。
图51是模式1(蓝色)和模式2(红色)的XRPD衍射图的叠加。
图52是代表性的空白色谱图。
图53是代表性的分辨率溶液色谱图(resolution solution chromatogram)。
图54是CHP无水物(模式1)和CHP水合物(模式2)之间总杂质的比较。
图55是模式1和模式2的LC-MS光谱，确认了预期的m/z为235.1，对应于[C11H14N4O2]H+。两种模式都得到与溶解在溶剂(水)中时相同的LC-MS，因为在溶剂中没有“固体形式”或多晶型物。LC-MS测量了可溶性CHP，而不是固体形式。
图56是得到的CHP的HPLC-UV色谱图。结果表明，得到的CHP纯度为99.5％。
图57是从溶剂溶解度筛选恢复的固体的XRPD衍射图。
图58-60是从温度循环恢复的固体的XRPD衍射图。
图61是模式2的XRPD衍射图谱。
图62是CHP在水中重复冷冻干燥得到的XRPD衍射图。
图63是CHP在水中第三次冻干尝试获得的XRPD衍射图。
图64-66是与来自于初级多晶型物筛选的温度循环实验相关的衍射图。
图67是与来自于初级多晶型物筛选的蒸发实验相关的衍射图。
图68是与来自于初级多晶型物筛选的反溶剂添加相关的衍射图。
图69是模式2放大的XRPD结果。
图70是当模式2材料加热到80℃时获得的材料的XRPD衍射图。
图71是在乙醇/DCM实验中快速旋转蒸发回收的固体的XRPD衍射图。
图72是模式2的初级多晶型物筛选的XRPD衍射图。
图73是在模式2的偏振光和非偏振光中的图像。
图74是CHP模式2的热台显微镜图像。
图75是材料热后阶段的偏振和非偏振图像。
图76是模式2的TG/DTA-TG分析。
图77是DSC的初始热循环，被认为吸热开始于99℃并在102℃出峰。
图78是DSC的冷却循环。
图79是DSC的第二次加热循环。
图80是CHP模式2的FT-IR光谱。
图81是与VT-/VH-XRPD分析相关的衍射图。
图82是CHP模式2的DVS等温线图。
图83是CHP模式2的DVS动力学图。
图84示出了比较XRPD衍射图。
图85是模式2在40℃的DVS等温线图。
图86是模式2在40℃的动力学图。
图87是模式2在50℃的等温线图。
图88是模式2在40℃的动力学图。
图89是模式2在60℃的等温线图。
图90是模式2在60℃的动力学图。
图91示出了比较XRPD衍射图。
图92示出了溶解后模式1样品的图像。
图93示出了溶解后模式2样品的图像。
图94是样品在40℃/75％RH、80℃和环境光条件下测试的XRPD 2Θ衍射图。
图95是稳定样品的HPLC色谱图之一。在40℃/75％RH下稳定1周。
图96是稳定样品的HPLC色谱图之一。在80℃下稳定1周。
图97是稳定性样品的HPLC色谱图之一。在环境温度下稳定1周。
图98是纯模式1两周时间点的XRPD 2Θ衍射图。
图99是模式2两周时间点的XRPD 2Θ衍射图。
图100是纯模式1四周时间点的XRPD 2Θ衍射图。
图101是模式2四周时间点的XRPD 2Θ衍射图。
图102是纯模式1八周时间点的XRPD 2Θ衍射图。
图103是模式2八周时间点的XRPD 2Θ衍射图。
图104是纯模式1-起始时间点的HPLC色谱图。
图105是纯模式1-两周的HPLC色谱图。
图106是纯模式1-四周的HPLC色谱图。
图107是纯模式1-八周的HPLC色谱图。
图108是纯模式2-起始时间点的HPLC色谱图。
图109是模式2-两周的HPLC色谱图。
图110是模式2-四周的HPLC色谱图。
图111是来自在40℃/75％RH下储存的XRPD结果。
图112是用于杂质测试的空白、分辨率溶液和样品溶液(6M)的代表性的重叠色谱图。
图113是初级多晶型物筛选蒸发(the primary polymorph screenevaporations)。
图114是初级多晶型物筛选汇总表。
图115是8周稳定性外观结果总结。
具体实施方式
本文将充分描述各个方面和实施方式。然而，这些方面和实施方式可以以许多不同的形式来体现，并且不应被解释为限制；相反，提供这些实施方式是为了使本发明详尽和完整，并且将向本领域技术人员充分传达本发明主题的范围。本文引用的所有出版物、专利和专利申请，无论是上文还是下文，均通过引用整体并入本文。
A.定义
除非另外定义，除非明确指出相反情况或从使用术语或短语的上下文中明显看出相反情况，否则本文所用的所有术语和短语均包括所述术语和短语在本领域中已达到的含义。尽管与本文所述的那些类似或等同的任何方法和材料可用于本发明的实践或测试，但现在描述具体的方法和材料。
除非另有说明，否则使用单个数值被陈述为近似值，如同在这些值之前有词语“约”或“大约”。类似地，除非另有明确说明，本申请中指定的各种范围中的数值被陈述为近似值，如同所陈述的范围内的最小值和最大值两者之前都有词语“约”或“大约”。以这种方式，在所述陈述的范围之上和之下的变化可用于获得与所述范围内的值基本相同的结果。如本文所用，术语“约”和“大约”在涉及数值时就与所公开的主题最密切相关的本领域普通技术人员或与所讨论的范围或元素相关的领域的普通技术人员而言，应具有清楚的和普通的含义。从严格的数值边界增宽的量取决于许多因素。例如，可以考虑的一些因素包括元素的关键程度和/或给定变化量对所要求保护的主题的性能的影响，以及本领域技术人员已知的其它考虑。如本文所用，对于不同数值使用不同量的有效数字不意味着限制使用词语“约”或“大约”将如何用于扩大特定数值或范围。因此，通常，“约”或“大约”扩大了数值。此外，公开的范围旨在作为连续范围，包括最小值和最大值之间的每个值加上通过使用术语“约”或“近似”提供的范围的增宽。因此，本文中对数值范围的叙述仅仅旨在用作单独地引用落入该范围内的每个单独值的简便方法，并且每个单独值被并入说明书中，如同其在本文中被单独地叙述。
术语“肠胃外给药”和“肠胃外地给药”是本领域公认的，并且是指除肠内和局部给药之外的给药模式，通常通过注射，并且包括但不限于静脉内、肌内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、心内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内和胸骨内注射。
如本文所用，术语“活性剂”或“药物”是指当施用于人或动物时引起生物化学反应的任何化学物质。药物可以作为生物化学反应的底物或产物，或者药物可以与细胞受体相互作用并引起生理反应，或者药物可以与受体结合并阻断受体引起生理反应。
如本文所用，术语“生物等效”是指两种组合物、产品或方法，其中对于AUC、部分AUC和/或Cmax的90％置信区间(CI)在0.80至1.25之间。
术语“CHP水合物”(a/k/a“模式2”)是指经2019年1月7日发布的CAS注册号：2254826-95-2鉴定的化合物。
短语“基本上纯的”是指物质具有大于90％、或大于95％、或大于96％、或大于97％、或大于98％、或大于99％、或大于99.5％的总纯度。例如，短语“基本上纯的物质A”是指相比于所有杂质物质A的纯度至少为90％，或相比于所有杂质物质A的纯度至少为95％，或相比于所有杂质物质A的纯度至少为98％，或相比于所有杂质物质A的纯度为至少99％。
在一种实施方式中，样品的纯度通过任何分析方法测量。在一种实施方式中，纯度通过HPLC、X射线粉末衍射(XRPD)、pKa分析、偏振光显微镜(PLM)、热重分析/差热分析(TG/DTA)、差示扫描量热法(DSC)、傅里叶变换红外光谱(FT-IR)、动态蒸汽吸附(DVS)、可变温度和湿度X射线粉末衍射法(VT-/VH-XRPD)、1H核磁共振(NMR)和/或异核单量子相干(HSQC)NMR来测量。
在一些实施方式中，当涉及X-射线粉末衍射图或差示扫描量热图时，术语“基本上如……所示”是指当被本领域普通技术人员考虑时，图不一定与本文所述的那些相同，但是落在实验误差或偏差的限度内。
术语“治疗有效量”是指当向需要这种治疗的人给药时，足以实现治疗的量，如下文所定义。治疗有效量将根据所治疗的人类受试者、人类受试者的体重和年龄、疾病状况的严重程度、给药方式等而变化，其可容易地由本领域普通技术人员确定。
B.引言
本发明涉及新化合物CHP水合物、其用途及其制备。其说明如下：
在2019年1月7日，CHP水合物被指定为CAS注册号(CAS RN)：2254826-95-2，具有CA索引名：吡咯并[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮,六氢-3-(1H-咪唑-5-基甲基)-，水合物(1:1)，(3S,8aS)-(Pyrrolo[1,2-a]pyrazine-1,4-dione,hexahydro-3-(1H-imidazol-5-ylmethyl)-,hydrate(1:1),(3S,8aS)-)。CHP水合物的分子量为252.3g/mol。
本领域技术人员理解，可以使用其它通常认可的命名系统和符号来命名或标识化合物结构。例如，化合物可以用通用名称、系统或非系统名称命名或标识。化学领域普遍认可的命名系统和符号包括但不限于，化学文摘社(CAS)和国际纯粹与应用化学联合会(IUPAC)。因此，按照CAS，以上提供的被标识为吡咯并[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮,六氢-3-(1H-咪唑-5-基甲基)-，水合物(1:1)，(3S,8aS)-的化合物结构可以用等同于CAS命名的其它命名来标识。
C.CHP水合物的一般表征
在一种实施方式中，CHP水合物具有的X-射线粉末衍射图(XRPD)包括在2θ为约13.7度、17度和约27.3度处的特征峰。在一些实施方式中，X-射线粉末衍射图还包括在2θ为约10度、约13.7度、约17度、约18.1度和24.5度处的特征峰中的任何一个或多个。
在一些实施方式中，CHP水合物具有约170℃-约172℃的熔融温度。在一种变化中，CHP水合物具有的X-射线粉末衍射图包括在2θ为约10度、约13.7度、约17度、约18.1度、约20.2度和约27.3度处的特征峰中的任何一个或多个。
应当理解，相对XRPD强度可根据许多因素而变化，包括样品制备、安装、以及用于获得光谱的仪器和分析程序和设置。因此，本文列出的峰值约定2θ包括±0.2度的变化。
在其它实施方式中，CHP水合物表征为具有通过差示扫描量热法测得的在约170℃的起始熔化温度。在其他实施方式中，CHP水合物基本上不含溶剂。
在CHP水合物的一些实施方式中，下列(a)-(f)中的至少一种、至少两种、至少三种、至少四种或全部适用：(a)CHP水合物基本上不含溶剂；(b)CHP水合物是结晶的；(c)CHP水合物具有基本上如图2(b)所示的X-射线粉末衍射图；(d)CHP水合物具有基本上如图19-21所示的差示扫描量热法热分析图；(e)CHP水合物具有通过差示扫描量热法测得的在约170℃的起始熔化温度；以及(f)CHP水合物在室温贮存条件下是稳定的。
在一些实施方式中，CHP水合物包括至少一种、至少两种或以下所有性质：
(a)基本上如图2(b)所示的X-射线粉末衍射图；
(b)基本上如图19-21所示的差示扫描量热法热分析图；
以及
(c)通过差示扫描量热法测定的起始熔融温度为约170℃。
在一些实施方式中，CHP水合物具有显示的至少两个最大峰的X射线粉末衍射图，基本上如图2(b)中所示的X射线粉末衍射图。在一些实施方式中，CHP水合物具有显示的至少三个最大峰的X射线粉末衍射图，基本上如图2(b)中所示的X射线粉末衍射图。在一些实施方式中，CHP水合物具有显示的至少四个最大峰的X射线粉末衍射图，基本上如图2(b)中所示的X射线粉末衍射图。在一些实施方式中，CHP水合物具有显示的至少五个最大峰的X射线粉末衍射图，基本上如图2(b)中所示的X射线粉末衍射图。在一些实施方式中，CHP水合物具有显示的至少六个最大峰的X射线粉末衍射图，基本上如图2(b)中所示的X-射线粉末衍射图。
D.药物组合物
在一个实施方式中，提供了包含基本上纯的模式2化合物和药学上可接受的载体的药物组合物。例如，药物组合物可以包含占药物组合物总量约1％到约20％(wt％)(即，约1％、约2％、约3％、约4％、约5％、约6％、约7％、约8％、约9％、约10％、约11％、约12％、约13％、约14％、约15％、约16％、约17％、约18％、约19％、约20％)的基本上纯的模式2化合物。作为进一步的例子，药物组合物可以包含占药物组合物总量约1％到约100％，约1％到约10％，约10％约20％，约20％到约30％，约30％到约40％、约40％至约50％、约50％至约60％、约60％至约70％、约70％至约80％、约80％至约90％、约90％至约100％(wt％)的模式2化合物。例如，药物组合物可以包含占药物组合物总量约1％到约40％(wt％)的模式2化合物。在一个具体的实施例中，药物组合物可以包含占药物组合物总量约4％(wt％)的模式2化合物。
在另一个实施方式中，提供了包含基本上纯的模式2化合物、另一种治疗活性剂和药学上可接受的载体的药物组合物。在一个实施方式中，活性剂选自生物分子、生物活性剂、小分子、药物、前药、药物衍生物、蛋白质、肽、疫苗、佐剂、显像剂(例如，荧光部分)、多核苷酸或金属。在另一个实施方式中，活性剂是锌。
在一个实施方式中，模式2原料药(drug substance)满足ICH纯度准则Q.2A关于CHP中杂质水平的要求。
在另一个实施方式中，本发明的组合物可以以多种方式给药，包括口服、局部、肠胃外、静脉内、皮内、结肠、直肠、肌内或腹膜内。
组合物可以被配制用于通过注射，例如通过推注(drug substance)或连续输注(continuous infusion)的肠胃外给药。注射用制剂可以添加任选的防腐剂以单位剂型(unit dosage form)存在于安瓿或多剂量容器中。肠胃外制剂可以封装在由玻璃、塑料等制成的安瓿、一次性注射器或多剂量小瓶中。制剂可以采取诸如在油性或水性媒介物中的悬浮液、溶液或乳液的形式，并且可以含有诸如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂的试剂。
例如，肠胃外制剂可以是在无毒的肠胃外可接受的稀释剂或溶剂中的无菌可注射溶液或悬浮液。在可接受的载体和溶剂中，可以使用的是水、0.9％盐水溶液或其它合适的含水介质。
在一种实施方式中，静脉内“溶液”制剂的浓度为约1mg/升至约200mg/ml，约5mg/ml至约150mg/ml，约10mg/ml至约100mg/ml。在另一种实施方式中，静脉内“溶液”制剂的浓度为约1mg/升，约2mg/升，约3mg/升，约4mg/升，约5mg/升、约6mg/升、约7mg/升、约8mg/升、约9mg/升、约10mg/升、约11mg/升、约12mg/升、约13mg/升、约14mg/升、约15mg/升、约20mg/升、约25mg/升、约30mg/升、约35mg/升、约40mg/升、约45mg/升、约50mg/升、约55mg/升、约60mg/升、约65mg/升、约70mg/升、约75mg/升、约80mg/升、约85mg/升、约90mg/升、约95mg/升、约100mg/升、约110mg/升、约120mg/升、约130mg/升、约140mg/升、约120mg/升、约130mg/升、约140mg/升、约150mg/升、约160mg/升、约170mg/升、约180mg/升、约190mg/升、约200mg/升。
在另一种实施方式中，组合物可以配制成扩散(缓慢滴注)制剂或静脉内推注注射剂(intravenous bolus injection)。
在另一种实施方式中，模式2化合物可口服给药或配制成口服给药。给药可以是通过速释放片剂和胶囊或肠溶包衣片剂等。在制备包含至少一种本文所述化合物的药物组合物时，活性成分通常用赋形剂稀释和/或被包封在可以是胶囊、小袋、纸或其它容器形式的载体中。当赋形剂用作稀释剂时，其可以是固体、半固体或液体物质的形式，其作为活性成分的媒介物、载体或介质。因此，组合物可以是片剂、丸剂、粉剂、锭剂、小药囊、扁囊剂、酏剂、混悬剂、乳剂、溶液、糖浆、气雾剂(作为固体或在液体介质中)、软膏、软和硬明胶胶囊、无菌注射溶液和无菌包装粉剂的形式。
一些合适的赋形剂例子包括乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、阿拉伯胶、磷酸钙、藻酸盐、黄蓍胶、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、羟丙基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、USP或无菌水、糖浆基质和甲基纤维素。所述制剂可另外包括：润滑剂，例如滑石粉、硬脂酸镁和硬脂酸；润湿剂；乳化剂和悬浮剂；防腐剂，例如羟基苯甲酸甲酯和羟基苯甲酸丙酯(methyl and propylhydroxy-benzonates)；甜味剂；和调味剂。
在一些实施方式中，组合物被配制成单位剂型。术语“单位剂型”是指物理上离散的单位，适合作为用于人类受试者和其它哺乳动物的单位剂量，每个单位含有经计算产生所需治疗效果的预定量活性物质(治疗有效量)，与合适的药物赋形剂(例如片剂、胶囊、安瓿)相关。化合物通常以药学上有效的量给药。在一些实施方式中，每剂量单位含有约1mg至约100mg的模式2化合物。在一些实施方式中，每剂量单位包含约2mg至约60mg、约3mg至约50mg、约4mg至约40mg、约5mg至约30mg、约6mg至约20mg、约8mg至约15mg或约8mg至约10mg的模式2化合物。
在其它实施方式中，每剂量单位含有模式2化合物约1mg，约2mg，约3mg，约4mg，约5mg，约6mg，7mg，约8mg，约9mg，约10mg，约11mg、约12mg、约13mg、约14mg、约15mg、约16mg，约17mg，约18mg、约19mg、约20mg、约30mg、约40mg、约50mg、约60mg、约70mg、约80mg、约90mg或约100mg。
在一种实施方式中，受试者每天接受一个或多个剂量单位。在另一种实施方式中，受试者每天接受15mg的模式2化合物。
为了制备固体组合物如片剂，将有效成分(active principle ingredient)与药物赋形剂混合以形成含有本发明的化合物的均匀混合物的固体混合共混物(mixed-blendcomposition)。当提及这些混合共混物为均匀时，是指活性成分(active ingredient)均匀地分散在整个组合物中，使得组合物可以容易地细分成同等有效的单位剂型，例如片剂、丸剂和胶囊。
本发明的片剂或丸剂可以是粉末包衣的或以其它方式复合的，以提供延长作用的优点或保护不受胃的酸性条件影响的剂型。例如，片剂或丸剂可以包含内部剂量和外部剂量组分，后者是前者上的包膜形式。这两种组分可被肠溶层分开，该肠溶层用于抵抗胃中的分解并允许内部组分完好地进入十二指肠或被延迟释放。多种材料可用于这种肠溶层或包衣，这种材料包括多种聚合酸和聚合酸与诸如虫胶、鲸蜡醇和醋酸纤维素的材料的混合物。在一种实施方式中，膜包衣是基于聚乙烯醇的包衣。
在组合物和方法中有用的化合物包括那些本文所述的任何其药学上可接受的形式，包括异构体如非对映异构体和对映异构体、盐、溶剂合物和多晶型物，以及本文中可适用的所述化合物的外消旋混合物和纯异构体。
合适的赋形剂包括粘结剂、填料、崩解剂、润滑剂、抗氧化剂、螯合剂和着色剂。
表1提供了用于口服剂型的示例性制剂，包括(基于所述成分的重量％)：
表1：口服剂型的示例性制剂包括(基于所述成分的重量％)
成分
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
CHP水合物
85
70
60
50
40
30
20
10
5
2
粘结剂
9
10
20
30
30
40
40
40
40
40
崩解剂
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
润滑剂
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
填料
0
14
14
14
24
24
34
44
49
52
E.CHP水合物的制备
在一些实施方式中，CHP水合物通过结晶获得。在50℃下将CHP无水物溶解在2-2.5v的EtOH/水或丙酮/水中，然后将体系冷却至35℃。接着，加入0.5v甲基叔丁基醚(MtBE)，然后加入0.5％晶种(CHP水合物)。搅拌2小时后，在2小时内将体系冷却至5℃。最后，在8小时内加入7v MtBE，然后搅拌8小时。
一批CHP模式1进行的溶解度评价表明，除具有最高百分比MtBE的乙醇：水：MtBE混合物外，在所有含水溶剂混合物中具有高溶解度。在水和水：丙酮混合物中观察到特别高的溶解度。该物质难溶于丙酮、乙腈和THF(≤10mg/mL)。两点溶解度实验表明，在所评价的两种溶剂体系(乙醇：水：MtBE和丙酮：水)中，乙醇：水：MtBE允许稍高的产率，但是存在形成模式1的风险；而丙酮：水允许模式2的排他性，但存在降低产率的风险。
使用CHP模式1进行两组小规模结晶试验(500mg规模)，第一组使用丙酮：水溶剂体系和第二组使用乙醇：水：MtBE溶剂体系。在5℃或50℃下添加反溶剂。无论溶剂体系或反溶剂添加温度如何，通过XRPD排他性地回收模式2。乙醇：水/MtBE产生较大的颗粒，特别是当在较高温度(50℃)下分离固体时。由于蒸发(特别是在乙醇：水：MtBE中)导致的溶剂损失，导致与过滤后回收的固体的质量相比低得多的计算产率。
这些结晶开发研究探索了冷却和反溶剂添加方案的组合，目的是获得良好的产率和颗粒均匀性。这些研究表明，在20g规模下，利用2％磨碎的晶种加入，逐步加入反溶剂，在29℃下保持八小时，然后冷却至5℃，证明是关于颗粒均匀性(通过光学显微镜和FBRM评价)和产率的最有希望的方案。
F.X射线粉末衍射(XRPD)
在一种实施方式中，本发明涉及基本上纯的如下的环(-His-Pro)水合物(模式2)化合物：
其特征在于，XRPD衍射图包含2θ为约17度(±0.2°)和约27.3度(±0.2°)的峰。
基本上纯的模式2的一种实施方式的特征在于X射线粉末衍射图包括选自以下列出的至少三个峰：2θ为13.7、17、18.1、20.2和27.3度(±0.2°)。另一种实施方式的特征在于XRPD衍射图包含至少两个选自以下列出的峰：2θ为10、13.7、17、18.1、20.2和27.3度(±0.2°)。
G.核磁共振(NMR)或13CSSNMR
在一种实施方式中，模式2的1H NMR光谱显示以下化学位移：1H NMR(400MHz，D2O)δ7.58(d，1H，J＝3.2Hz)，6.82(d，1H，J＝3.2Hz)，4.42(m，1H)，4.12(m，1H)，3.36-3.47(m，2H)，3.05-3.09(m，2H)，2.12(br，1H)，1.80-1.84(m，2H)，1.37-1.40(m，1H)。
在一种实施方式中，本发明的CHP水合物显示出与CHP-无水物在DMSO-d6溶剂中基本上相同的1H-NMR。这包括以下值：1.7ppm(m，3H)，2.1ppm(m，1H)，2.5ppm(s，3H)，3.2ppm(d，1H)，3.5ppm(m，1H)，4.2ppm(m，2H)，7.0ppm(s，1H)，7.6ppm(s，1H)，8.1ppm(s，1H)。
H.固体红外光谱仪
在一种实施方式中，模式2的固体红外光谱显示在3457、3411(m)；3292、3211(m)；2976、1658、1633(m)；和1445-1424(m)cm-1的信号。
I.差示扫描量热法(DSC)
在另一种实施方式中，发现模式2的起始吸热是约100±2℃和171±2℃，在其它实施方式中，本发明的模式2(CHP水合物)表现出起始吸热在约75℃至约100℃。
J.动态蒸发吸附(DVS)
在又一种实施方式中，模式2的动态蒸气吸附显示为以下一种或多种：
-在低于10％RH脱水，损失6±0.2重量％，并在40℃下从0％至40％RH再水合；
-在低于20％RH脱水，损失6±0.2重量％，并在50℃下从0％至40％RH再水合；以及
-在低于20％RH脱水，损失7±0.2重量％，并在60℃从0％至40％RH再水合。
在其它实施方式中，本发明的CHP水合物表现出约3％至约9％，或约4％至约8.5％，或约5％至约8％的重量损失。在另一种实施方式中，本发明的CHP水合物表现出约5.5％至约7.3％的重量损失。
在又一种实施方式中，本发明的CHP水合物表现出约5.8％至约7.0％的重量损失。
K.热重分析(TGA)
在另一种实施方式中，模式2的TGA在降解前显示6±0.5％的重量损失。
在其它实施方式中，本发明的CHP水合物在约75-85℃表现出至少一个吸热现象，即失水。在另一种实施方式中，本发明的CHP水合物在约115至约120℃处表现出至少一个放热现象，是重结晶成为模式1的现象。
L.熔化温度
在另一种实施方式中，模式2的熔化温度是170±2℃。
M.亚稳区宽度(MSZW)测量
在另一种实施方式中，在0％MtBE时没有沉淀表明发生结晶需要加入反溶剂。在10％MtBE下，观察到约43.2℃的亚稳区宽度。在20％MtBE下，CHP保留在溶液中，直到起始浓度＞100mg/mL。325和425mg/mL实验的亚稳区宽度分别确定为约35.2和约30.7℃。将MtBE含量增加到30％v/v，得到约30±0.5℃(在325mg/mL下)的MSZW。此外，在60MtBE％下，MSZW为51.4℃(在100mg/mL下)。在80％MtBE下，以100mg/mL和425mg/mL的浓度制备的样品在整个实验期间，甚至在较高温度下保持为浆料。在整个亚稳区域宽度分析中，注意到有一个趋势，即需要约56-61℃的温度才能获得清晰的点。
P.治疗方法
本发明的模式2化合物可以以治疗有效量用于治疗多种疾病和病症，例如糖尿病和其它代谢疾病、神经变性疾病、阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、亨廷顿氏病、急性肾损伤(AKI)、慢性肾病(CKD)、肾纤维化，以提供对氧化损伤的细胞保护，抑制PC12细胞系中的炎性反应，并作为食欲抑制剂。
实施例
以下实施例用于说明本发明的某些实施方式。然而，本领域技术人员应当根据本发明可以理解，在不背离本发明的精神和范围的情况下，可以对所公开的具体实施方式进行修改，并且仍然获得相同或类似的结果。因此，所有阐述的内容都应被解释为说明性的而非限制性的。
实施例1-模式1(无水CHP)向模式2(CHP水合物)的转变
在80℃下将2g的模式1材料(批号PS00726-55-D)溶解在1mL水中，为了抵消大量的蒸发，再加入1mL水。在80℃下，得到澄清的深棕色溶液。接着，将溶液快速冷却至50℃，并向溶液中加入9.5体积(19mL)丙酮，得到浅黄色溶液。未检测到油化(oiling)或沉淀。将溶液冷却至室温，引起大量的固体沉淀。将溶液冷却至6℃(提高产率)，并将该浆液过滤。在过滤器上干燥固体以防止脱水。因为在真空下在80℃或更高温度下脱水成模式1，在50℃真空干燥被认为对于保存模式2是安全的。XRPD确认产物为模式2，产率为约72％。
通过各种技术分析一批CHP水合物，包括：X射线粉末衍射(XRPD)、pKa分析、偏振光显微镜(PLM)、热重分析/差热分析(TG/DTA)、差示扫描量热法(DSC)、傅里叶变换红外光谱(FT-IR)、动态蒸汽吸附(DVS)、可变温度和湿度X射线粉末衍射法(VT-/VH-XRPD)、1H核磁共振(NMR)和异核单量子相干(HSQC)NMR。
A.X射线粉末衍射(XRPD)
在PANalytical X'pert pro上进行XRPD分析，在2θ为3和35°之间扫描样品。轻轻研磨材料以放开任何团聚物，并装载到具有Kapton或Mylar聚合物膜的多孔板上以支撑样品。然后将多孔板放入衍射仪中，并使用Cu K辐射源(α1：α2比＝0.5)在采用40kV/40mA发电机设备的透射模式(步长2θ为0.0130°)下运行进行分析。
如图1所示，该批料经XRPD结晶，并指定为模式1。对5g CHP水合物的样品进行XRPD分析。在玻璃小瓶中称重样品，并加入6mL的90:10的乙醇/水混合物以制备浆液。然后将混合物在环境温度下搅拌约24小时，然后通过XRPD分析。如图2所示，确认该材料为模式2(图2(b))。如图3所示，DVS后对模式2的分析显示在40％RH下DVS后形式上没有变化。如图4所示，模式2的分析显示在各种温度DVS(VT-DVS)之后，材料是模式1和2的混合物。如图5所示，将大约30mg模式2(黑线，图5)在三种条件下储存七天：40℃/75％RH、80℃、环境光。进行XPRD分析以评价在材料形式上的任何变化。七天后，在40℃/75％RH下储存的样品(蓝线，图5)和在环境光下储存的样品(绿线，图5)中没有观察到变化。在80℃下储存的样品转化成模式1(红线，图5)。如图7所示，模式2样品(图7的蓝线)返回到真空烘箱中再保持30分钟。XRPD分析(图7的紫色线)显示材料仍然主要是模式2，并带有一些模式1的峰。
如图6所示，在玻璃瓶中称量CHP水合物(模式2)，并置于设定为50℃的真空烘箱中1小时。XRPD分析(绿色线条)表明该材料仍然主要是模式2，带有一些模式1的峰。
如图8所示，将来自图5(黑线)的进料(input material)返回到烘箱，在烘箱中温度升高至80℃。将小瓶置于烘箱内另外18小时。XRPD分析(粉色线)显示该材料是模式1和2的混合物。在2θ为8°处存在一个额外的峰，是在之前任何模式中都未看到过。如图9所示，图5的模式2以三个不同的时间周期干燥，并通过XRPD分析结果。样品在50℃下干燥1小时产生带有模式1的峰的模式2(绿线)，样品在50℃下干燥90分钟也产生带有模式1的峰的模式2(紫线)，和样品在80℃下干燥18小时显示模式1和模式2的混合(粉色线)。
图34总结了模式2转变为模式1的不同条件。在0％RH和80℃下(试验2(run 2)，红线)处理模式2的样品(黑线，图34)在20分钟内将模式2转变为模式1(试验3(run 3)，蓝线)，而在0％RH和环境温度下甚至1小时后它仍保持为模式2(红线)。模式2在40％RH和环境温度下稳定(试验1(run 1)，棕色线)。
B.pKa分析
通过电位技术对模式1进行pKa分析，该技术是酸/碱滴定以测定pKa点。
如图10所示，无水CHP(模式1)分析的结果是pKa值为6.4。
C.光学显微镜(非偏振)和偏振光显微镜(PLM)
带校准的Linkam THM600热台的光学显微镜进行视觉测量，具有与Olympus BX50偏振显微镜耦合的连接控制器单元，该偏振显微镜配备有Motic照相机和图像捕获软件(Motic Images Plus 2.0)。将大约0.5mg材料置于显微镜盖玻片上并以10℃/min的速率加热，以常规间隔拍摄图像以记录任何热转变。除非另有说明，所有图像都使用10x物镜记录。
使用装备有Motic照相机和图像捕获软件(Motic Image Plus 2.0)的OlympusBX50偏振显微镜进行(PLM)分析。除非另有说明，所有图像都使用20x物镜记录。通过PLM测定结晶(双折射)的程度。偏振光显微镜被设计为观察和拍摄可见的样本，主要是由于样本的光学各向异性的特性。
图11(非偏振显微镜)和12(偏振光显微镜)证明所提供的CHP(主要是模式1)是双折射的，没有清晰的形态。如图13所示，发现模式2是双折射的，具有碎片、棒状形态。在其它实施方式中，本发明的CHP水合物(模式2)在PLM下显示了碎片棒状形态。
D.热重量分析/差热分析(TG/DTA)
将大约5mg的材料称重到敞开的铝盘中，并装入Seiko 6200/7200同步热重/差热分析仪(TG/DTA)中，且保持在室温下。然后以10℃/分钟的速率将样品从20℃加热至300℃，在此期间记录样品重量的变化以及任何差热现象(DTA)。氮气用作吹扫气体，流速为300cm3/min。
如图14所示，模式1的TGA分析显示在约75-85℃下初始重量损失为0.6％(0.08当量的水)。这种0.6％的水属于表面水-非结合水。样品在约260℃降解之前，观察到另外两次重量损失，0.2％和0.3％(分别为0.03和0.04当量的水)。第一次重量损失可能是由于少量混合在材料中的模式2材料失水形成模式1。基于重量损失，该失水量估计为8％。在约100℃下的第二次失水可能是由于未结合的表面水的蒸发。DT分析确定了一个急剧的吸热现象，其起始值为170℃，出峰为172℃。
如图15所示，模式2的TGA分析显示6.5％的初始重量损失(0.9当量的水)，随后在约280℃样品降解。DT迹线证明了与初始重量损失有关的吸热现象。随后是在118℃的放热现象(重结晶至模式1)。在170℃观察到的第二吸热和在172℃处的出峰被认为是样品熔融。在其他实施方式中，本发明的CHP水合物在约75-85℃下表现出至少一种吸热现象，其是失水。在另一种实施方式中，本发明的CHP水合物在约115-约120℃表现出至少一个放热现象，是重结晶成为模式1的现象。
E.差示扫描量热法(DSC)
通过将约5mg的材料称重至铝制DSC盘中并用穿孔铝盖非气密性地封闭进行DSC。然后将样品盘装入Seiko DSC6200(配有冷却器)中冷却并保持在20℃。一旦获得稳定的热流响应，将样品和参比样品以10℃/min的扫描速率加热至250℃，并监测所得的热流响应。氮气用作吹扫气体，流速为50cm3/min。
如图16所示，模式1的第一热循环显示在75℃开始且在85℃出峰的小而宽的吸热峰。这与图14中于TG/DTA中观察到的0.6％的重量损失一致。在169℃观察到第二次大的吸热现象，并且在171℃出峰。这与在TG/DTA中看到的熔融物一致。图16中的第一个宽峰可能是由于模式2脱水转为模式1。图16中的第二个峰可能是图案1的熔融物。
如图17所示，在冷却循环中没有观察到热现象。如图18所示，在第二次热循环中约80℃观察到非常小的宽峰，潜在玻璃化转变点。
如图19所示，模式2的第一次热循环辨认出从99℃开始并在102℃出峰的吸热。样品被观察到从170℃开始并在173℃出峰的熔化。这与TG/DTA中观察到的数据一致。如图20所示，在模式2的冷却循环中没有观察到热现象。
如图21所示，在CHP水合物第二次加热循环的77℃观察到可能的玻璃化转变点。
在一种实施方式中，本发明的CHP水合物表现出从在约75℃至约100℃处开始的吸热。
F.傅里叶变换红外光谱(FT-IR)
在Bruker ALPHAP光谱仪上进行FR-IR。将足够的材料放置在光谱仪板的中心，并且使用以下参数获得光谱：分辨率：4cm-1，背景扫描时间：16次扫描，样品扫描时间：16次扫描，数据收集：4000-400cm-1，结果光谱(result spectrum)：透射率，和软件：OPUS第6版。
如图22所示，模式2的FT-IR与结构一致。模式2的固体红外光谱显示信号在3457,3411(m)；3292，3211(m)；2976；1658；1633(m)；和1445-1424(m)cm-1。在其它实施方式中，本发明的CHP和CHP水合物显示了基本上相同的IR光谱，其显示了从约500cm-1至约1660cm-1至少九个谱带。由于晶格中的水(水合物)，模式2在3457和3411cm-1具有拉伸，而模式1没有。
G.动态蒸汽吸附(DVS)
通过将约10-20mg样品放入网状蒸气吸附天平底盘中并通过表面测量系统装入DVS固有动态蒸气吸附天平中进行DVS。使样品经历按10％的增量从相对湿度(RH)为40％至90％增加配置(ramping profile)湿度，在每个步骤保持样品直到在25℃获得稳定重量(dm/dt 0.004％，最小步长30分钟，最大步长500分钟)。在吸附循环完成后，使用相同程序将样品干燥至0％RH，然后二次吸附循环回到40％RH。进行两个循环。绘制吸附/解吸循环期间的重量变化，考虑测定样品的吸湿性。然后对任何保留的固体进行XRPD分析。
如图23所示，模式1的DVS的等温线图显示从60％RH到90％RH有6.3％的重量增加，表明转变为CHP水合物，模式2。如图24所示，在转变为模式2之后，该材料在0％至90％RH之间仅呈现出最大吸收为0.8wt％的轻微的吸湿性，这被认为是表面水，而不是晶体结构的一部分。这种现象如图25所示，模式1的DVS的动力学图显示模式1最初水合形成模式2，但在解吸阶段不失水，表明0.8％的轻微重量增加不是固体结构的一部分。
如图26所示，对模式1的DVS后(post-DVS)的XRPD分析显示了一种新形式，认定为模式2。如图27所示，对模式2的DVS后的TG/DTA分析显示了6.8％的初始重量损失(0.95当量的水)，接着在约280℃下样品降解。DT迹线确定与重量损失相关的吸热现象，接着重结晶(对于模式1)，放热现象在约120℃，然后熔融从168℃开始且在172℃出峰。
CHP模式2被置于几个较高温度条件下，以检测在0％-90％湿度下的脱水/再水合：25℃(图28)；40℃(图30)；50℃(图31)；和60℃(图32)。
如图28所示，DVS的等温曲线显示模式2材料在40％至90％RH和10％至90％RH之间没有变化。然后该材料在10％RH以下损失3.5重量％，并从0％至90％RH再水合。如图29所示，DVS的动力学曲线显示在500分钟内从80％到0％RH的解吸阶段期间CHP水合物损失了3.5％的水(红线)。如图30、31和32所示，模式2在40℃、50℃和60℃下经历单循环。40℃显示该材料在低于10％RH时开始脱水，从10％-0％RH损失了大约5.8重量％(0.8当量水)。该材料从0％到40％RH时水合(图30)。50℃下显示该材料在低于20％RH时开始脱水，从20％至0％RH损失了大约6.1重量％(0.8当量水)。该材料从0％到40％RH时再水合(图31)。60℃分析显示该材料在低于20％RH时开始脱水，从20％至0％RH损失了大约7重量％(1.0当量水)。该材料从0％到40％RH时再水合(图32)。
在其它实施方式中，本发明的CHP水合物表现出约3％至约9％，或约4％至约8.5％，或约5％至约8％的重量损失。在另一种实施方式中，本发明的CHP水合物表现出约5.5％至约7.3％的重量损失。
在又一种实施方式中，本发明的CHP水合物表现出约5.8％至约7.0％的重量损失。
H.可变温度和湿度的X射线粉末衍射仪(VT-/VH-XRPD)
对模式2材料进行VT-/VH-XRPD分析。将模式2在40％RH和环境温度下进行初始扫描。当RH在环境温度下降低到0％时，试验2保留为模式2。将温度升高至80℃，并将样品放置20分钟，然后进行扫描。得到的衍射图表明，制得的材料是纯的模式1。在80℃和0％RH下80分钟后仍保持纯的模式1。图33显示了这些结果。
图34示出了在各种VT/DVS之后模式2材料的XRPD。在其它实施方式中，在室温下从至少约0％至约90％RH出现本发明的CHP水合物。在另一种实施方式中，在80℃下0％RH，100％的模式2转变为模式1。
I.1H核磁共振(NMR)
使用配有DCH冷冻探针的Bruker AVIIIHD光谱仪在500.12MHz下(对质子)进行NMR。在氘代DMSO中进行实验，并将每个样品制备成浓度为约(ca.)10mM。模式1CHP(DMSO-d6)的1H-NMR谱图显示结果与化合物(图35)的结构一致。图36提供了模式2(DMSO-d6)的1H-NMR谱图。模式2和模式1CHP显示相同的NMR谱图，两者完全溶解在溶剂中。如图37所示，对干燥的材料模式2(图9的粉红色线条)进行NMR。干燥材料与模式2进料相比，没有观察到变化。
在一种实施方式中，本发明的CHP水合物显示出与在DMSO-d6溶剂中的CHP-无水物基本上相同的1H-NMR。
J.异核单量子相干性(HSQC)NMR
使用Bruker 500MHz NMR设备对模式2进行HSQC-NMR。DMSO-d6用作NMR样品溶剂。如图38所示，模式1的结果显示两个咪唑C-H的化学位移为4.2ppm。
对干燥的材料，模式2(图9的粉红色线条)进行HSQC-NMR实验。如图39所示，结果表明干燥的材料(模式1和模式2的混合物)和模式2材料的NMR是相同的。
K.冻干
对溶解度筛选：将330mg CHP模式1溶解(在温和加热下)在水(3.3mL)中，并等分到33个小瓶中。然后将这些小瓶在-50℃下冷冻，然后冷冻干燥过夜。众所周知，冷冻干燥结晶化合物产生的无定形物质通常比给定化合物的结晶形式更易溶。
如图40所示，从模式1的冷冻干燥恢复的材料当以XRPD分析时显示出一些结晶峰。申请人认为，这些初始的峰表明了水合物和无水形式的混合物，该无水形式与无定形形式混合在一起。
对于另一轮冻干，将图40的每10mg样品重新溶解于200μL水中。将小瓶再次冷冻于-50℃下，然后冷冻干燥72小时。从冷冻干燥恢复的材料经XRPD分析主要是无定形的，如图41所示。
对于非晶化测试(amorphization test)：将CHP水合物(模式2)溶解在蒸馏水中。将该溶液等分到26个玻璃小瓶中，并将小瓶在-50℃下冷冻以准备冷冻干燥。一旦冷冻，将样品置于与冷冻干燥器相连的干燥器中，干燥约48小时。如图42所示，当通过XRPD分析时，发现从模式2的冷冻干燥恢复的材料是模式2。
对于另一轮非晶化，通过向每个小瓶中加入1mL蒸馏水将样品重新溶解。然后将溶液用移液管移入26个20mL的玻璃小瓶中，并用另外的15mL蒸馏水盖住。将小瓶在-50℃下冷冻，然后冷冻干燥约48小时。48小时后，样品没有完全冻干，将小瓶放回干燥器中，再冷冻干燥72小时。发现通过XRPD分析的材料仍然包含模式2的峰。
在其它实施方式中，本发明的CHP水合物的冷冻干燥表明模式2比模式1更稳定，并且在无定形化后保持至少约10％至约40％的纯度。
L.溶解性筛选
将CHP模式1(无水形式)的33×10mg样品在2mL小瓶中冻干，并将100μL不同的溶剂体系加入到每个小瓶中。在每次添加之间，检查混合物的溶解，如果观察到没有溶解，则将混合物加热至约40℃并再次检查。在加入300μL溶剂后，加入100μL等分试样。继续该过程直到观察到溶解或直到加入1mL溶剂。如果没有发生溶解，通过过滤分离固体，收集并进行XRPD分析。如果发生溶解，则蒸发溶剂，收集留下的任何固体进行XRPD分析。
图43提供了模式1在各种溶剂中的近似溶解度，图44提供了模式1基于加入的溶剂体积的溶剂溶解度结果。如图43和44所示，在乙醇、甲醇、N,N-二甲基乙酰胺、水、DMSO、三氟乙醇、1-丙醇和甲醇/水混合物中观察到高溶解度。将样品不加盖子以允许蒸发，并通过XRPD分析观察到的固体。
如图45所示，XRPD分析确定了除了来自动力学溶解度筛选的模式1(结晶形式)之外的2种独特模式，尽管模式3仅作为与模式2的混合物出现。丙酮、二氯甲烷(DCM)、甲酸乙酯和MtBE生成模式2(水合物形式)。在乙醇中观察到结晶形式和水合物形式的混合物。氯苯产生模式2和3的混合物，THF主要恢复了具有一些模式2的峰的无定形材料。在甲醇中看到无色凝胶，没有以XRPD分析。溶剂系统在蒸发过程中产生晶体，并被认为是潜在的THF溶剂化物。
如图45所示，所列30种溶剂体系中的9种产生的固体不足以进行XRPD分析。16种溶剂恢复的模式2，在1-丙醇中观察到模式1，在乙醇中观察到模式1和2的混合物，在氯苯中产生模式2和3的混合物，在THF中主要产生具有一些模式2的峰的无定形物质。
图46说明了初级多晶型物筛选溶剂。
在其它实施方式中，本发明的CHP水合物可以产生自来自1-丙醇、2-丙醇、甲醇/水混合物、丙酮、乙腈、乙酸乙酯、甲酸乙酯、庚烷、乙酸异丙酯、甲乙酮(MEK)、甲基异丁基酮、硝基甲烷、甲苯和三氟乙醇的动力学结晶(2-6小时)。
M.初级多晶型物筛选
向含有40mg无水CHP的24个小瓶中以100μL等分试样加入不同的溶剂，直到观察到稀浆料为止。然后在环境温度和40℃之间在72小时内按4小时循环对小瓶进行温度循环。通过离心分离所有剩余的固体，并通过XRPD进行分析。
图46显示了用于动力学(2-6小时)多晶型物筛选的溶剂，图50显示了模式1的初级多晶型物筛选温度循环。
结果表明，当样品中存在水时，模式2占优势。只有当样品中存在的水不充足时，才形成模式1，其中水来自样品本身、溶剂体系或从大气中吸附得到。这些结果总结在表24和25中。
实施例2-CHP水合物的制备过程
进行该研究旨在(1)评价将模式1(无水，C16081735-D)转变为模式2(水合物，模式2)的转变过程；(2)通过使用指定制造商储存的非GMP的CHP模式1(无水)评价在约100克规模下的示范运行(demonstration run)；(3)在现行良好生产质量管理规范(cGMP，CurrentGood Manufacturing Practice regulations)条件下生产约400g的模式2；和(4)评价干燥条件以确保得到期望的模式2(水合物，模式2)。
规格设定如下：HPLC纯度：≥98.0％；杂质分布：H-His-OH≤1.0％，彼此独立≤1.0％；手性纯度：≥98.0％；手性杂质：报告各杂质≥0.1％；DL、LD、LL光学异构体≤1.0％等。
开发了一种可重现的方法，用于通过将模式1(无水物)溶解在EtOH/H2O＝9/1(v/v)中并通过添加MtBE沉淀模式2(水合物)来制造模式2(环(L-His-L-Pro)二肽水合物)。该方法已经在370g规模的cGMP批次上成功实施。最后，在cGMP条件下生产总共288g具有99.9％HPLC纯度和100.0％手性纯度的模式2(CHP水合物)。
A.合成方案的介绍
评价将模式1(无水物)转变为模式2(水合物，模式2)的方法。提供两种结晶方法，一个是将无水固体溶解在水中并且通过加入丙酮沉淀(参见合成方案1)；另一种是将无水固体溶解在EtOH/水＝9/1中并通过加入MtBE沉淀(参见合成方案2)。评价了两个过程的质量和产率，并确定方案2用于优化工作。
最后，成功地施行优化的方法(见方案3)生产了288g的模式2(CHP水合物)。生产过程遵循方案3。
方案1：合成模式2(CHP水合物)的第一种合成路线
方案2：合成模式2(CHP水合物)的第二种合成路线
方案3：模式2(CHP水合物)用于cGMP生产的优化合成路线
评价两种流程(方案1和2)，得到产物为有目标模式2的水合物。研究两种条件下的化学稳定性，模式2在50℃下稳定20小时。然而，水/丙酮流程使用非常少量的水(1v)作为良溶剂，并且难以选择具有如此小的最小搅拌体积的合适反应器。此外，水/丙酮流程仅得到约70％的分离产率。选择EtOH/H2O/MtBE流程用于优化工作，有大约90％的分离产率。在优化的结晶流程之后，在实验室(kilo-lab)中成功地实行370g规模的cGMP批次生产。
B.总结
对于模式2的制备，评价了用水/丙酮和EtOH/H2O/MtBE的两种结晶流程，两者得到的产物都为有目标模式2的水合物。研究了在两种条件下的化学稳定性，产物在50℃下稳定20小时。考虑到水/丙酮流程仅产生约70％的分离产率，选择EtOH/H2O/MtBE流程用于优化工作。研究MtBE的添加温度和添加速率，并且以相对慢的速率在5℃下完成添加MtBE的过程，以避免使大量的固体附着于容器的壁上。在优化的结晶流程之后，进行100g规模的一次实验，成功地结晶得到96.44g模式2产物，具有约90％的分离产率。基于干燥稳定性研究，水合物产物在-0.09MPa下的实验室烘箱中低于40℃是稳定的。
C.水/丙酮条件下的结晶流程的评价
进行两次试验以评价用水/丙酮条件的RFP结晶流程(表2)。在实验PS03027-2中无晶种时没有观察到结晶，并且在晶种添加后沉淀出固体。在实验PS03027-4中加入晶种，结晶顺利进行。XRPD表明获得了目标模式2。在水/丙酮体系中损失的产物相对较高(约20％)，这与RFP的产率(72％)一致。
表2.CHP水合物的制备结果
注：通过在室温将1倍体积的水重新浆化模式1来制备晶种
D.另一种用EtOH/水/MTBE的结晶流程的评价
进行5g规模的一批次以评价替代的EtOH/水/MTBE结晶条件，在MtBE加入期间晶体成核，并且XRPD显示获得了目标模式2。母液中的损失比水/丙酮条件相对低(8％)(表3)。
表3.CHP水合物的制备结果
E.研究在水/丙酮和EtOH/水/MtBE中的化学稳定性
在不同温度下在不同溶剂体系中研究化合物的溶液状态化学稳定性(表4)。将溶液保持在50℃和80℃，并跟踪溶液的纯度。该化合物通常稳定至少20小时。
表4.在水/丙酮和EtOH/水/MtBE中的化学稳定性
F.CHP水合物的溶解度的研究(模式2)
研究CHP水合物在水/丙酮和EtOH/水/MtBE中的溶解度，发现在两种条件下对溶剂比和温度敏感(表5和6)。EtOH/水/MtBE结晶中的产率为90％或更高。
表5.模式2在水/丙酮中的溶解度
表6.模式2在EtOH/水/MtBE中的溶解度
注：1)批号PS03027-2-H用作模式2材料。
G.EtOH/水/MtBE条件的工艺优化
为了进一步理解在EtOH/水/MtBE中的结晶，进行三个实验，其中分别在50℃、35℃和5℃下添加MtBE。如表7所示，三个实验提供了所需的晶形，并且残余溶剂很低。
表7.EtOH/水/MtBE中的工艺优化(5g规模)
为了验证在较大规模下的过程，进行了三次15g规模的实验，如表8所示。在实验PS03027-13和PS03027-14(其中在50℃和35℃下加入MtBE)期间，观察到结壳问题。大量的固体附着在容器壁上，尤其是在MtBE添加期间。为了避免这个问题，在实验PS0027-15中，在5℃下加入MtBE，并将加入延长至8小时(在以前的实验中为4小时)。发现壁上的硬壳少得多。因此得出结论，MtBE应该以相对慢的速率在5℃下加入。
表8.EtOH/水/MtBE中的工艺优化(15g规模)
H.快速添加MtBE的应力测试
如表9所示，对该方法进行应力测试，其中以相对快的速率进行MtBE添加。在实验期间跟踪固体的XRPD，数据表明在结晶过程中都观察到模式2。
表9.快速添加MtBE的应力测试
I.研究EtOH/水/MtBE中的形式稳定性
为了研究在EtOH/水/MtBE中的形式稳定性，通过加入100mg无水模式1固体和100mg模式2固体，分别在50℃、35℃和5℃下进行竞争性重复试验。如表10所示，模式1和模式2的混合形式在不同条件下快速转变为模式2。
表10.模式1和模式2在EtOH/水/MtBE中的竞争性浆料
注：进料：将100mg无水固体(模式1，批次#PS00726-55-D)与100mg模式2固体(批次#PS03027-5/9/10/11-H)一起加入。
J.研究在35℃、40℃、50℃和65℃下的干燥稳定性
干燥稳定性分别在35℃、40℃、50℃和65℃下进行。如表11所示，模式2在高达40℃下至少稳定4天。
表11.35℃、40℃、50℃和65℃下的干燥稳定性
K.研究浆化流程以将较差的晶体转变回模式2
因为过度干燥(KF＝5.4％，理论值为7.4％)导致对于模式2(模式218001)的cGMP批次结晶度较低，甚至当在35-40℃干燥10小时也是如此。为了将差的晶体模式2固体转变为所需的模式2，进行两次再浆化实验。在RT和5℃下，将2g模式218001-STEP5.7在8体积EtOH/水/MtBE＝9v/1v/30v中重新制浆，发现仅在30分钟内转变为模式2。分离固体并干燥14小时，在此期间晶型(form)不变。基于母液浓度的损失为约5％(而预期总损失为10％，包括在烧瓶壁和操作中的损失)。一个优点是，该流程实现所有固体转变为模式2，尽管可能损失约10％的产物。
L.从模式1到模式2的一般路线
1.在N2下将EtOH(1.75-1.79X；2.25v)加入R1中
2.在N2下将净化水(0.245-0.255X；0.25V)加入R1中
3.将R1搅拌5-10分钟，得到EtOH/水＝9:1(v/v)的混合溶液。
4.将溶液从R1转移至桶(drum)
5.将模式1(1.0当量，1.0X)加入R1。
6.在N2下，将来自步骤4的EtOH/水混合物(1.61-1.63X，2.0V)加入到R1中
7.在N2下将R1调节至47-53℃。
8.在N2下于47-53℃搅拌R1 10-60分钟。
9.将从R1至R2的溶液精过滤(Polish filter)。将R2的夹套预热至50-55℃。
10.在N2下，将来自步骤4的EtOH/水混合物(0.39-0.41X；0.5V)加入到R1中
11.在N2下搅拌R1 5-30min
12.将从R1至R2的溶液精过滤
13.将R2调节至47-53℃并在N2下搅拌10-60分钟。由项目领导人确认完全溶解。
14.在N2下将R2调节至32-37℃。
15.在N2下，在32-37℃下将MtBE(0.36-0.38X；0.5V)缓慢加入R2中。
16.在32-37℃下，向R2中加入模式2型晶种(0.015-0.025X)。
17.在N2下于32-37℃搅拌R2 2-3h。
18.在N2下在2-3小时内将R2调节至3-8℃。
19.取样过滤，送滤饼进行XRPD分析：XRPD(与PS03027-15-H一致)。
标准：如果结果符合规格，则执行步骤20；否则，咨询项目领导人。
20.在N2下于3-8℃，将MtBE(5.1-5.3X；7v)经8小时加入R2中。
21.在N2下于3-8℃搅拌R2 8-10h。
22.取样过滤，送滤饼进行XRPD分析：XRPD(与PS03027-15-H一致)；将滤液送去进行残留模式2分析：上清液中的残留H(≤1.5％w/w)。
标准：如果结果符合规格，则执行步骤25；否则，执行步骤23。
23.在N2下于3-8℃搅拌R2 4-10h。
24.取样过滤，送滤饼进行XRPD分析：XRPD(与PS03027-15-H一致)；将滤液送去进行残留H分析：上清液中的残留H(≤1.5％w/w)。
标准：如果结果满足规格，则执行步骤25。
25.在N2气氛下于在3-8℃过滤该悬浮液。
26.将EtOH(0.355X)、纯水(0.05X)和MtBE(1.11X)装入干净的桶(drum)中。
27.搅拌步骤26中的物料，得到澄清的混合物溶液。
28.将步骤27的溶液(1.5-1.6X)转移至R2中以漂洗(rinse)R2。
29.冷却R2至3-8℃。
30.在3-8℃下用R2漂洗溶液洗涤湿滤饼。
31.检查湿品质量：
XRPD(与PS03027-15-H一致)；HPLC≥98.0％面积；H-His-OH≤1.0％面积，每个其它个体(each other individual)≤1.0％面积；报告各杂质≥0.05％面积带有RRT
注释：并行执行步骤32。
标准：如果结果满足规格，则执行步骤33。
32.检查母液中残留的模式2。报告模式2的剩余量(％，报告)。
33.在35-40℃下真空干燥10-12小时。建议烘箱内置水浴避免过度干燥。
34.检查残留溶剂：
EtOH(≤5000ppm)；MtBE(小于或等于5000ppm)；含水量(报告)
检查干燥产物的多晶型物：XRPD(与PS03027-15-H一致)
标准：如果结果符合规格，则进行步骤37；否则，执行步骤35。
35.在35-40℃下真空干燥5-8小时。建议烘箱内置水浴避免过度干燥。
36.检查残留溶剂：
EtOH(≤5000ppm)；MtBE(小于或等于5000ppm)；含水量(报告)
检查干燥产物的多晶型物：XRPD(与PS03027-15-H一致)
标准：如果结果满足规格，则进行步骤37。
37.将干燥产物装入桶并过筛。
38.取样进行释放分析(release analysis)。
M.全面表征
HPLC纯度、1HNMR、TGA、DSC和XRPD光谱示于表12中。
表12：模式2的表征
实施例3-水合CHP的结晶工艺开发
该研究集中于CHP水合物(模式2)的结晶开发。在一批CHP水合物初始表征之后，进行溶解度研究、小规模结晶评价、亚稳区宽度测量和放大结晶。工作计划的目的是建立结晶条件，以便成功生产CHP水合物模式2，能够被有效地扩大生产规模。
对CHP模式1进行的溶解度评价表明，除掺混了最高百分比MtBE的乙醇：水：MtBE，在所有含水溶剂混合物中都具有高溶解度。由水(≥200mg/mL)和丙酮：水共混物(在水：丙酮[90:10]中≥200)观察到特别高的溶解度。观察到该物质在丙酮、乙腈和THF中的溶解性很差(≤10mg/mL)。
两点溶解度表明，在所评价的两种溶剂体系，乙醇：水：MtBE允许稍高的产率，但存在形成模式1的风险。丙酮：水只允许形成模式2，但以产率为代价。
在一种实施方式中，提供了下述方法来制备CHP水合物：
·将大约20g的CHP模式1加入到夹套反应容器中，预热到50℃。
·将50mL乙醇：水(90:10v/v％)溶剂混合物加入到容器中，以达到400mg/mL的起始浓度。
·使用顶置式搅拌器在每分钟300转下搅拌。
·当实现完全溶解时，向容器中加入25mL的MtBE(逐滴)。
·在MtBE添加完成后，用2重量％(400mg)研磨的结晶模式2CHP种晶进行实验(seedthe experiment)。
·在50℃下继续搅拌20分钟。
·向容器中再加入5mL的MtBE(逐滴)。
·以20mL/小时的速率加入70mL的MtBE。
·当添加完成时，以0.1℃/分钟从30℃冷却至29℃。
·在29℃下继续搅拌8小时。
·以0.25℃/分钟的速率从29℃冷却至5℃。
·以20mL/小时的速率加入190mL的MtBE。
·在5℃下继续搅拌12小时
·通过过滤分离固体，并用40mL的乙醇：水：MtBE(9体积：1体积：30体积)洗涤滤饼。
·在40℃下真空干燥固体1小时。
进行实验室规模的混合性能的估计，然后以工厂规模的几何形状建模以估计允许工艺成功转换的配置参数。将该流程转换到10kg规模可以用以下流程进行：
·将大约10kg的CHP模式1加入到夹套反应容器中，预热至50℃。
·将25L乙醇：水(90:10v/v％)溶剂混合物加入到容器中，以达到400mg/mL的起始浓度。
·在每分钟48转下搅拌。
·当实现完全溶解时，向容器中加入12.5L的MtBE。
·在MtBE添加完成后，用2重量％(200g)研磨的结晶模式2CHP种晶进行实验。
·在50℃下继续搅拌20分钟。
·向容器中再加入2.5L的MtBE(逐滴)。
·以10L/小时的速率加入35L的MtBE。
·当添加完成时，以0.1℃/分钟从30℃冷却至29℃。
·在29℃下继续搅拌8小时。
·以0.25℃/分钟的速率从29℃冷却至5℃。
·以10L/小时的速率加入95L的MtBE。
·在5℃下继续搅拌12小时
·通过过滤分离固体，并用20L乙醇：水：MtBE(9体积：1体积：30体积)洗涤滤饼。
·在40℃真空下干燥固体。
推荐使用48转每分钟，因为这允许工厂规模容器中的功率消耗与实验室规模容器的功率消耗更相符。工厂的功率耗散估计为0.067W/kg，而在实验室规模上，功率耗散估计为0.064W/kg。用于估计这些参数的模型还估计颗粒可能是悬浮的。
或者，工厂的搅拌器可以55转每分钟运转。这已经通过混合模型估计为临界离底悬浮转速(NJS)，刚刚悬浮的混合速度，其中颗粒将悬浮在容器中。这增加了信心结合是有效的，然而存在颗粒将经历高得多的0.101W/kg的功率耗散的风险。
然而，应该理解，可以省略上述获得CHP水合物的一个或多个步骤，或者可以改变步骤的顺序。
B.分析方法
1.X射线粉末衍射(XRPD)
在PALAYLIC X'PERT pro上进行XRPD分析，在2θ为3和35°之间扫描样品。将材料轻轻研磨以放开任何团聚物，并将其装载到具有Mylar聚合物膜的多孔板上以支撑样品。然后将多孔板放入衍射仪中，并使用Cu K辐射源( α1：α2比＝0.5)在采用40kV/40mA发电机设备的透射模式(步长2θ为0.0130°)下运行进行分析。
2.偏振光显微镜(PLM)
使用配备有Motic照相机和图像捕获软件(Motic Images Plus 2.0)的OlympusBX50偏振显微镜评价双折射的存在、粒度和形态。除非另有说明，所有图像都使用20x物镜记录。
3.热重分析(TGA)
将约5mg的材料称重到敞开的铝盘中，并装载到偶联的热重/差热分析仪(TG/DTA)中，并保持在室温下。然后以10℃/分钟的速率将样品从20℃加热至350℃，在此期间记录样品重量的变化以及任何差热现象(DTA)。氮气用作吹扫气体，流速为300cm3/min。
4.核磁共振(NMR)
使用配有DCH冷冻探针的Bruker AVIIIHD光谱仪在500.12MHz下(对质子)进行NMR。在氘代二甲基亚砜中进行实验，将每个样品制备浓度为约10mM。
5.聚焦光束反射测量(FBRM)
使用Mettler Toledo D600探针进行聚焦光束反射测量。对于每次结晶，在结晶开始时将探针放入反应容器中，并监测成核和晶体生长。使用以下设置始终监测弦长分布和各种计数统计数据：
电子识别测距仪
扫描速度2ms-1
取样时间10s
6.结晶仪(Crystal 16)
Crystal 16(平行结晶仪)仪器使用光通过透明小瓶中的溶液(或浆液)的透射百分比，以建立溶液(或浆液)的浊度曲线，其为时间和温度的函数。获得的曲线用于确定浊点(成核温度)和澄清点(溶解温度)。
7.高效液相色谱-紫外检测(HPLC-UV)
使用以下设备参数进行HPLC分析：
仪器：Dionex Ultimate 3000
色谱柱：LC/168X-桥苯基色谱柱(Bridge Phenyl Column)(150mm×4.6mm×3.5μm)
柱温：30℃
自动取样器温度：5℃
UV波长：220nm
注射体积：5μL
流速：1mL/min
流动相A：10mM的乙酸铵
流动相B：乙腈
稀释剂：0.1％TFA的水溶液
梯度程序：
时间(分钟)
溶剂B[％]
0.01
0
10.3
30
15
95
15.1
0
25
0
C.实验
1.CHP模式1的初始表征
按照B部分详述的程序，通过XRPD、1H-、HSCQ-和13C-NMR和HPLC表征CHP模式1。
2.CHP模式1(无水)的近似溶解度
通过溶剂添加技术估计CHP在37种选择的溶剂体系中的近似溶解度(表13)。使用以下流程：
·在37个小瓶中各称量约20mg的CHP模式1。
·将每种溶剂/溶剂混合物以5体积等分试样(100μL)加入到合适的小瓶中，直到观察到溶解或最多加入2mL溶剂。
·在添加之间，将样品加热至40℃以检查在升高的温度下的溶解。
·如果加入2mL溶剂而没有溶解该物质，则估计溶解度低于10mg/mL。
·在添加溶剂之后，将所有37个小瓶置于冰箱中使其在2-8℃之间急骤冷却约18小时。
·通过离心过滤分离存在的任何固体，并通过XRPD分析(允许材料量)。
·在没有产生固体的情况下，将小瓶开盖并在环境温度下使其蒸发。
·通过XRPD分析存在的任何固体(其中允许的材料量)。
表13:近似溶解度溶剂列表
3.两点溶解度
使用以下流程在5℃和50℃下在11种溶剂混合物中进行两点溶解度研究：
·将1mL选择的溶剂混合物加入到含有预先称重质量的CHP模式1的1.5mL螺旋盖玻璃小瓶中以制备浆液。为每种溶剂体系选择的初始质量是基于部分2中详述的所找到的近似溶解度。溶剂共混物示于表14中。
·将小瓶保持在设定为5℃或50℃的恒温控制的反应区中，并通过磁力搅拌器板提供搅拌。
·在1小时后观察到完全溶解的情况下，向实验中加入更多CHP模式1固体以形成浆液。
·当在所有小瓶中形成流动的浆料时，将实验在所需的温度下搅拌约18小时。所需CHP模式2的最终质量示于表14中。
·在约18小时后，停止搅拌，并使用0.45μm PVDF针滤器和注射器过滤上清液。
·通过HPLC分析上清液的浓度。
·将小瓶中剩余的浆液各自转移至0.22μm尼龙过滤离心管中，并通过离心分离固体。
·通过XRPD和HPLC分析恢复固体(允许的量)的纯度。
表14：两点溶解度的最终CHP质量
4.小规模结晶
对得到的CHP(模式1)进行小规模结晶试验。这些试验的目的是研究最合适的溶剂体系、温度和浓度以用于进一步的结晶研究。这使用两种不同的溶剂体系进行：丙酮：水和乙醇：水：MtBE。
结晶组A：丙酮：水
·将约500mg得到的CHP(模式1)称重到4×20mL闪烁瓶中。
·向每个小瓶中加入适当体积的丙酮：水(80:20v/v％)以溶解样品。所用溶剂体积见表15。
·将搅拌棒加入到每个小瓶中，并且在50℃下搅拌实验。
·在50℃下1小时后，将丙酮逐滴添加到四个小瓶中的2个(小瓶1和3)中。
·将实验在50℃下搅拌约1小时。
·1小时后，以0.25℃/分钟的速率将小瓶冷却至5℃。
·一旦达到5℃，将丙酮逐滴加入剩余的2个小瓶(小瓶2和4)。
·将实验在5℃下搅拌约18小时。
·在5℃下18小时后，然后使用47mm布氏漏斗和Whatman Grade1滤纸(直径＝42.5mm，孔径＝11μm)过滤所得浆液。
·将固体转移到预先称重的小瓶中，并通过XRPD、PLM和HPLC分析化学纯度。
·过滤后的母液进行HPLC浓度分析。
·实验总结于表15中。
结晶组B：乙醇：水：MtBE
·将约500mg得到的CHP(模式1)称重到5×20mL闪烁瓶中。
·向每个小瓶中加入2mL乙醇：水(90:10v/v％)以溶解样品。
·向每个小瓶中加入搅拌棒，并在50℃下搅拌实验。
·在50℃下1小时后，将MtBE逐滴添加至五个小瓶中的3个(小瓶1、3和5)中。
·将实验在50℃下搅拌约1小时。
·在50℃下1小时后，使用47mm布氏漏斗和Whatman Grade1滤纸(直径＝42.5mm；孔径＝11μm)过滤小瓶1中存在的浆液。
·如先前结果在50℃过滤的实验表明，在该百分比的MtBE(80％)，存在冷却后形成模式1的潜在风险。
·以0.25℃/分钟的速率将剩余的小瓶冷却至5℃。
·一旦达到5℃，就将MtBE逐滴添加至剩余的2个小瓶(小瓶2和4)中。
·将实验在5℃下搅拌约18小时。
·在5℃下18小时后，然后使用47mm布氏漏斗和Whatman Grade1滤纸(直径＝42.5mm，孔径＝11μm)过滤所得浆液。
·将所有固体转移到预称重的小瓶中，并通过XRPD、PLM和HPLC分析化学纯度。
·过滤后的母液进行HPLC浓度分析。
·实验总结于表15中。
表15小规模结晶溶剂总结
5.亚稳区宽度(MSZW)测量
通过研究两个参数-冷却和反溶剂加入，对得到的CHP(模式1)进行MSZW测量。
冷却方法
使用Crystal 16(平行结晶仪)通过冷却完成MSZW的测定。所用的方法概述如下：
·将已知量的CHP(模式1)称量到螺帽小瓶中。
·向每个小瓶中加入1mL适当的溶剂体系以形成浆液。将搅拌棒置于每个小瓶中。
·表16中总结了各实验中所用的溶剂体系和CHP的质量，将小瓶置于Crystal 16仪器的样品架中，并开始所需的温度程序。温度分布可见表17A。
·自始至终监测系统的浊度，并允许测定澄清点和浊点。
表16冷却测定MSZW的实验细节
表17:冷却测定MSZW的温度分布
a.反溶剂添加方法
使用乙醇：水：MtBE完成相对于反溶剂添加的MSZW的测定。使用以下流程：
·将大约20g得到的CHP模式1转移到250mL的夹套容器中，该容器已经预热到50℃。
·将50mL乙醇：水(90:10v/v％)溶剂混合物加入到容器中，以达到400mg/mL的起始浓度。
·使用顶置式搅拌器在50℃、约300rpm下搅拌实验。
·将FBRM探针插入容器中以监测和记录成核和颗粒计数。
·当达到完全溶解(约40分钟)时，通过蠕动泵以10mL/小时的速率加入75mL的MtBE。
·在MtBE添加完成时，将实验以0.25℃/分钟冷却至5℃且在5℃下保持过夜。
·在5℃下9小时后，使用83mm布氏漏斗和Whatman1级滤纸(直径＝70mm；孔径＝11μm)通过真空过滤分离固体。
·取滤饼样品并通过XRPD分析。
·将剩余的滤饼在35℃真空干燥1小时。
·过滤后的母液的浓度通过HPLC测定。
6.结晶开发
结晶放大实验在乙醇：水：MtBE中进行。评价各种实验条件，例如冷却速率、反溶剂添加速率和温度、引晶负荷和温度、和反溶剂比率。考虑以下方案：
a.结晶1
对于结晶1，用2重量％晶种对溶液进行种晶。在35℃下进行种晶和MtBE添加，将浆液以0.25℃/分钟的速率冷却至5℃。使用以下流程：
·将大约20g得到的CHP模式1转移到夹套容器中，该容器已经预热到50℃。
·将50mL乙醇：水(90:10v/v％)溶剂混合物加入到容器中，以达到400mg/mL的起始浓度。
·使用顶置式搅拌器在50℃、约300rpm下搅拌实验。
·将FBRM探针插入容器中以监测和记录成核和颗粒计数。
·当达到完全溶解(约30分钟)时，将实验以0.25℃/分钟的速率冷却至35℃，并通过蠕动泵以10mL/小时的速率加入10mL的MtBE。
·在MtBE添加完成时，用400mg CHP模式2种晶实验；在35℃下监测系统约2小时。
·然后以0.25℃/分钟将实验冷却至5℃，并通过蠕动泵以10mL/小时(14小时)的速率加入140mL的MtBE，得到25:75v/v％的最终溶剂比。
·使用83mm布氏漏斗和Whatman Grade 1滤纸(直径＝70mm；孔径＝11μm)通过真空过滤分离固体。
·用40mL乙醇：水：MtBE(9体积：1体积：30体积)洗涤滤饼，然后在40℃下真空干燥1小时。
·通过XRPD、TG/DTA、PLM和HPLC分析干燥的固体；
·过滤后的母液的浓度通过HPLC测定。
b.结晶2
对于结晶2，用2重量％晶种对溶液进行种晶。在50℃下进行种晶和MtBE添加，将浆液以0.25℃/分钟的速率冷却至5℃。使用以下流程：
·称量约20g得到的CHP模式1，并转移到已预热至50℃的夹套容器中。
·将50mL乙醇：水(90:10v/v％)溶剂混合物加入到容器中，以达到400mg/mL的起始浓度。
·使用顶置式搅拌器在50℃、约300 rpm下搅拌实验。
·将FBRM探针插入容器中以监测和记录成核和颗粒计数。
·当达到完全溶解(约20分钟)时，将实验保持在50℃，并通过注射泵以10mL/小时的速率加入10mL的MtBE；
·在MtBE添加完成时，用400mg CHP模式2种晶实验；在50℃下监测系统约2小时。
·通过蠕动泵以20mL/小时的速率加入140mL的MtBE，得到25:75v/v％的最终溶剂比。
·然后以0.25℃/分钟将实验冷却至5℃并在5℃保持约9小时；
·在5℃下9小时后，使用88mm布氏漏斗和Whatman Grade 1滤纸(直径＝70mm；孔径＝11μm)通过真空过滤分离固体。
·用40mL乙醇：水：MtBE(9体积：1体积：30体积)洗涤滤饼，然后在40℃下真空干燥1小时。
·通过XRPD、TG/DTA、PLM和HPLC分析干燥的固体的纯度；
·过滤后的母液的浓度通过HPLC测定。
c.结晶3
对于结晶3，用2重量％晶种对溶液进行种晶。在35℃下进行种晶和MtBE添加，将浆液以0.25℃/分钟的速率冷却至5℃。使用以下流程：
·称量约20g得到的CHP模式1，并转移到已预热至50℃的夹套容器中。
·将50mL乙醇：水(90:10v/v％)溶剂混合物加入到容器中，以达到400mg/mL的起始浓度。
·使用顶置式搅拌器在50℃、约300rpm下搅拌实验。
·将FBRM探针插入容器中以监测和记录成核和颗粒计数。
·当实现完全溶解(约20分钟)时，以0.25℃/分钟℃的速率将实验冷却至5℃；
·一旦体系达到23℃，就观察到成核；
·将体系加热至50℃以再溶解该物质。一旦观察到溶解，将系统以0.25℃/分钟℃的速率冷却至25℃
·一旦体系达到25℃，就观察到成核；
·将体系加热至50℃以再溶解该物质。一旦观察到溶解，将系统冷却至35℃，并用400mg CHP模式2种晶实验；
·通过蠕动泵以20mL/小时的速率加入140mL的MtBE，得到26:74v/v％的最终溶剂比；
·然后以0.25℃/分钟将实验冷却至5℃，并在5℃保持约9小时；
·使用88mm布氏漏斗和Whatman Grade 1滤纸(直径＝70mm；孔径＝11μm)通过真空过滤分离固体。
·用40mL乙醇：水：MtBE(9体积：1体积：30体积)洗涤滤饼，然后在40℃下真空干燥1小时。
·通过XRPD、TG/DTA、PLM和HPLC分析干燥固体的纯度。
·过滤后的母液的浓度通过HPLC测定。
d.结晶4
对于结晶4，用2重量％晶种对溶液进行种晶。在50℃下进行种晶和MtBE添加，将浆液以0.1℃/分钟的速率冷却至5℃。使用以下流程：
·称量约20g CHP模式2(从结晶1和3回收的材料)，并转移到已经预热到50℃的夹套容器中。
·将50mL乙醇：水(90:10v/v％)溶剂混合物加入到容器中，以达到400mg/mL的起始浓度。
·使用顶置式搅拌器在50℃、约300rpm下搅拌实验。
·将FBRM探针插入容器中以监测和记录成核和颗粒计数。
·当达到完全溶解(约20分钟)时，将实验保持在50℃，并通过注射泵以20mL/小时的速率加入20mL MtBE；
·在MtBE添加完成时，用400mg CHP模式2种晶实验；
·在50℃下监测系统约2小时；
·通过蠕动泵以20mL/小时的速率加入140mL的MtBE，得到24:76v/v％的最终溶剂比。
·然后以0.1℃/分钟将实验冷却至5℃；
·将系统在5℃保持过夜；
·在5℃下8小时后，使用88mm布氏漏斗和Whatman Grade 1滤纸(直径＝70mm；孔径＝11μm)通过真空过滤分离固体。
·用40mL乙醇：水：MtBE(9体积：1体积：30体积)洗涤滤饼，然后在40℃下真空干燥1小时。
·通过XRPD、TG/DTA、PLM和HPLC分析干燥固体的纯度；
·过滤后的母液的浓度通过HPLC测定。
e结晶5
对于结晶5，用2重量％的研磨晶种对溶液进行种晶。在50℃下进行种晶和MtBE添加，以0.1℃/分钟的速率将浆液冷却至5℃。使用以下程序：
·称量大约20g CHP模式1和2共混物(模式1来自得到的CS/352/18，模式2来自结晶4)，并转移到已经预热到50℃的夹套容器中。
·将50mL乙醇：水(90:10v/v％)溶剂混合物加入到容器中，以达到400mg/mL的起始浓度。
·使用顶置式搅拌器在50℃、约300 rpm下搅拌实验。
·将FBRM探针插入容器中以监测和记录成核和颗粒计数。
·当达到完全溶解(约20分钟)时，将实验保持在50℃并使用注射器滴加25mL的MtBE；
·在MtBE加入完成后，用400mg已经使用研杵和研钵研磨的CHP模式2种晶实验中。
·在50℃下，监测系统约75分钟；
·通过蠕动泵以20mL/小时的速率加入140mL的MtBE，得到23:77v/v％的最终溶剂比。
·然后以0.1℃/分钟将实验冷却至5℃；
·将系统在5℃保持过夜；
·在5℃下9小时后，使用88mm布氏漏斗和Whatman Grade 1滤纸(直径＝70mm；孔径＝11μm)通过真空过滤分离固体。
·用40mL乙醇：水：MtBE(9体积：1体积：30体积)洗涤滤饼，然后在40℃下真空干燥1小时。
·通过XRPD、TG/DTA、PLM和HPLC分析干燥固体的纯度；
·过滤后的母液的浓度通过HPLC测定。
f.结晶6
对于结晶6，用2重量％的研磨晶种对溶液进行种晶。种晶在50℃下进行，并使用分阶段加入MtBE。以0.1℃/分钟的速率将浆液冷却至29℃并在该温度下保持8小时。然后以0.25℃/分钟的速率将浆液冷却至5℃。使用以下流程：
·称量大约20g CHP模式1和2型共混物(模式1来自得到的CS/352/18，模式2来自结晶5)，并转移到已经预热到50℃的夹套容器中。
·将50mL乙醇：水(90:10v/v％)溶剂混合物加入到容器中，以达到400mg/mL的起始浓度。
·使用顶置式搅拌器在50℃、约300rpm下搅拌实验。
·将FBRM探针插入容器中以监测和记录成核和颗粒计数。
·当达到完全溶解(约20分钟)时，将实验保持在50℃并使用注射器滴加25mL的MtBE；
·在MtBE加入完成后，将400mg已经使用研杵和研钵研磨的CHP模式2种晶进行实验；
·在50℃下监测系统的约10分钟；
·晶种没有持续存在。使用注射器向容器中滴加另外的5mL的MtBE。
·通过蠕动泵以20mL/小时的速率加入70mL的MtBE；
·然后以0.1℃/分钟将实验冷却至29℃；
·将系统在29℃保持8小时。
·在29℃下8小时后，将系统以0.25℃/分钟的速率冷却至5℃。
·一旦体系达到5℃，开始第二步MtBE添加。以20mL/小时的速度加入190mL。最终溶剂比为15:85v/v％。
·将系统在5℃保持约12小时。
·然后使用88mm布氏漏斗和Whatman Grade1滤纸(直径＝70mm；孔径＝11μm)通过真空过滤分离固体。
·用40mL乙醇：水：MtBE(9体积：1体积：30体积)洗涤滤饼，然后在40℃下真空干燥1小时。
·通过XRPD、TG/DTA、PLM和HPLC分析干燥固体的纯度和手性HPLC。
·过滤后的母液的浓度通过HPLC测定。
g.结晶7
对于结晶7，用2重量％的研磨晶种对溶液进行种晶。种晶在50℃进行，并使用分阶段加入MtBE。以0.1℃/分钟的速率将浆液冷却至5℃。使用以下流程：
·称量大约20g CHP模式1和2共混物(模式1来自得到的CS/352/18，模式2来自结晶6)，并转移到已经预热到50℃的夹套容器中。
·将50mL乙醇：水(90:10v/v％)溶剂混合物加入到容器中，以达到400mg/mL的起始浓度。
·使用顶置式搅拌器在50℃、约300rpm下搅拌实验。
·将FBRM探针插入容器中以监测和记录成核和颗粒计数。
·当达到完全溶解(约20分钟)时，将实验保持在50℃并使用注射器手动(逐滴)加入27.5mL的MtBE；
·在MtBE加入完成后，将400mg使用研杵和研钵研磨的CHP模式2进行种晶实验；
·在50℃下监测系统约10分钟；
·通过蠕动泵以20mL/小时的速率加入70mL的MtBE；
·然后以0.1℃/分钟将实验冷却至5℃；
·将系统在5℃保持过夜。
·在5℃下约9小时后，开始第二步MtBE添加。以20mL/小时的速度加入190mL。最终溶剂比为15:85v/v％。
·使用88mm布氏漏斗和Whatman Grade1滤纸(直径＝70 mm；孔径＝11μm)通过真空过滤分离固体。
·用40mL乙醇：水：MtBE(9体积：1体积：30体积)洗涤滤饼，然后在40℃下真空干燥1小时。
·通过XRPD、TG/DTA、PLM和HPLC分析干燥固体的纯度；
·过滤后的母液的浓度通过HPLC测定。
h.结晶8
对于结晶8，用5重量％的研磨晶种对溶液进行种晶。种晶在50℃进行，并使用分阶段加入MtBE。以0.1℃/分钟的速率将浆液冷却至5℃。使用以下流程：
·称量大约20g CHP模式1和2型共混物(模式1来自得到的CS/352/18，模式2来自结晶7)，并转移到已经预热到50℃的夹套容器中。
·将50mL乙醇：水(90:10v/v％)溶剂混合物加入到容器中，以达到400mg/mL的起始浓度。
·使用顶置式搅拌器在50℃、约300rpm下搅拌实验。
·将FBRM探针插入容器中以监测和记录成核和颗粒计数。
·当达到完全溶解(约20分钟)时，将实验保持在50℃并使用注射器手动(逐滴)加入27.5mL的MtBE；
·在MtBE加入完成时，将1g使用研杵和研钵研磨的CHP模式2进行种晶实验；
·在50℃下监测系统约10分钟；
·通过蠕动泵以20mL/小时的速率加入70mL的MtBE；
·然后以0.1℃/分钟将实验冷却至5℃；
·将系统在5℃保持过夜。
·在5℃下约9小时后，开始第二步MtBE添加。以20mL/小时的速度加入190mL。最终溶剂比为15:85v/v％。
·使用88mm布氏漏斗和Whatman Grade1滤纸(直径＝70mm；孔径＝11μm)通过真空过滤分离固体。
·用40mL乙醇：水：MtBE(9体积：1体积：30体积)洗涤滤饼，然后在40℃下真空干燥1小时。
·通过XRPD、TG/DTA、PLM和HPLC分析干燥固体的纯度；
·过滤后的母液的浓度通过HPLC测定。
i.结晶9
对于结晶9，用5重量％的研磨晶种对溶液进行引晶。种晶在50℃进行，并使用分阶段加入MtBE。以0.1℃/分钟的速率将浆液冷却至30℃，并在该温度下保持8小时。然后以0.1℃/分钟的速率将浆液冷却至5℃。使用以下流程：
·称量大约20g CHP模式1和2共混物(模式1来自得到的CS/352/18，模式2来自结晶8)，并转移到已经预热到50℃的夹套容器中。
·将50mL乙醇：水(90:10v/v％)溶剂混合物加入到容器中，以达到400mg/mL的起始浓度。
·使用顶置式搅拌器在50℃、约300rpm下搅拌实验。
·将FBRM探针插入容器中以监测和记录成核和颗粒计数。
·当达到完全溶解(约20分钟)时，将实验保持在50℃并使用注射器手动(逐滴)加入27.5mLMtBE；
·在MtBE加入完成时，将1g使用研杵和研钵研磨的CHP模式2进行种晶实验；
·在50℃下监测系统约10分钟；
·通过蠕动泵以15mL/小时的速率加入70mL的MtBE；
·然后以0.1℃/分钟将实验冷却至30℃；
·将系统在30℃保持8小时。
·在30℃下8小时后，系统以0.1℃/分钟的速率重新冷却至5℃。
·第二步开始加入MtBE。以20mL/小时的速度加入190mL。最终溶剂比为15:85v/v％。
·将系统在5℃保持过夜。
·在5℃下约10小时之后，使用布氏漏斗和Whatman Grade1滤纸(直径＝70mm；孔径＝11μm)通过真空过滤分离固体。
·用40mL乙醇：水：MtBE(9体积：1体积：30体积)洗涤滤饼，然后在40℃下真空干燥1小时。
·通过XRPD、TG/DTA、PLM和HPLC分析干燥固体的纯度；
·过滤后的母液的浓度通过HPLC测定。
j.结晶10
结晶10采用与结晶6相同的程序，由于容器尺寸，参数按比例缩小到原始实验的70％。在该实验中也使用新批次的得到的CHP(模式1)(CS/802/18)。用2重量％的研磨晶种对溶液进行种晶。种晶在50℃进行，并使用分阶段加入MtBE。以0.1℃/分钟的速率将浆液冷却至29℃并在该温度下保持8小时。然后以0.25℃/分钟的速率将浆液冷却至5℃。使用以下流程：
·称量约14g得到的CHP模型1，并转移到已预热至50℃的夹套容器中。
·将35mL乙醇：水(90:10v/v％)溶剂混合物加入到容器中，以达到400mg/mL的起始浓度。
·使用顶置式搅拌器在50℃、约300rpm下搅拌实验。
·将FBRM探针插入容器中以监测和记录成核和颗粒计数。
·当达到完全溶解(约20分钟)时，将实验保持在50℃并使用注射器滴加17.5mL的MtBE；
·在MtBE加入完成后，将280mg使用研杵和研钵研磨的CHP模式2进行种晶实验；
·在50℃下监测系统约10分钟；
·晶种没有持续存在。使用注射器向容器中滴加另外的3.5mL的MtBE。
·通过蠕动泵以20mL/小时的速率加入50mL的MtBE；
·然后以0.1℃/分钟将实验冷却至29℃；
·将系统在29℃保持8小时。
·在29℃下8小时后，将系统以0.25℃/分钟的速率冷却至5℃。
·一旦体系达到5℃，开始第二步MtBE添加。以20mL/小时的速度加入134 mL。最终溶剂比为15:85v/v％。
·将系统在5℃保持约12小时。
·然后使用88mm布氏漏斗和Whatman Grade1滤纸(直径＝70mm；孔径＝11μm)通过真空过滤分离固体。
·用28mL乙醇：水：MtBE(9体积：1体积：30体积)洗涤滤饼，然后在40℃下真空干燥1小时。
·通过XRPD、TG/DTA、PLM、手性HPLC和HPLC分析干燥固体的纯度。
·过滤后的母液的浓度通过HPLC测定。
实施例4-纯度测定
使用HPLC测定CHP和CHP-水合物的纯度。用于CHP和CHP-水合物的纯度测量的HPLC方法的色谱参数总结在表17B中。
表17B：用于CHP和CHP-水合物纯度测量的HPLC方法的色谱参数
制备用于分析测定的标准溶液(0.8mg/mL无水CHP或0.85mg/mL CHP水合物)：称量约40mg C16081735-D参考标准物并转移到50mL容量瓶中。用稀释剂稀释至一定体积并充分混合(如果需要，超声以溶解)。将其标记为STD-1，制备用作标准检验的第二标准溶液。将其标记为STD-2。
制备用于测定的样品溶液(0.85mg/mL CHP水合物)：在50mL容量瓶中称量约42.5mg CHP水合物样品。用稀释剂稀释至一定体积并充分混合。
代表性空白色谱图和代表性分辨率溶液色谱图分别示于图52和53中。
实施例5-CHP水合物的稳定性比较
A.CHP无水物和CHP水合物模式2之间的化学稳定性比较
在GMP条件下制备CHP无水物(模式1)和水合物(模式2)化合物。在加速条件(40±5℃/75±5％RH)下进行六个月并在室温条件(25±5℃/60±5％RH)下进行12个月的CHP无水物化合物的稳定性研究。进一步研究了在加速条件(40±5℃/75±5％RH)下进行6个月的CHP水合物化合物稳定性(表18)。
表18.CHP无水物和模式2水合物的稳定性研究
1T＝经过测试
2NS＝没有安排
3S＝已经安排的
CHP无水物的长期储存条件需要小心处理，因为CHP是吸湿的。在稳定性研究期间，CHP无水物吸收了水分，由于CHP的降解，观察到新杂质的增加和CHP无水物的减少(表19)。CHP水合物模式2的稳定性数据示于表20中。
表19.在CHP无水物(模式1)中在加速条件下生长的杂质
表20.在CHP水合物(模式2)中在加速条件下生长的杂质
CHP无水物吸收水分，直到CHP中的水分含量达到7％。因此，CHP无水物具有吸收水分的倾向。也观察到CHP无水物的降解。相反，在加速条件下持续6个月的稳定性研究期间，稳定的模式2水合物形式没有显著的质量变化。
CHP无水物和CHP水合物(模式2)之间的总杂质的比较示于图54中。
实施例6-CHP水合物上的多晶型物筛选
对CHP进行多态性研究，目的是确定具有改善的固态性质的任何新的多晶型物。在该研究中，CHP模式2被确定为用于开发的稳定形式，其为化学计量的一水合物。该研究需要对得到的无水CHP(模式1，批次：1058707)进行初始分析，在30个溶剂系统中进行溶剂溶解度筛选，并使用24个溶剂系统和四个工艺相关条件(循环、冷却、反溶剂添加和蒸发)进行初级多晶型筛选。随后进行CHP模式2的第二次筛选放大，包括1周的稳定性评价和pH溶解度评价。
XRPD发现所得材料是结晶的，并且由没有确定形态的双折射颗粒组成。在热方面，发现在170℃下观察到样品熔融之前，在加热开始时，模式1显示出三个小的质量损失，DVS分析表明发生了形态变化，并表明DVS后所生产的材料是进料的水合形式。固体后DVS的TG/DTA支持这一点，其中TG/DTA热分析图与在第二多晶型物筛选期间分析的模式2材料的热数据匹配。
在乙醇和甲醇中观察到高溶解度，估计其近似溶解度为100≥x≥50mg/mL。使用从溶解度筛选收集的信息，主要使用由得到的CHP(模式1)制备的无定形投入材料进行初级多晶型物筛选。在初步筛选中除了模式1和2之外，还观察到一种新的多晶型物，纯的模式1。
基于来自初级多晶型物筛选的结果，放大模式2用于进一步分析。在热方面，发现在约120℃发生重结晶之前，从TG/DTA实验开始，模式2材料损失0.9当量的水。随后在170℃下熔融。发现熔融温度与模式1的温度相同，这表明样品在加热时脱水并重结晶为模式1。尽管在DSC迹线中重结晶现象是不可见的，但通过Hottage PLM显微镜观察，模式2至模式1重结晶的证据是明显的。对模式2CHP的短期1周稳定性研究表明在所评估的条件下具有良好的化学稳定性，但是XRPD分析表明，在密闭小瓶中于80℃下储存7天后，模式2投入材料转化为模式1。在环境温度和40℃/75％RH下储存的样品保持为模式2。
对模式2CHP的长期8周稳定性研究表明，在40℃/75％RH下具有良好的物理稳定性。XRPD分析确认模式2在8周评估的整个持续时间内占优势。
在模式2的VT/VH-XRPD表征期间最初观察到纯模式1，在80℃/0％RH下产生的衍射图显示了与模式1材料相似的峰分布图，具有一些缺失的峰，最明显的是在2θ为17°。与初始模式2衍射图的进一步比较显示，在模式2衍射图中存在缺失的峰。这表明得到的材料(指定为模式1)是纯模式1和模式2的混合物。纯模式1的放大通过加热到50℃或80℃不是成功的，但可通过在乙醇/二氯甲烷中快速蒸发实现，因为乙醇/DCM混合物除了共沸水之外还溶解了该物质，从而促进了无水模式1的形成。
对纯模式1CHP的八(8)周稳定性研究表明在40℃/75％RH下物理稳定性差。XRPD分析确认，纯模式1在14天后转变到模式2。
在稳定性评估的整个持续时间内，模式1和模式2材料都保持手性纯。尽管对原始样品继续研究，但是从2周时间点起进行稳定性测试的材料是模式2而不是模式1，这是由于纯模式1在该温度和湿度下的差的稳定性。
纯模式1CHP的短期1天稳定性测试显示，在40℃/75％RH下2小时后，材料转变为模式2。
基于本中描述的观察结果，强调模式2作为最稳定的形式，推荐结晶开发工作流程，以提供可靠的、可扩展的流程来制备模式2材料。
A.材料
分析以下材料。
批次(Batch)/分组(Lot)/样品ID：环(-His-Pro)批料：1058707
SFS ID：CS/298/18/1和CS/298/18/2
收到量(Amount Received)：10g
外观：灰白色固体
B.分析方法
1.X射线粉末衍射(XRPD)
在PALAYLIC X'PERT pro上进行XRPD分析，在2θ为3和35°之间扫描样品。将材料轻轻研磨以放开任何团聚物，并将其装载到具有Kapton或Mylar聚合物膜的多孔板上以支撑样品。然后将多孔板放入衍射仪中，并使用Cu K辐射源(α1：α2比＝0.5)在采用40kV/40mA发电机设备的透射模式(步长2θ为0.0130°)下运行进行分析。
2.偏振光显微镜(PLM)
使用配备有Motic照相机和图像捕获软件(Motic Image Plus 2.0)的OlympusBX50偏光显微镜测定结晶度(双折射)的存在。除非另有说明，所有图像都使用20x物镜记录。
3.热载物台光学显微镜
使用校准的Linkam THM600热台，用与Olympus BX50偏光显微镜耦合的连接控制器单元，视觉监测热现象，所述偏光显微镜配备有Motic照相机和图像捕获软件(MoticImage Plus 2.0)。将大约0.5mg材料置于显微镜盖玻片上并以10℃/分钟的速率加热，以常规间隔拍摄图像以记录任何热转变。除非另有说明，所有图像都使用10x物镜记录。
4.热重分析(TGA)
将约5mg材料称重到敞开的铝盘中，并装载到偶联的热重/差热分析仪(TG/DTA)中，并保持在室温下。然后以10℃/分钟的速率将样品从20℃加热至300℃，在此期间记录样品重量的变化以及任何差热现象(DTA)。氮气用作吹扫气体，流速为300cm3/min。
5.差示扫描量热法(DSC)
将约5mg材料称入铝制DSC盘中，用穿孔铝盖非气密密封。然后将样品盘装入冷却Seiko DSC6200(配有冷却器)并保持在20℃。一旦获得稳定的热流响应，将样品和参比样品以10℃/min的扫描速率加热至250℃并监测所得热流响应。氮气用作吹扫气体，流速为50cm3/min。
6.红外光谱仪(IR)
红外光谱在Bruker ALPHA P光谱仪上进行。将足够的材料放置在光谱仪的板的中心上，并且使用以下参数获得光谱：
分辨率：4cm-1
背景扫描时间：16扫描样品
扫描时间：16扫描
数据收集：4000-400cm-1
结果光谱：透光率
软件：OPUS 6版
7.核磁共振(NMR)
使用配有DCH冷冻探针的Bruker AVIIIHD光谱仪在500.12MHz下(对质子)进行NMR。在氘代DMSO中进行实验，将每个样品制备成浓度约为10mM。
8.动态蒸汽吸附(DVS)
将约10-20mg样品放入网状蒸气吸附天平底盘中，并通过表面测量系统装入DVS固有动态蒸气吸附天平。使样品经历按10％的增量从相对湿度(RH)为40％至90％增加配置(ramping profile)湿度，在每个步骤保持样品直到在25℃获得稳定重量(dm/dt 0.004％，最小步长30分钟，最大步长500分钟)。在完成吸附循环后，使用相同程序将样品干燥至0％RH，然后二次吸附循环回到40％RH。进行两个循环。绘制吸附/解吸循环期间的重量变化，考虑测定样品的吸湿性。然后对任何保留的固体进行XRPD分析。
9.变温式动态蒸汽吸附(VT-DVS)
将大约10-20mg样品放入网状蒸气吸附天平底盘中，并通过表面测量系统装入DVS优势动态蒸气吸附天平。使样品经历按10％的增量从相对湿度(RH)为40％至90％增加配置(ramping profile)湿度，在每个步骤保持样品直到在40℃稳定重量(dm/dt 0.004％，最小步长30分钟，最大步长500分钟)。在吸附循环完成后使用相同程序将样品干燥至0％RH，然后二吸附循环回到40％RH。绘制吸附/解吸循环期间的重量变化，考虑测定样品的吸湿性。在50℃重复实验，最后在60℃对任何残留的固体进行XRPD分析。
10.可变温度和湿度X射线粉末衍射(VT-/VH-XRPD)
在装有温度和湿度箱的Philips X’Pert Pro Multipurpose衍射仪上进行VT-/VH-XRPD分析。使用Cu K辐射源( α1：α2比＝0.5)在采用40kV/40mA发电机设备的Bragg-Brentano几何(步长2θ为0.008°)下在2θ为4至35.99°之间扫描样品。对湿度分布的每个步骤进行以下测量：
程序：40％RH/环境温度-初始扫描
0％RH/环境温度-初始扫描，1小时保持，扫描
0％RH/80℃-初始扫描，20分钟保持，扫描
0％RH/80℃-初始扫描，80分钟保持，扫描
11.高效液相色谱-紫外检测(HPLC-UV)
仪器：Dionex Ultimate 3000
色谱柱：LC/168X-X-Bridge Phenyl色谱柱(150mm×4.6mm×3.5μm)
柱温：30℃
自动取样器温度：5℃
UV波长：220nm
注射量：5μL
流速：1mL/min
流动相A：10mM乙酸铵
流动相B：乙腈
稀释剂：0.1％TFA的水溶液
梯度程序：
时间(分钟)
溶剂B[％]
0.01
0
10.3
30
15
95
15.1
0
25
0
12.液相色谱-质谱(LC-MS)
仪器：Dionex Ultimate 3000
色谱柱：ACE Excel 3Super C18，75×4.6mm
柱温：30℃
注射量：10μL
流速：1.0mL/min
流动相A：0.1％甲酸的去离子水溶液
流动相B：0.1％甲酸的乙腈溶液
稀释剂：乙腈
洗针：乙腈，小瓶位置#100
PDA范围：190-400nm
梯度程序：
时间(分钟)
溶剂B[％]
0.00
5
12.00
95
15.00
95
15.10
5
20.00
5
13.手性HPLC
柱：Daicel IC(5.0um，250*4.6mm)
柱温：30℃
注射体积：5μL
流速：1.0mL/min
流动相A：0.01％DEA的正己烷溶液
流动相B：EtOH：MeOH＝2:8(v/v)
稀释剂：乙腈
PDA范围：220nm
梯度程序：
时间(min)
A％
B％
0.01
70
30
28.0
70
30
C.实验
1.初始表征
在收到所提供的环(His-Pro)后，本文称为CHP，使用XRPD、PLM、TG/DTA、DSC、DVS(具有XRPD后分析)、1H和HSQC NMR、HPLC(用于纯度和UV光谱)、pKa和LC-MS，采用B部分中概述的技术和方法进行初始表征。
2.溶剂溶解度筛选的样品制备
水中冻干
通过冷冻干燥制备用于溶剂溶解度筛选的材料，如下：
·向得到的CHP(模式1)(330mg)中加入3.3mL蒸馏水，得到澄清无色溶液；
·将该溶液在33.2mL玻璃小瓶(每个小瓶中含有约100μL和10mg固体)之间均分；
·将小瓶在-50℃冷冻以准备冷冻干燥；
·一旦冷冻，将样品置于与冷冻干燥器相连的干燥器中，干燥约18小时。此后，取样并通过XRPD分析以确认批料的无定形性质。
在水中重复冷冻干燥
如下进行重复冷冻干燥：
·将每份10mg样品(按5.2.1节制备)重新溶解在200μL蒸馏水中。
·将小瓶在-50℃冷冻以准备冷冻干燥；
·一旦冷冻，将样品置于与冷冻干燥器相连的干燥器中，干燥约72小时。此后，取样并通过XRPD分析以确认批料的无定形性质。
3.溶剂溶解度筛选
向已知质量的CHP冻干物(lyophile)(10mg，来自5.2.2节)中加入100μL的适当溶剂，并且如果固体剩余，将小瓶温和地加热至～40℃以帮助溶解。继续添加溶剂，直到该物质完全溶解或已加足2mL(＜5mg/mL)。将样品打开盖子并使其在环境温度下蒸发。在溶解度筛选中使用的溶剂可以在表21中找到。
4.初级多晶型物筛选的样品制备
a.在水中冷冻干燥
通过冷冻干燥制备用于初级多晶型物筛选的材料，如下：
·向得到的CHP(1.04)中加入13mL蒸馏水，得到澄清无色溶液；
·将该溶液在26个2mL玻璃小瓶(每个小瓶中含有约500μL和40mg固体)之间均分；
·将小瓶在-50℃冷冻以准备冷冻干燥；
·一旦冷冻，将样品置于与冷冻干燥器相连的干燥器中，干燥约48小时。此后，取样并通过XRPD分析以确认批料的无定形性质。
b.在水中重复冷冻干燥
第二次冻干尝试如下进行：
·向每40mg样品(根据部分a制备)中加入1.5mL蒸馏水以重新溶解该物质；
·将小瓶在-50℃冷冻以准备冷冻干燥；
·一旦冷冻，将样品置于与冷冻干燥器相连的干燥器中，干燥约72小时。此后，取样并通过XRPD分析以确认批料的无定形性质。
表21溶剂溶解度筛选溶剂列表
C.水中重复冷冻干燥(2)
第三次冻干尝试如下进行：
·向每40mg样品(根据部分b制备)中加入1mL蒸馏水以重新溶解该物质；
·然后将溶液吸移到26个20mL玻璃小瓶中，并用另外的15mL蒸馏水加满；
·将小瓶在-50℃冷冻以准备冷冻干燥；
·一旦冷冻，将样品置于与冷冻干燥器相连的干燥器中，干燥约120小时。此后，取样并通过XRPD分析以确认批料的无定形性质。
5.初级多晶型物筛选
CHP的初级多晶型物筛选如下进行：
·24个来自部分b的装有约40mg的CHP的小瓶用于该实验中；
·将材料悬浮于适当的溶剂/溶剂混合物中和在环境温度和40℃之间循环的温度下，每4小时循环进行72小时。所用溶剂可见表22；
·通过离心过滤分离所得固体，并通过XRPD分析。通过TG/DTA分析任何新形式；
·然后将过滤的饱和溶液分成三个小瓶，用于如下的随后多晶型物筛选实验：
a.蒸发
将CHP的饱和溶液转移到2mL小瓶中；然后将这些小瓶开盖并使其在环境温度下蒸发以回收材料。所有回收的物质通过XRPD表征。
b.急冷
将饱和CHP溶液在2-8℃储存96小时。此时，通过XRPD分析回收的任何材料，并移动小瓶并在-20℃下储存72小时。此后，通过XRPD分析任何回收的物质。
c.在环境条件下加入反溶剂
将高达2mL的反溶剂(庚烷或MtBE)滴加到CHP的饱和溶液中。将样品在环境温度下加盖72小时。通过XRPD分析任何所得固体。
表22初级多晶型物筛选溶剂列表
6.二次多晶型物筛选
a.模式2的放大
CHP模式2用如下概述的方法放大：
·将5g得到的CHP(模式1)在6mL的90:10乙醇/水混合物中制成浆液；
·将所得浆液置于搅拌器上并搅拌约24小时；
·24小时后，从振荡器中取出样品，通过XRPD分析固体；
·按照P-SFS1482-00的2.4部分表征固体
a.纯模式1的放大
i.80℃加热模式2
·将约2.2g模式2材料(根据5.6.1节制备)置于设定为50℃的真空烘箱中；
·1小时后，取样并通过XRPD分析；
·将小瓶放回真空烘箱，并将温度升至60℃；
·30分钟后，取样并通过XRPD分析；
·将小瓶放回真空烘箱，温度升至80℃；
·在80℃下18小时后，取样并通过XRPD分析；
ii.在乙醇/DCM中的快速旋转蒸发
·将1g所得到的CHP模式1称重到圆底烧瓶中并溶解在40mL乙醇中；
·一旦固体溶解，用移液管将2mL二氯甲烷加入烧瓶中；
·然后将烧瓶连接到旋转蒸发器上，并在环境温度下在真空下快速蒸发；
·回收浅米色固体，并通过XRPD分析。
7.pH溶解度评价
如下制备CHP模式1和2用于pH溶解度评价：
·将100mg的CHP模式1和模式2各自称量到4.5mL螺旋盖玻璃小瓶中；
·将100μL所选的预热至37℃的缓冲液加入每个小瓶中；
·每体积的缓冲液加入后，将样品在培养箱振荡器中加热到37℃，持续约10分钟，然后检查样品的溶解情况。
C.结果
1.初始表征
CHP(CS/298/18)的初始表征如下：
·通过XRPD测定该物质是结晶的(图1)。所提供的CHP的XRPD图被表示为模式1。
·PLM分析发现该材料是双折射的，没有清晰的形态。偏振和非偏振图像可以分别见图12和11。
·TG分析显示从加热开始，存在一系列小的质量损失(0.6％、0.2％和0.3％)，直到大约280℃观察到样品降解。DTA确定了一个急剧的吸热现象，其起始为170℃，峰值为172℃，这很可能是样品熔化。TG/DTA热分析图见图14。
·图16显示DSC分析的第一个热循环。在75℃观察到小的宽吸热现象，在85℃观察到峰。在169℃观察到第二吸热现象，在171℃有一个峰。这与TG/DT中观察到的熔化一致。在冷却循环中没有观察到明显的热现象(图17)。在第二加热循环期间(图18)在75℃-80℃下观察到非常小的吸热现象(endodermic event)，最可能是的弱的玻璃化转变。
·图23中的DVS等温线图显示了从60％RH到90％RH的+6.3％的质量变化，表明了明显的形态变化。在形式改变后，材料表现出轻微的吸湿性，在0和90％RH之间具有0.8重量％的最大吸收(图24)。DVS动力学图见图25。XRPD分析确认，模式1的进料在暴露于DVS湿度条件后，重结晶为模式2(最初在溶剂溶解度筛选中看到，在第3节中详述)。XRPD衍射图可见于图26中。模式1和模式2衍射图的比较显示，在得到的模式1中也存在多个模式2峰，这表明得到的模式1是潜在的混合物。通过对模式2材料进行VT/VH-XRPD(根据B.1部分)进一步研究。
·对模式2DVS后回收的固体进行TG/DTA分析，热分析图可见于图27。TG分析显示6.8％的初始重量损失(0.95当量的水)，随后在280℃样品降解。DT迹线确定了与初始重量损失有关的吸热现象。随后在168℃观察到第二吸热峰(样品熔融)之前是放热现象，最可能是材料的重结晶
·得到的CHP的1H-NMR(图35)和HSQC-NMR(图38)与所提供的结构一致。没有观察到咪唑CH信号，可能是由于缓慢的弛豫
·分析得到的物质，得到pKa值为6.38(图10)。
·CHP模式1的LC-MS光谱确认了预期的荷质比m/z为235.1，对应于[C11H14N4O2]H+(图55)。
·当通过HPLC-UV分析时，得到CHP纯度为99.5％。相关色谱图见图56
2.用于溶剂溶解性筛选的样品制备
a.水中冷冻干燥
在水中冻干得到的固体分析表明该物质仍然是结晶的。无定形材料的2θ衍射图示于图40。
b.水中重复冷冻干燥
分析来自水的重复冻干固体表明该材料占主导。
3.溶剂溶解度筛选
如上所述，在30种选择的溶剂/溶剂混合物中评价CHP冻干物的溶解度。从表23的结果可知，该材料在本研究中使用的大多数溶剂/溶剂混合物中显示出低溶解度。在乙醇和甲醇中观察到高溶解度，估计其近似溶解度为100≥x≥50mg/mL。还观察到该物质可溶于水、DMSO、DMA、三氟乙醇和甲醇/水混合物。
来自回收固体的XRPD分析的溶剂溶解性结果见表24。对每种产生的模式的产品XRPD衍射图可以在图57中看到。其余的衍射图包括在图58-图60中。
表23：CHP冻干物溶剂溶解度结果
表24：来自于溶剂溶解度筛选的XRPD模式总结表
4.用于初级多晶型物筛选的样品制备
a.在水中冷冻干燥
水里冻干固体的分析表明样品仍然是结晶的。衍射图图案确定为模式2(图61)。
b.在水中重复冷冻干燥
图62显示了从水中CHP的重复冻干获得的衍射图。XRPD分析确认该材料的结晶度低于图61中所示的先前样品，但是仍然含有模式2的峰。
c.水中重复冷冻干燥(2)
图63显示了从CHP在水中的第三次冻干尝试获得的衍射图。XRPD分析确认该材料的结晶度低于图61所示的样品，但是图62的模式2的峰仍然存在。
5.初级多晶型物筛选
如上所述，在24种选择的溶剂/溶剂混合物中评价CHP显示多晶型现象的倾向。
a.温度循环
来自初级多晶型物筛选的温度循环实验的结果见表25。相关的衍射图见图64-66。
·从50:50甲醇/MtBE、10:90甲醇/MtBE，乙醇/MtBE混合物和乙酸乙酯恢复CHP纯模式1，尽管在该样品中一些有明显的优选倾向。
·从甲酸乙酯、乙腈、MEK和THF回收模式1。
·5种溶剂系统产生模式2；庚烷、乙酸异丙酯、MIBK、MtBE和甲苯。
·在由DCM产生的固体中的优选倾向意味着不能指定模式。
·氯苯中有固体，但产量不足，因此不能进行XRPD分析。
·在甲醇中产生油状物。
·剩余的溶剂系统产生溶液，因此不能进行XRPD分析。
表25：初级多晶型物温度循环筛选
b.蒸发
从初级多晶型物筛选得到的蒸发实验结果见表26和图113中。相关的衍射图见图67。
·从乙腈中回收不良结晶的模式1。
·模式2产生两次，一次来自三氟乙醇，也来自硝基甲烷。
·从DCM和THF中确定无定形物质。
·从10:90乙醇/MtBE、50:50乙醇/MtBE、MIBK和乙醇中观察到固体，但产生的量不足，因此不能进行XRPD分析。
·大多数溶剂系统在瓶壁上产生了不能通过XRPD分析的无色薄膜。
表26.初级多晶型物蒸发筛选
c.急冷
表27显示了从在2-8℃和-20℃下急冷的初级多晶型物筛选获得的结果。
·由于温度循环产生的母液不足，在50:50甲醇/MtBE和甲醇中不进行急冷实验。
·剩余的实验仅产生溶液，因此不能进行XRPD分析。
表27：初级多晶型物筛选的急冷
d.反溶剂添加
表28显示了来自加入反溶剂的初级多晶型物筛选所获得的结果。相关的衍射图见图68中。
·在丙酮、DCM和50:50乙醇/MtBE中产生的固体不足
·模式1(来自乙醇)是在反溶剂添加实验中观察到的唯一模式。
·由于温度循环产生的母液不足，没有进行50:50甲醇/MtBE和甲醇的反溶剂实验。
表28.初级多晶型物筛选的反溶剂添加
6.初级多晶型物筛选总结
表29和图114提供了初级多晶型物筛选结果的总结。
表29：初级多晶型物筛选汇总表
该初级多晶型物筛选确定了1种新形式的CHP，指定为纯模式1，并且在温度循环后产生。模式1和2也在来自温度循环的多溶剂系统中重制。2-8℃和-20℃的急速冷却实验仅返回澄清溶液。在反溶剂添加实验中，大多数溶剂体系返回透明溶液，但在添加MtBE后从乙醇中看到模式1
7.二次多晶型物筛选
a.模式2的放大
图69显示了放大的模式2的XRPD结果。XRPD衍射图确认了模式2的形成。
b.模式1的放大
i.80℃加热模式2
在该实验中没有成功地产生纯的模式1。在50℃和80℃下回收模式1和模式2的混合物。样品在50℃下保持90分钟后在2θ为8°处出现先前未见到的峰。在80℃下18小时后，该峰的强度增加。相关的衍射图可见于图70中。
ii.在乙醇/DCM中的快速旋转蒸发
对从乙醇/DCM快速蒸发回收的固体的分析表明，该物质是XRPD测定的纯模式1。衍射图在图71中。
c.模式2的表征
来自90:10乙醇/水的CHP模式2的分析得到以下结果：
·该材料通过XRPD结晶，并与在初级多晶型物筛选中获得的模式2衍射图的结晶相匹配(图72)。
·还拍摄了CHP模式2的PLM图像，并发现该材料是双折射的，具有碎片、棒状形态。偏振和非偏振光的图像可以参见图73。
·也在CHP模式2上施用了热阶段显微镜(hot stage microscopy)。初始图像确定了棒状形态(图74)。这与图69中PLM分析的图像一致。观察到该材料在95℃开始熔化，在101℃完全熔化。观察到在115℃发生重结晶。在热阶段后(post-hot stage)拍摄的PLM图像表明该材料形态不再是清楚确定，但样品仍然是双折射的。材料的热阶段后的偏振和非偏振图像可以在图75中看到。
·TG/DTA-TG分析显示初始重量损失为6.5％，随后样品在280℃(0.9当量的水)降解。DT迹线识别到与初始重量损失相关的吸热现象。随后在170℃观察到第二吸热峰(样品熔融)(图76)之前是放热现象，最可能是材料的重结晶。
·DSC的初始热循环识别到吸热现象，在99℃开始且在102℃处出峰(图77)。这与TGA中观察到的吸热数据一致，尽管在TGA中观察到的重结晶现象在DSC中不存在。在冷却循环中没有观察到热现象(图78)。第二加热循环确定在75℃下可能的玻璃化转变(图79)。
·图80显示CHP模式2的FT-IR光谱。峰值表可在表30中找到。
·VT-/VH-XRPD分析：当在环境温度下降低湿度到0％时，保持模式2进料。当温度升高到80℃时，材料改变指定为纯模式1的形式。当在80℃保持80分钟时，保持纯模式1。表31显示了在每个步骤中的湿度、温度和模式识别。相关的衍射图可见于图81。
·CHP模式2的DVS分析表明，该材料从40％RH至90％RH或从90％RH至10％RH时没有改变形式，但低于10％RH损失3.5重量％(0.5当量的水)。从0到90％RH观察到发生再水合。这可以在图82的DVS等温线图中看出。图83显示了DVS动力学图。DVS后的XRPD分析显示在40％RH下形式没有变化。比较XRPD衍射图可见于图84。在该实验中观察到的非化学计量的水损失被认为归因于环境温度(约25℃)，脱水的动力学太慢，因此仪器在完成前移动到下一阶段。为了进一步研究这一点，进行了可变温度DVS实验，如下详述。
·在40℃的VT-DVS分析表明，低于10％RH材料开始脱水，从10％到0％RH(0.8当量的水)损失了大约5.8重量％。该材料随后从0到40％RH再水合。DVS等温线图可在图85中看到，动力学线图可在图86中看到。50℃下的DVS分析显示，材料低于20％RH开始脱水，损失了大约6.1重量％(0.8当量水)。然后该材料从0到40％RH再水合。图87显示50℃等温线图，图88显示动力学图。在60℃的VT-DVS表明该材料低于20％RH开始脱水，损失了大约7重量％或1.0当量的水。注意到该材料在0到40％RH之间再水合。60℃等温线图可在图89中看到，动力学线图可在图90中看到。对回收的固体进行XRPD分析显示DVS后，该材料是模式1和模式2的混合物，比较XRPD衍射图可见于图91。
·发现CHP模式2的HPLC纯度为99.5％。
表30：来自乙醇/水的CHP模式2的FT-IR峰值表
表31.CHP图谱2的VT/VH-XRPD结果
8.pH溶解度评价
对于CHP模式1和模式2的pH溶解度评价发现，在加入3体积的缓冲液后，在所有测试的pH值(pH 1、4、6.8和7.2)下发生溶解。模式1和模式2的溶解度估计为500≥x≥333.3mg/mL。结果的总结显示在表32中。
溶解后样品的图像可以在图92中看到模式1材料的和在图93中看到模式2的。
表32.pH溶解度结果总结表
9.稳定性研究
a.1周稳定性评价
在40℃/75％RH、80℃和环境光下测试的样品的XRPD 2θ衍射图显示于图94中。在40℃/75％RH或环境光下储存的样品观察到形态没有变化。根据先前的热学实验、DVS和VT/VH XRPD实验，发现模式2材料在80℃下7天后转变成模式1。
CHP模式2的HPLC纯度结果列于表33中。在所有条件下，储存7天后纯度没有下降。稳定性样品的HPLC色谱图显示在图95-97中。
表33.CHP模式21周的稳定性纯度结果
b.8周稳定性评价
i.两周时间点
两周时间点的XRPD 2θ衍射图示于图98为纯模式1的和图99为模式2的。结果表明，在40℃/75％RH下14天后，纯模式1转变为模式2。14天后CHP模式2观察到形态没有变化。
ii.四周时间点
四周时间点的XRPD 2θ衍射图显示在图100为纯模式1的和图101为模式2的。结果显示，两周后先前已转变为模式2的纯模式1材料在40℃/75％RH下4周后仍保持模式2。4周后CHP模式2观察到形态没有变化。
iii.八周时间点
八周时间点的XRPD 2θ衍射图显示于图102为纯模式1的和图103为模式2的。结果显示两周后，先前已转变为模式2的纯模式1材料在40℃/75％RH下8周后仍保持模式2。8周后观察到CHP模式2的形式没有变化。
iv.外观测试
表34和图115显示了8周稳定性研究的外观测试结果。纯模式1和模式2的外观在整个实验期间保持一致。
表34：8周稳定性外观结果总结
v.手性HPLC
HPLC分析确认纯的模式1和模式2投料样品(input samples)都具有高的手性纯度。在稳定性评估的整个持续时间内没有手性纯度的变化。结果总结可见于表35。HPLC色谱图见图104-图110。
表35：手性HPLC结果总结
c.1天稳定性评价
在40℃/75％RH下储存的XRPD结果示于图111中。在40℃/75％RH下2小时后，发现纯模式1转变为模式2。最初的实验还包括在4、6和8小时的其它时间点，但是当第一时间点之后材料转变为模式2，实验在2小时后停止。
d.结果总结
1.初始表征
通过XRPD发现所提供的材料CHP是结晶的，通过PLM发现其是双折射的，没有明确定义的形态。该材料具有TG/DTA的0.6、0.2和0.3％的几个质量损失，并且当加热到280℃时发现降解。在170℃还观察到熔融。DSC给出在75℃下小的吸热现象的结果，这归因于溶剂(水)损失。在169℃观察到第二次吸热，在171℃出峰。这与TG/DT中观察到的熔化一致。在冷却循环中没有观察到明显的热现象，但在第二次加热循环期间在75℃观察到弱玻璃化转变。
DVS数据显示从60％RH到90％RH的+6.3％质量变化，表明明显的重结晶现象。重结晶后，该材料表现出轻微的吸湿性，在0％和90％RH之间具有0.8重量％的最大吸收。DVS后XRPD分析确认了形式的变化。将DVS后产生的衍射图图案指定为模式2，并确定为模式1的水合形式。DVS后的TG/DTA显示模式2投入材料在加热时脱水并损失6.8重量％(0.95当量的水)。随后在168℃下熔融样品之前进行再结晶。该熔体的温度与模式1熔体一致。两个样品之间的熔点一致性意味着在重结晶为模式1之前，模式2是一水合物并且加热时损失约1当量的水。
NMR数据与提供的结构一致，并显示没有溶剂含量。
2.溶剂溶解性
得到的CHP(模式1)在本研究中使用的大多数溶剂/溶剂混合物中显示低溶解度。在甲醇和乙醇中观察到高溶解度，估计其近似溶解度为100≥x≥50mg/mL。还观察到该物质可溶于水、DMSO、DMA、三氟乙醇和甲醇/水混合物。模式2是在该实验期间确定的唯一新晶型(除了得到的模式1之外)。从17种溶剂体系中回收模式2，且模式1仅从1-丙醇看到。从乙醇看到模式1和模式2的混合物。THF回收具有一些模式2峰的无定形材料。
3.初级多晶型物筛选
该初级多晶型物筛选确定了1种新形式的CHP，指定为纯模式1，并且在温度循环后产生。模式1和2也在来自温度循环的多溶剂系统中重制(reproduced)。在2-8℃和-20℃下的急速冷却实验仅回收澄清溶液。在反溶剂添加实验中，大部分溶剂体系返回透明溶液，但在添加MtBE后从乙醇中看到模式1。
4.二次多晶型物筛选
二次多晶型物筛选发现CHP模式2成功地从乙醇/水中放大。材料的分析产生以下结果：
·该材料通过XRPD结晶，并与在初级多晶型物筛选中获得的模式2衍射图的结晶度相匹配。
·还拍摄了CHP模式2的PLM图像，发现该材料是双折射的，具有碎片、棒状形态。
·在热阶段显微实验(hot-stage microscopy experiment)开始时拍摄的初始图像确定了与模式2的PLM图像一致的棒状形态。观察到该材料在95℃开始熔化，在101℃完全熔化。在115℃观察到发生重结晶。热阶段后拍摄的PLM图像表明材料形态不再是清楚确定的，但样品仍然是双折射的。
·TG/DTA-TG分析显示初始重量损失为6.5％，随后在280℃样品降解。DT迹线确定了与初始重量损失有关的吸热现象。随后在170℃观察到第二吸热峰(样品熔融)之前发生放热现象，最可能是材料的重结晶。
·DSC的初始热循环确定吸热现象，99℃开始且102℃出峰。这与TGA中观察到的吸热数据一致，尽管在TGA中观察到的重结晶现象在DSC中不存在。在冷却循环中观察到没有热现象，但在第二个加热循环中在75℃观察到小的玻璃化转变。
·VT-/VH-XRPD分析：在环境温度下降低湿度到0％时，保留模式2投入材料。当温度升高到80℃时，材料改变了指定为纯模式1的形式。当在80℃保持80分钟时，纯模式1保留。
·CHP模式2的DVS分析表明，该材料从40％RH至90％RH或从90％RH至10％RH时没有变化形式，但低于10％RH损失3.5重量％(0.5当量的水)。从0到90％RH观察到发生再水合。DVS后的XRPD分析显示在40％RH下形式没有变化。
·VT-DVS-样品在40℃脱水低于10％RH，且在50和60℃脱水低于20％RH。材料在每个温度升高时损失较高百分比的水，但在每个实验中从0至40％RH再水合。VT-DVS后，通过XRPD可以看到模式1和2的混合物。
·发现CHP模式2的HPLC纯度为99.5％。
在加热至80℃时没有成功地再生产纯的模式1，模式1和2的混合物通过XRPD确认。一旦样品在50℃保持90分钟，XRPD还确定了先前在2θ为8°处未见的峰。在80℃18小时后，该峰的强度增加。在本研究中产生的任何其它衍射图中都没有看到该峰。
通过在乙醇/DCM中快速蒸发，成功地重新制备纯的模式1。
5.1周稳定性研究
1周稳定性研究显示模式2在所评估的条件(40℃/75％RH、80℃和环境光)下表现出良好的化学稳定性。7天后，任何样品的纯度都观察到没有变化。
80℃的高温导致1周后从模式2脱水为模式1，但当在40℃/75％RH和环境光下储存时，材料确实保持为模式2。
6.8周稳定性研究
8周稳定性研究显示，纯模式1材料在40℃/75％RH下表现出差的物理稳定性，其中在第一(两周)时间点之后材料转变为水合模式2。尽管对原始样品继续研究，但是从2周时间点起进行稳定性测试的材料是模式2而不是模式1，这是由于纯模式1在该温度和湿度下的差的稳定性。在任何测试的时间点都观察到外观没有变化，尽管XRPD确定了形式的变化。
相反，模式2显示良好的物理稳定性，在8周稳定性评估的持续时间内观察到形式没有变化。模式2材料的外观在整个实验中在任何点都没有变化。在8周评估开始时，发现纯模式1和模式2都具有高手性纯度，并且在整个实验持续时间内，在所有样品中都保持高手性纯度。
7.1天稳定性研究
1天稳定性评估确认纯模式1材料在高湿度条件下容易转变为模式2。XRPD分析确认，在40℃/75％RH下仅2小时后发生形态变化。
8.pH溶解度评价
对于CHP模式1和模式2的pH溶解度评价都发现，在加入3体积的缓冲液后，在所有测试的pH值(pH 1、4、6.8和7.2)下发生溶解。模式1和模式2的溶解度估计为500≥x≥333.3mg/mL。
e.结论
对模式2CHP的长期8周稳定性研究表明在40℃/75％RH下具有良好的物理稳定性。XRPD分析确认模式2在8周评估的整个持续时间内占优势。对纯模式1CHP的八(8)周稳定性研究表明在40℃/75％RH下差的物理稳定性。模式2是CHP最适合进一步开发的形式。
实施例7-稳定性研究
目的：为了GMP模式的药物物质的储存和生产的稳定性数据。
包装：在每个单独的时间点将样品包装在都用缆带固定的双抗静电LDPE袋中。将在相同的保存条件下包装的试样一起保存在纤维滚筒内，用金属盖封闭。所有包装以相同方式制备并贴标签。表36中提供了关于包装材料描述的细节。
表36.包装材料说明
注：防静电LDPE袋由STA提供，将其切成小块并热封后再用于稳定性研究
时间零点为样品放置在站(station)上的日期。初始测试结果来自于发布测试，只要样品在发布测试日期的30天内放置在工作站上，否则，重复初始测试。稳定性方案提供于表37中。
表37.稳定性方案
测试项目X＝提取样品并通过HPLC，手性和水含量测试外观，含量和杂质
Y＝提取样品并测试XRPD
“---”＝未安排
研究要求：样品总量为22.5g(如果初始测试不需要，则样品总量为21g)：
·如果需要，初始试验1.5g；
·将21g样品分成14份，每份1.5g，每份样品应称重到用电缆扎带固定的双抗静电LDPE袋中。将各储存条件的稳定性样品一起储存在纤维桶中，用金属盖封闭，然后分别储存在25±2℃/60+5％RH(9袋)和40±2℃/75±5％RH(5袋)。
取样时间：
在预定日期或在预定日期之后2个工作日内拉出存储不超过6个月的样品。将贮存6个月以上的样品放入预定日期+2工作日。
样品储存和测试周期限制：
在样品从稳定室中取出后的10和20个工作日内，分别分析和完成储存一个月至一年和大于一年的稳定性样品。如果进行了时间零点测试，则在研究开始后10个工作日内对其进行分析。
表38和表39中提供了关于模式2的稳定性的详细信息。
表38.在25℃/60％RH下6个月稳定性结果。
*注：参考标准(批号：PS03027-15-H)用于XRPD分析。参考标准品(批号：1056491)分别用于其他化学品(chemical)。
*1注：初始日期指的是C180726100-H的发布的COA(the release COA of C180726100-H)。
表39.在40℃/75％RH下6个月稳定性结果。
稳定性样品的结果满足本说明书的验收标准。空白、分辨溶液和样品溶液(6M)用于杂质测试的代表性重叠色谱图提供于图112中。
在此描述的实施例旨在是示例性的。本领域技术人员将理解，在不偏离由所附权利要求书所包含的本发明的范围的情况下，可以进行变化和修改。
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