阅读说明：本技术 络氨酸peg修饰衍生物及其制备方法与应用 (leucine-PEG (polyethylene glycol) modified derivative and preparation method and application thereof ) 是由 潘军 冯丽娜 于 2020-05-28 设计创作，主要内容包括：本发明提供一种络氨酸PEG修饰衍生物及其制备与应用,所述络氨酸烯烃化衍生物是对络氨酸烯衍生物中苯酚基邻位直接烯烃化而得,其催化剂廉价易得且环境友好、反应条件温和、位点选择性高,反应高效,只需一步便可制得络氨酸烯烃化衍生物。本发明的有益效果主要体现在：本发明提供了一类新的络氨酸烯烃化衍生物,这类化合物底物广谱性高,反应条件温和且制备过程简单、高效、便捷,为赖氨酸保健品及药物制备提供了新的选择。(The invention provides a leucine PEG modified derivative, and preparation and application thereof, wherein the leucine alkene derivative is obtained by direct alkene alkylation of the ortho position of a phenol group in a leucine alkene derivative, a catalyst of the leucine alkene derivative is cheap and easy to obtain, the leucine alkene derivative is environment-friendly, the reaction condition is mild, the site selectivity is high, the reaction is efficient, and the leucine alkene derivative can be prepared by only one step. The invention has the following beneficial effects: the invention provides a new leucine alkene derivative, the substrate of the compound has high broad spectrum, the reaction condition is mild, the preparation process is simple, efficient and convenient, and a new choice is provided for the preparation of lysine health care products and medicaments.)

络氨酸PEG修饰衍生物及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及氨基酸领域，特别涉及一种络氨酸PEG修饰衍生物及其制备与应用。

背景技术

多肽是α－氨基酸以肽键连接在一起而形成的化合物，通常由10～100个氨基酸分子脱水缩合而成，是蛋白质水解的中间产物，生物很多活性物质是以肽的形式存在的。多肽能调控细胞的分裂和新陈代谢，确保基因的表达和复制，使蛋白质合成的数量、质量和速度处在正常状态，提高蛋白质合理利用率，涉及人体的激素、神经、细胞生长和生殖各领域，影响生长发育、衰老与疾病。活性多肽参蛋白质、脂肪和糖三大物质的代谢。

酪氨酸是一种非必需氨基酸，化学名称为2-氨基-3-对羟苯基丙酸，它是一种含有酚羟基的芳香族极性α-氨基酸，在人及动物体内由苯丙氨酸羟化而产生。它参与多巴胺、去甲肾上腺素和肾上腺素的生成，有调节情绪，刺激神经系统的作用。此外还帮助加快身体新陈代谢，治疗慢性疲劳等疾病。络氨酸的升高和降低会引发高络氨酸血症和苯丙酮尿症等多种疾病的形成有关。目前，酪氨酸保健品已广泛应用于治疗过敏，头痛，帕金森氏症和药物戒断反应。

聚乙二醇化学修饰是将聚乙二醇高分子链化学偶联到蛋白质分子上，通过增大药物分子体积以有效延长其体内半衰期，同时遮蔽其免疫位点以显著降低免疫原性，是国际上公认的最为有效的长效蛋白质制剂化技术之一。聚乙二醇(PEG)是中性、无毒且具有独特理化性质和良好的生物相溶性的高分子聚合物，也是经FDA批准的极少数能作为体内注射药用的合成聚合物之一。聚乙二醇即PEG具有高度的亲水性，在水溶液中有较大的水动力学体积，并且没有免疫原性。当藕联到药物分子或药物表面时，可以将其优良性质赋予修饰后的药物分子，改变它们在水溶液中的生物分配行为和溶解性，在其修饰的药物周围产生空间屏障，减少药物的酶解，避免在肾脏的代谢中很快消除，并使药物能被免疫系统的细胞识别。

发明内容

本发明的目的在于提供一种新的络氨酸PEG修饰衍生物及其制备与应用。

本发明采用的技术方案是：

一种甲萘胺衍生物的制备方法如下；

式(I)中R₁为苯基、取代苯基、C5-C6芳环、C1-C10烷基、C1-C10烷氧基或C1-C10取代烷基，以及氨基酸的至少其中一种，所述取代苯基的取代基为甲基、氯、硝基、氟或甲氧基；

R₂为苯基、取代苯基、C5-C6芳环、C1-C10烷基、C1-C10烷氧基或C1-C10取代烷基以及氨基酸的至少其中一种，所述取代苯基的取代基为甲基、氯、硝基、氟或甲氧基；

式(II)中的PEG为聚合度为2-100的乙二醇。

一种络氨酸PEG修饰衍生物，结构式如下式之一所示：

在其中的一个实例中，如若PEG与马来酰胺连接，则马来酰胺PEG的结构式如下所示：

依旧以马来酰胺PEG为例进行说明，本发明还涉及所述络氨酸PEG修饰衍生物的制备方法，所述方法包括：将络氨酸衍生物溶于乙酸溶剂中，加入马来酰胺-PEG、催化剂、氧化剂，配体于60～70℃反应完全得到反应液，反应液经分离纯化获得所述络氨酸PEG衍生物；所述催化剂为下列之一：醋酸钯、氯化钯、乙酰丙酮钯，优选醋酸钯；所述氧化剂为下列之一：氧化锰、醋酸碘苯、叔丁基过氧化氢、过硫酸钾、苯醌、醋酸铜一水合物，优选醋酸铜；所述配体：吡啶，2-甲基吡啶，喹啉，优选吡啶；所述络氨酸衍生物、马来酰胺-PEG、催化剂、氧化剂、配体的物质的量之比为1:1～5:0.1～0.5:1～5:1～5。

所述络氨酸PEG衍生物结构为(a)时，所述反应底物络氨酸衍生物为苯甲酰基-L-酪氨酸乙酯。

所述络氨酸PEG衍生物结构为(b)时，所述反应底物络氨酸衍生物为乙酰基-L-酪氨酸。

所述络氨酸PEG衍生物结构为(c)时，所述反应底物络氨酸衍生物为芴甲氧羰酰基-络氨酸。

所述络氨酸PEG衍生物结构为(d)时，所述反应底物络氨酸衍生物为芴甲氧羰酰基-甘氨酸-络氨酸二肽。

所述络氨酸PEG衍生物结构为(e)时，所述反应底物络氨酸衍生物为芴甲氧羰酰基-络氨酸-甘氨酸-缬氨酸三肽。

所述络氨酸PEG衍生物结构为(f)时，所述反应底物络氨酸衍生物为芴甲氧羰酰基-络氨酸-丙氨酸-缬氨酸三肽。

所述络氨酸PEG衍生物结构为(g)时，所述反应底物络氨酸衍生物为催产素。

优选的，所述络氨酸衍生物、马来酰胺-PEG、催化剂、氧化剂、配体的物质的量之比为1:1.2:0.1:2:2。

所述催化剂优选为醋酸钯，氧化剂优选为过硫酸钾，配体优选为吡啶。

具体的，所述分离纯化方法如下：反应液中加入饱和NaCl水溶液，用二氯甲烷萃取，取有机层经过无水硫酸镁干燥、过滤、常温下旋转蒸除溶剂，即得粗品；将粗品进行硅胶柱层析，以乙酸乙酯和石油醚的体积比为1:5的溶液为流动相，TLC跟踪收集Rf值为0.3-0.5的洗脱液，收集得到的洗脱液经减压除去溶剂，干燥，得到所述络氨酸PEG衍生物。

本发明提供了对络氨酸邻位直接PEG修饰的新方法，其催化剂廉价易得且环境友好、反应条件温和、位点选择性高，反应高效，而且只需一步便可制得络氨酸PEG衍生物。

本发明还涉及所述络氨酸PEG修饰衍生物在制备酪氨酸类多肽药物的中的应用。

本发明还涉及所述络氨酸多肽衍生物制备抗肿瘤药物中的应用，具体的，所述络氨酸多肽衍生物为化合物(g)。实验结果显示，化合物(g)具有一定的抗肿瘤活性，为肿瘤药物筛选提供了新的途径。

本发明的有益效果主要体现在：本发明提供了一类新的氨酸PEG修饰衍生物，这类化合物底物广谱性高，反应条件温和且制备过程简单、高效、便捷，为络氨酸类药物制备提供了新的选择。

附图说明

图1是本方案提供的7种络氨酸PEG修饰衍生物的示意图。

图2为化合物(a)质谱分析结果图。

图3为化合物(b)质谱分析结果图。

图4为化合物(c)质谱分析结果图。

图5为化合物(d)质谱分析结果图。

图6为化合物(e)质谱分析结果图。

图7为化合物(f)质谱分析结果图。

图8为化合物(g)质谱分析结果图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1：制备PEG修饰苯甲酰基-L-酪氨酸乙酯

将1mmol苯甲酰基-L-酪氨酸乙酯(1)加入4ml的乙酸溶剂中，向其中加入0.1mmol醋酸钯，1.2mmol马来酰胺-PEG，2.0mmol乙酸银，1.0mmol吡啶，60℃下反应12小时，反应结束后，反应液中加入饱和NaCl水溶液，用二氯甲烷萃取，取有机层经过无水硫酸钠干燥、过滤、减压蒸干，即得化合物粗品。粗产品通过制备液相进行分离，以甲醇和二氯甲烷的体积比为1：30的溶液为流动相，TLC跟踪收集Rf值为0.3-0.5的洗脱液，收集得到的洗脱液经减压除去溶剂，干燥，得到式(a)所示的化合物纯品。(MS(ESI+):Calculated forC29H36N2O9:[M+H]+557.24，found 557.39.)

修饰得到的化合物如下：

实施例2：制备PEG修饰的乙酰基-L-酪氨酸

将1mmol乙酰基-L-酪氨酸(2)加入4ml的乙酸溶剂中，向其中加入0.1mmol醋酸钯，1.2mmol马来酰胺-PEG，2.0mmol乙酸银，1.0mmol吡啶，60℃下反应12小时，反应结束后，反应液中加入饱和NaCl水溶液，用二氯甲烷萃取，取有机层经过无水硫酸钠干燥、过滤、减压蒸干，即得化合物粗品。粗产品通过制备液相进行分离，以甲醇和二氯甲烷的体积比为1：30的溶液为流动相，TLC跟踪收集Rf值为0.3-0.5的洗脱液，收集得到的洗脱液经减压除去溶剂，干燥，得到式(a)所示的化合物纯品。(MS(ESI+):Calculated for C27H32N2O9:[M+H]+529.21，found 529.21.)

修饰得到的化合物如下：

实施例3：制备PEG修饰芴甲氧羰酰基-L-络氨酸

将1mmol芴甲氧羰酰基-络氨酸(3)加入4ml的乙酸溶剂中，向其中加入0.1mmol醋酸钯，1.2mmol马来酰胺-PEG，2.0mmol乙酸银，1.0mmol吡啶，60℃下反应12小时，反应结束后，反应液中加入饱和NaCl水溶液，用二氯甲烷萃取，取有机层经过无水硫酸钠干燥、过滤、减压蒸干，即得化合物粗品。粗产品通过制备液相进行分离，以甲醇和二氯甲烷的体积比为1：30的溶液为流动相，TLC跟踪收集Rf值为0.3-0.5的洗脱液，收集得到的洗脱液经减压除去溶剂，干燥，得到式(a)所示的化合物纯品。(LCMS(ESI+):Calculated for C35H38N2O10:[M+H]+647.25，found 647.32.)

修饰得到的化合物如下：

实施例4：制备PEG修饰芴甲氧羰酰基-甘氨酸-络氨酸二肽

将1mmol芴甲氧羰酰基-甘氨酸-络氨酸二肽(4)加入4ml的乙酸溶剂中，向其中加入0.1mmol醋酸钯，1.2mmol马来酰胺-PEG，2.0mmol乙酸银，1.0mmol吡啶，60℃下反应12小时，反应结束后，反应液中加入饱和NaCl水溶液，用二氯甲烷萃取，取有机层经过无水硫酸钠干燥、过滤、减压蒸干，即得化合物粗品。粗产品通过制备液相进行分离，以甲醇和二氯甲烷的体积比为1：30的溶液为流动相，TLC跟踪收集Rf值为0.3-0.5的洗脱液，收集得到的洗脱液经减压除去溶剂，干燥，得到式(a)所示的化合物纯品。(MS(ESI+):Calculated forC24H33N3O10:[M+H]+524.22，found 524.53.)

修饰得到的化合物如下：

实施例5：制备PEG修饰芴甲氧羰酰基-络氨酸-甘氨酸-缬氨酸三肽

将1mmol芴甲氧羰酰基-络氨酸-甘氨酸-缬氨酸三肽(5)加入4ml的乙酸溶剂中，向其中加入0.1mmol醋酸钯，1.2mmol马来酰胺-PEG，2.0mmol乙酸银，1.0mmol吡啶，60℃下反应12小时，反应结束后，反应液中加入饱和NaCl水溶液，用二氯甲烷萃取，取有机层经过无水硫酸钠干燥、过滤、减压蒸干，即得化合物粗品。粗产品通过制备液相进行分离，以甲醇和二氯甲烷的体积比为1：30的溶液为流动相，TLC跟踪收集Rf值为0.3-0.5的洗脱液，收集得到的洗脱液经减压除去溶剂，干燥，得到式(a)所示的化合物纯品。(MS(ESI+):Calculatedfor C42H50N4O12:[M+H]+803.34，found 803.15)

修饰得到的化合物如下：

实施例6：制备PEG修饰芴甲氧羰酰基-络氨酸-丙氨酸-缬氨酸三肽

将1mmol芴甲氧羰酰基-络氨酸-丙氨酸-缬氨酸三肽(6)加入4ml的乙酸溶剂中，向其中加入0.1mmol醋酸钯，1.2mmol马来酰胺-PEG，2.0mmol乙酸银，1.0mmol吡啶，60℃下反应12小时，反应结束后，反应液中加入饱和NaCl水溶液，用二氯甲烷萃取，取有机层经过无水硫酸钠干燥、过滤、减压蒸干，即得化合物粗品。粗产品通过制备液相进行分离，以甲醇和二氯甲烷的体积比为1：30的溶液为流动相，TLC跟踪收集Rf值为0.3-0.5的洗脱液，收集得到的洗脱液经减压除去溶剂，干燥，得到式(a)所示的化合物纯品。(MS(ESI+):Calculatedfor C43H52N4O12:[M+H]+817.36，found 817.31.)

修饰得到的化合物如下：

实施例7：制备PEG修饰胸腺五肽

将1mmol胸腺五肽(7)加入4ml的乙酸溶剂中，向其中加入0.1mmol二乙酰丙酮钯，1.2mmol马来酰胺-PEG，2.0mmol乙酸银，2.0mmol过硫酸钾，60℃下反应12小时，反应结束后，反应液中加入饱和NaCl水溶液，用二氯甲烷萃取，取有机层经过无水硫酸钠干燥、过滤、减压蒸干，即得PEG化芴甲氧羰酰基-络氨酸-丙氨酸-缬氨酸化合物粗品。将PEG化胸腺五肽化合物粗品进硅胶柱层析，以乙酸乙酯和石油醚的体积比为1：5的溶液为流动相，TLC跟踪收集Rf值为0.3-0.5的洗脱液，收集得到的洗脱液经减压除去溶剂，干燥，得到式(g)所示的化合物纯品29mg(质谱图参见图6)。(MS ESI⁺):Calculated for C41H66N10O14:[M+H]+923.48，found 923.07.)

修饰得到的化合物如下：

实施例8：抗肿瘤检测

将肿瘤细胞MCF-7接种4000个细胞/瓶至含有10％胎牛血清的DMEM高汤培养液的细胞培养瓶中，置于5％CO₂、37℃的培养箱中培养3天、取出细胞培养瓶在无菌操作台中收集细胞。将细胞以4000个/孔的浓度接种至含有10％胎牛血清的DMEM高汤培养液的96孔板中，并在板盖上加上注释，于5％CO₂、37℃培养12小时，待细胞在96孔板上贴壁，在无菌操作台中用移液枪加待测药物(实施例7制备的化合物(g))，使每孔药物浓度分别为0.01、0.1、1、10.0、100.0μM五个浓度梯度，每个浓度设置有五个平行组，以雌激素酮作为对照)，并再次将96孔板置于5％CO₂、37℃培养24小时。取出96孔板，向每个孔中加入20μL的MTS试剂盒试剂(购自Promega公司)，避光孵化40分钟，利用酶标仪测其吸光度。从而计算出细胞抑制率和细胞毒性，用IC Estimator software软件处理，计算IC50以及IC50 95％可信区间，结果见附表1所示：

表1

本发明不局限于上述最佳实施方式，任何人在本发明的启示下都可得出其他各种形式的产品，但不论在其形状或结构上作任何变化，凡是具有与本申请相同或相近似的技术方案，均落在本发明的保护范围之内。