阅读说明：本技术 一种高效抗肿瘤活性多肽Tubulysin M的制备方法 (Preparation method of efficient anti-tumor active polypeptide Tubulysin M ) 是由 吴正治 龙伯华 于 2020-05-22 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种高效抗肿瘤活性多肽Tubulysin M的制备方法,包括步骤S1,提供化合物2；步骤S2,以化合物2作为关键原料制备活性多肽Tubulysin M。本发明的制备方法采用了创新性的路线,优化了活性多肽Tubulysin M的全合成过程,总产率较高,立体选择性好。(The invention provides a preparation method of a high-efficiency anti-tumor active polypeptide Tubulysin M, which comprises the steps of S1, providing a compound 2; step S2, preparing the active polypeptide Tubulysin M by using the compound 2 as a key raw material. The preparation method provided by the invention adopts an innovative route, optimizes the whole synthesis process of the active polypeptide Tubulysin M, and has the advantages of high total yield and good stereoselectivity.)

一种高效抗肿瘤活性多肽Tubulysin M的制备方法

技术领域

本发明涉及药物的技术领域，更具体地，涉及一种高效抗肿瘤活性多肽TubulysinM的制备方法。

背景技术

四肽化合物Tubulysins是2000年由Hofle等从粘细菌中提取出来的，但其晶体结构直到2004年才被确定下来。Tubulysin A-Z是一个家族化合物，见表1，它们都属于天然产物。

表1 Tubulysins家族化合物的结构式

活性多肽Tubulysin M是化学家通过结构改造得到，即将敏感的缩醛替换为稳定的甲基。研究发现活性多肽Tubulysin M对人癌细胞显示出极强的细胞毒活性，IC₅₀值在较低的纳摩尔范围内，见表2(参考文献J.Am.Chem.Soc.,2016,138(5):1698-1708)。活性多肽Tubulysin M是一种具有细胞毒性活性微管溶素，抑制微管蛋白聚合并导致细胞周期停滞和凋亡。此外，研究表明活性多肽Tubulysin M同时还具有抑制血管新生和抗多重耐药性的优点。在水溶性方面活性多肽Tubulysin M相比其它抗癌药物有着明显的优势，其对特定的癌细胞表现出超强的抗癌活性，使其成为新型抗癌新药研发中颇受关爱的目标分子之一。

表2活性多肽Tubulysin M对人癌细胞的体外细胞毒活性

从活性多肽Tubulysin M较短几年的发展历程看，活性多肽Tubulysin M以其独有的生物活性正在受到越来越多人的关注，已经成为抗肿瘤药物中的明星分子。但其合成并不理想，至今活性多肽Tubulysin M及其类似物化学合成上报道的文献的合成路线大部分不是很完美，存在很大进一步探索的空间。

因此，如何提供一条简洁快速，可以大量合成的路线对活性多肽Tubulysin M的进一步生物研究及实现临床应用具有重要意义。

有鉴于此，特提出本申请。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种活性多肽Tubulysin M的制备方法，该制备方法采用了创新性的路线，优化了活性多肽Tubulysin M的全合成过程，总产率较高，立体选择性好。

为了达到上述技术效果，本发明采用的技术方案的基本思路如下：

一种高效抗肿瘤活性多肽Tubulysin M的制备方法，所述制备方法包括：

步骤S1，提供化合物2；

步骤S2，以化合物2作为关键原料制备活性多肽Tubulysin M；

其中，化合物2的化学式如下：

活性多肽Tubulysin M的化学式如下：

作为一种实施方式，所述步骤S2采用如下合成路线：

其中，上述反应式中使用的化合物3、化合物7和化合物9的化学式如下：

包括如下步骤：

(1)将化合物2于三氟乙酸中，加热回流反应至完毕，减压浓缩，真空干燥后得到中间体；

将所述中间体溶于二氯甲烷，加入化合物3和HATU，搅拌均匀后加入二异丙乙基胺，于室温下搅拌反应，加水淬灭反应，萃取，然后合并有机相，依次用水和饱和食盐水洗涤，分液，有机相加无水硫酸钠干燥，减压浓缩，得到粗品，用石油醚和乙酸乙酯的混合液为洗脱液进行柱层析分离，得到化合物4；

(2)将所述化合物4溶于二氯甲烷，在冰水浴冷却下加入2,6-二甲基吡啶和叔丁基二甲硅基三氟甲磺酸酯，升到室温搅拌反应，加水淬灭反应，萃取合并有机相，依次用稀盐酸和饱和食盐水洗涤，分液，有机相加无水硫酸钠干燥，减压浓缩，得到粗品，用石油醚和乙酸乙酯的混合液为洗脱液进行柱层析分离，得到化合物5；

(3)将所述化合物5溶于DMF，冰水浴冷却下加入60％的氢化钠固体，然后加入碘甲烷，缓慢升到室温搅拌反应，再用冰水浴冷却，加饱和氯化铵水溶液淬灭反应，萃取合并有机相，用水和饱和食盐水洗涤，分液，有机相加无水硫酸钠干燥，减压浓缩，得到粗品，用石油醚和乙酸乙酯的混合液为洗脱液进行柱层析，分离得到化合物6；

(4)将所述化合物6溶于四氢呋喃/水混合溶剂，冰水浴冷却下加入氢氧化钠固体，然后升到室温搅拌反应，反应结束后冰水浴冷却，酸化溶液至pH＝2，萃取合并有机相，依次用水和饱和食盐水洗涤，分液，有机相加无水硫酸钠干燥，减压浓缩，得到中间体酸；

将上述中间体酸溶于二氯甲烷，加入化合物7和HATU，搅拌均匀后加入二异丙乙基胺，于室温下搅拌反应，加水淬灭反应，萃取合并有机相，依次用水和饱和食盐水洗涤，分液，有机相加无水硫酸钠干燥，减压浓缩，得到粗品，用石油醚和乙酸乙酯混合液为洗脱液进行柱层析，分离得到化合物8；

(5)将化合物8溶于四氢呋喃/水混合溶剂，加入三苯基膦，加热回流反应至完毕，减压浓缩，再用甲苯除水，真空干燥得到中间体胺；

将所述中间体胺溶于二氯甲烷，加入化合物9和HATU，搅拌均匀后加入二异丙乙基胺，于室温下搅拌反应，加水淬灭反应，萃取合并有机相，依次用水和饱和食盐水洗涤，分液，有机相加无水硫酸钠干燥，减压浓缩，得到粗品，用石油醚和乙酸乙酯混合液为洗脱液进行柱层析，分离得到化合物10；

(6)将所述化合物10溶于甲醇，加入氟化铵固体，加热回流反应，减压浓缩，加水稀释，萃取合并有机相，用饱和食盐水洗涤，分液，有机相加无水硫酸钠干燥，减压浓缩，得到第一中间体；

将所述第一中间体溶于四氢呋喃/水混合溶剂，加入氢氧化钠固体，然后加热回流反应，冰水浴冷却，酸化至溶液pH＝2，萃取合并有机相，依次用水和饱和食盐水洗涤，分液，有机相加无水硫酸钠干燥，减压浓缩，得到第二中间体；

将所述第二中间体溶于吡啶，加入醋酸酐，于室温下搅拌反应，加水淬灭反应，冰水浴冷却，酸化至溶液pH＝2，萃取合并有机相，依次用水和饱和食盐水洗涤，分液，有机相加无水硫酸钠干燥，减压浓缩，得到第三中间体；

将所述第三中间体溶于二氯甲烷，加入三氟乙酸，于室温下搅拌反应，减压浓缩，干燥得到第四中间体；

将所述第四中间体溶于乙腈和甲醇的混合溶剂，加入甲醛水溶液，于室温下搅拌反应，加入氰基硼氢化钠，搅拌反应至完毕，滴加冰醋酸至溶液的pH＝5，然后于室温下搅拌反应至完毕，减压浓缩，先用硅胶柱层析分离纯化，再用异丙醚打浆纯化，得到化合物1。

作为一种实施方式，所述步骤(1)中，化合物2：化合物3：HATU：二异丙乙基胺的摩尔比＝1：1.1-1.5：2-3：4-6，优选为1：1.2：3：6。

优选地，所述步骤(1)中，所述石油醚和乙酸乙酯的混合液中石油醚：乙酸乙酯的体积比＝4：1。

优选地，所述步骤(1)中，所述萃取使用的溶剂为二氯甲烷。

作为一种实施方式，所述步骤(2)中，化合物4：2,6-二甲基吡啶：叔丁基二甲硅基三氟甲磺酸酯的摩尔比＝1：3-5：1.5-2，优选为1：3：1.5。

优选地，所述步骤(2)中，冰水浴冷却下加入2,6-二甲基吡啶和叔丁基二甲硅基三氟甲磺酸酯，20～30min后升到室温搅拌反应3～4h，更优选为30min后升到室温搅拌反应4h。

优选地，所述步骤(2)中，所述稀盐酸为1M稀盐酸。

优选地，所述步骤(2)中，所述石油醚和乙酸乙酯的混合液中石油醚：乙酸乙酯的体积比＝8：1。

作为一种实施方式，所述步骤(3)中，化合物5：氢化钠：碘甲烷的摩尔比＝1：3-5：1.5-2，优选为1：5：1.5。

优选地，所述步骤(3)中，所述萃取使用的溶剂为乙酸乙酯。

优选地，所述步骤(3)中，所述石油醚和乙酸乙酯的混合液中石油醚：乙酸乙酯的体积比＝10：1。

作为一种实施方式，所述步骤(4)中，化合物6：氢氧化钠：化合物7：HATU：二异丙乙基胺的摩尔比＝1：10-15：1.1-1.5：2-3：4-6，优选为1：10：1.2：3：6。

优选地，所述步骤(4)中，冰水浴冷却下加入氢氧化钠固体，20～30min升到室温搅拌反应2～3h，更优选为30min升到室温搅拌反应2h。

优选地，所述步骤(4)中，所述四氢呋喃/水混合溶剂中四氢呋喃：水的体积比＝1:1。

优选地，所述步骤(4)中，所述石油醚和乙酸乙酯的混合液中石油醚：乙酸乙酯的体积比＝8：1。

作为一种实施方式，所述步骤(5)中，化合物8：三苯基膦：化合物9：HATU：二异丙乙基胺的摩尔比＝1：10-15：1.1-1.5：2-3：4-6，优选为1：10：1.2：3：6；

优选地，所述步骤(5)中，所述四氢呋喃/水混合溶剂中四氢呋喃：水的体积比＝20:1。

优选地，所述步骤(5)中，所述石油醚和乙酸乙酯混合液中石油醚：乙酸乙酯的体积比＝4：1。

作为一种实施方式，所述步骤(6)中，化合物10：氟化铵：氢氧化钠：醋酸酐：三氟乙酸：甲醛：氰基硼氢化钠的摩尔比＝1：50-100：10-15：20-50：20-30：10-20：10-20，优选为1：100：10：30：20：20：20。

优选地，所述步骤(6)中，所述四氢呋喃/水混合溶剂中四氢呋喃：水的体积比＝1:1。

优选地，所述步骤(6)中，所述乙腈和甲醇的混合溶剂中乙腈：甲醇的体积比＝1:1。

优选地，所述步骤(6)中，所述甲醛水溶液的质量分数为37％。

优选地，所述步骤(6)中，所述硅胶柱层析分离纯化中采用的流动相为甲醇：二氯甲烷的体积比＝1：10的混合液。

作为一种实施方式，所述步骤S1中，化合物2采用如下的合成路线：

包括如下步骤：

步骤11，将起始原料L-缬氨醇2-1溶于四氢呋喃/水混合溶剂，加入碳酸氢钠固体和氯甲酸苄酯，于室温下反应过夜，得到化合物2-2；

步骤12，将步骤1得到的化合物2-2溶于乙腈中，加入2-碘酰基苯甲酸，加热回流反应，得到中间体醛2-3；

将所述中间体醛2-3溶于二氯甲烷中，加入Wittig试剂2-4和四甲基胍，加热回流反应，得到化合物2-5；

步骤13，将所述化合物2-5溶于四氢呋喃/水混合溶剂，加入氢氧化钠固体，加热回流反应，得到化合物2-6；

以化合物2-6为反应底物，加入偶联试剂和三苯基膦，与化合物2-7反应，制备得到噻唑啉中间产物，再加入氧化试剂，一锅法合成化合物2-8；

步骤14，将所述化合物2-8溶于四氢呋喃，加入浓盐酸，于室温下反应，得到化合物2-9；

步骤15，在惰性气体保护下，将所述化合物2-9溶于无水四氢呋喃中，在冰水浴冷却下加入(S)-Me-CBS和硼烷二甲硫醚络合物，升到室温反应，即得到化合物2。

作为一种实施方式，所述步骤11中，L-缬氨醇2-1：碳酸氢钠：氯甲酸苄酯的摩尔比为1：3-5：1-1.02，优选为1：3：1。

优选地，所述步骤11的反应时间为10-15h，更优选为12h，反应完后减压浓缩，用乙酸乙酯萃取，合并有机相后用饱和食盐水洗涤，分液收集有机相，然后向有机相中加入无水硫酸钠干燥，过滤浓缩抽干，得到化合物2-2。

优选地，所述步骤12中，化合物2-2：2-碘酰基苯甲酸：Wittig试剂2-4的摩尔比为1：2-3：1.2-1.5，优选为1：2：1.5。

本发明和现有技术相比具有如下的有益效果：

1.本发明的制备方法采用了创新性的路线，优化了活性多肽Tubulysin M的全合成过程，总产率较高，立体选择性好。

2.本发明采用的合成路线利用可再生性资源，可回收、所用试剂毒性较小、反应经处理后对环境污染很小，符合绿色化学标准。

3.本发明的制备方法的实验操作方便、反应条件温和、分离纯化简单、可用于大量制备，便于实现产业化。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面对本发明实施例的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于所描述的本发明的实施例，本领域普通技术人员在无需创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明中HATU：2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯；DIPEA：二异丙乙基胺；DCM：二氯甲烷；TBSOTf：叔丁基二甲硅基三氟甲磺酸酯。其他使用的化学试剂的英文缩写均为本领域常规的含义进行理解。

实施例

本发明提供一种高效抗肿瘤活性多肽Tubulysin M的制备方法，所述制备方法包括：

步骤S1，提供化合物2；

步骤S2，以化合物2作为关键原料制备活性多肽Tubulysin M；

其中：

步骤S1提供化合物2的具体方法可以按照中国专利申请202010336478.7中记载的制备方法，当然也可以采用其他方式获得所述化合物2。

步骤S2具体采用如下的合成路线：

上述反应式中的化合物3、化合物7和化合物9的化学式如下：

(1)化合物4的制备

将化合物2(4.0g,10.2mmol)溶于三氟乙酸(100mL)中，加热回流反应3h，减压浓缩，真空干燥后得到中间体。

将上述中间体溶于无水二氯甲烷(200mL)，加入化合物3(1.72g,11mmol)，HATU(7.6g,20mmol)，搅拌均匀后滴加二异丙乙基胺(6.6mL,40mmol)，于室温下搅拌反应过夜，加水(400mL)淬灭反应，二氯甲烷(300mL)萃取三次，合并有机相用200mL水洗涤，200mL饱和食盐水洗涤，分液，有机相加无水硫酸钠干燥，减压浓缩，得到粗品，用石油醚：乙酸乙酯＝4：1为洗脱液快速柱层析分离得到3.3g油状的化合物4，两步总产率82％。

合成的化合物4，经¹HNMR,¹³CNMR,HRMS检测，其产品为纯的化合物，其各性能指标或表征数据如下：[α]_D ²⁵+5.8(c0.85,CHCl₃)；¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ8.14(s,1H),6.58(d,J＝9.2Hz,1H),4.88(dd,J＝11.2,2.4Hz,1H),4.01(m,2H),3.93(s,3H),2.23–2.12(m,2H),1.90–1.76(m,2H),1.47–1.39(m,1H),1.35–1.27(m,1H),1.08(d,J＝7.0Hz,3H),0.99–0.91(m,9H)；¹³CNMR(101MHz,CDCl₃)δ176.38,170.75,161.96,146.45,127.64,69.62,68.74,52.35,51.58,41.13,38.49,31.87,24.21,19.61,18.26,15.96,11.60；HR-ESIMSm/z:理论计算C₁₇H₂₇N₅O₄SNa⁺[M+Na]⁺:420.1784,实际检测为420.1789。

化合物3的制备方法参考文献：Organic Letters,2001,3(5):781-783。

(2)化合物5的制备

将化合物4(3.3g，8.36mmol)溶于干燥的二氯甲烷(200mL)，在冰水浴冷却下加入2,6-二甲基吡啶(3.0mL，25.8mmol)和叔丁基二甲硅基三氟甲磺酸酯(2.9mL，12.5mmol)，30min后升到室温搅拌反应4h，加水(200mL)淬灭反应，二氯甲烷(300mL)萃取三次，合并有机相用1M稀盐酸(200mL)洗涤，饱和食盐水(200mL)洗涤，分液，有机相加无水硫酸钠干燥，减压浓缩，得到粗品，用石油醚：乙酸乙酯＝8：1为洗脱液快速柱层析分离得到3.86g油状的化合物5，产率90％。

合成的化合物5，经¹HNMR,¹³CNMR,HRMS检测，其产品为纯的化合物，其各性能指标或表征数据如下：[α]_D ²⁵+10.4(c1.2,CHCl₃)；¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ8.12(s,1H),6.65(d,J＝8.6Hz,1H),5.09(dd,J＝6.6,5.2Hz,1H),4.02(d,J＝13.2Hz,1H),3.94(s,3H),3.85(d,J＝4.4Hz,1H),2.11(dd,J＝9.3,6.8Hz,1H),1.95–1.87(m,3H),1.49–1.41(m,1H),1.29(m,1H),1.04(d,J＝6.9Hz,3H),0.94(s,9H),0.91–0.80(m,9H),0.12(s,3H),-0.05(s,3H)；¹³CNMR(101MHz,CDCl₃)δ178.32,168.53,161.79,146.28,127.49,70.39,69.96,52.41,51.07,40.11,38.26,31.63,25.67,24.22,18.30,17.96,17.24,15.95,11.48,-4.74,-5.17；HR-ESIMSm/z:理论计算C₂₃H₄₁N₅O₄SSiNa⁺[M+Na]⁺:534.2649,实际检测为534.2653。

(3)化合物6的制备

将化合物5(3.0g,5.86mmol)溶于无水DMF(200mL)，冰水浴冷却下加入60％氢化钠固体(0.6g,15mmol)，30min后加入碘甲烷(0.62mL,10mmol)，缓慢升到室温搅拌反应2h，冰水浴冷却，加饱和氯化铵水溶液(500mL)淬灭反应，乙酸乙酯(300mL)萃取三次，合并有机相用水(200mL)洗涤，饱和食盐水(200mL)洗涤，分液，有机相加无水硫酸钠干燥，减压浓缩，得到粗品，用石油醚：乙酸乙酯＝10：1为洗脱液快速柱层析分离得到2.77g油状的化合物6，产率90％。

合成的化合物6，经¹HNMR,¹³CNMR,HRMS检测，其产品为纯的化合物，其各性能指标或表征数据如下：[α]_D ²⁵+24.0(c0.51,MeOH)；¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ8.12(s,1H),4.93(dd,J＝6.6,3.7Hz,1H),4.49(s,1H),3.94(s,3H),3.53(d,J＝9.5Hz,1H),2.95(s,3H),2.23–2.15(m,1H),2.11–2.03(m,2H),1.82–1.77(m,1H),1.23(d,J＝3.4Hz,2H),1.01(d,J＝6.5Hz,3H),0.94–0.83(m,18H),0.20–0.07(m,6H)；¹³C NMR(101MHz,CDCl₃)δ179.14,170.71,162.96,147.40,128.58,90.29,72.12,65.16,53.34,41.58,36.10,31.47,26.16,21.21,20.24,19.11,17.11,11.75,-3.55,-3.73；HR-ESIMSm/z:理论计算C₂₄H₄₃N₅O₄SSi⁺[M+H]⁺:526.2805,实际检测为525.2887。

(4)化合物8的制备

将化合物6(2.77g,5.27mmol)溶于四氢呋喃/水混合溶剂(1:1，300mL)，冰水浴冷却下加入氢氧化钠固体(2.4g,60mmol)，30min后升到室温搅拌反应2h，冰水浴冷却，加稀盐酸酸化至溶液的PH＝2，乙酸乙酯(200mL)萃取三次，合并有机相用水(200mL)洗，饱和食盐水(200mL)洗涤，分液，有机相加无水硫酸钠干燥，减压浓缩，得到中间体酸。

将上述中间体酸溶于无水二氯甲烷(200mL)，加入化合物7(1.55g，6mmol)，HATU(5.7g,15mmol)，搅拌均匀后滴加二异丙乙基胺(5.0mL,30mmol)，于室温下搅拌反应过夜，加水(200mL)淬灭反应，二氯甲烷(200mL)萃取三次，合并有机相用水(200mL)洗，饱和食盐水(200mL)洗涤，分液，有机相加无水硫酸钠干燥，减压浓缩，得到粗品，用石油醚:乙酸乙酯＝8:1为洗脱液快速柱层析分离得到2.83g油状的化合物8，两步总产率75％。

合成的化合物8，经¹HNMR,¹³CNMR,HRMS检测，其产品为纯的化合物，其各性能指标或表征数据如下：[α]_D ²⁵+19.8(c0.90,CHCl₃)；¹H NMR(400MHz,CDCl₃)(exists asrotamers)δ7.97(d,J＝5.7Hz,1H),7.29–7.17(m,5H),5.25(d,J＝3.9Hz,1H),4.80(dd,J＝6.7,3.9Hz,1H),4.42(d,J＝38.8Hz,1H),3.61(t,J＝7.3Hz,3H),3.54–3.35(m,1H),3.11–2.86(m,2H),2.92–2.80(m,3H),2.63(dd,J＝11.8,4.8Hz,1H),2.15–1.98(m,3H),1.88–1.68(m,3H),1.62(ddd,J＝14.2,9.8,4.5Hz,1H),1.35–1.20(m,2H),1.15(dd,J＝10.1,7.2Hz,3H),1.01(dt,J＝6.4,4.6Hz,3H),1.02–0.79(m,18H),0.22–0.09(m,6H)；¹³C NMR(101MHz,CDCl₃)(exists as rotamers)δ176.94,176.48,176.43,169.59,169.48,160.92,160.78,150.55,149.72,138.66,137.69,129.48,129.35,128.30,128.08,126.39,126.01,122.78,72.06,70.85,64.03,63.12,61.24,57.70,51.64,51.51,48.94,48.56,41.53,41.06,40.76,39.27,38.57,38.11,37.68,36.51,36.47,35.38,35.09,30.43,25.77,25.72,25.68,25.15,20.52,20.09,19.34,18.22,17.71,16.18,15.69,10.69,10.62,-4.60,-4.86,-4.93,-4.99；HR-ESIMSm/z:理论计算C₃₆H₅₈N₆O₅SSiNa⁺[M+Na]⁺:737.3959,实际检测为737.3963。

其中，化合物7的制备方法可以参照专利申请202010393017.3。

(5)化合物10的制备

将化合物8(2.83g,3.96mmol)溶于四氢呋喃/水混合溶剂(20:1，105mL)，加入三苯基膦(10.5g,40mmol)，加热回流反应4h，减压浓缩，再用甲苯带水三次，真空干燥得到中间体胺。

将上述中间体胺溶于无水二氯甲烷(200mL)，加入N-Boc-D-哌啶-2-羧酸-化合物9(0.92g,4mmol)，HATU(5.7g,15mmol)，搅拌均匀后滴加二异丙乙基胺(5.0mL,30mmol)，于室温下搅拌反应过夜，加水(200mL)淬灭反应，二氯甲烷(200mL)萃取三次，合并有机相用水(200mL)洗，饱和食盐水(200mL)洗涤，分液，有机相加无水硫酸钠干燥，减压浓缩，得到粗品，用石油醚：乙酸乙酯＝4：1为洗脱液快速柱层析分离得到2.50g油状的化合物10，两步总产率70％。

合成的化合物10，经¹HNMR,¹³CNMR,HRMS检测，其产品为纯的化合物，其各性能指标或表征数据如下：[α]_D ²⁵+10.5(c0.68,CHCl₃)；¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ7.99(s,1H),7.30–7.19(m,5H),7.01(d,J＝9.0Hz,1H),6.65(s,1H),4.92–4.65(m,3H),4.50(s,1H),4.39(dd,J＝9.6,5.5Hz,1H),4.06(d,J＝68.6Hz,1H),3.62(s,3H),3.62–3.43(m,1H),2.97(s,3H),2.91(d,J＝6.2Hz,2H),2.74(s,1H),2.60(dd,J＝12.8,8.0Hz,1H),2.31(d,J＝13.3Hz,1H),2.11–1.97(m,4H),1.80-1.75(m,1H),1.72-1.67(m,1H),1.57(m,4H),1.47(s,9H),1.37-1.26(m,2H),1.17(d,J＝7.1Hz,3H),1.00(d,J＝6.5Hz,3H),0.92(d,J＝9.3Hz,12H),0.87–0.77(m,6H),0.18(s,3H),-0.08(s,3H)；¹³C NMR(101MHz,CDCl₃)δ176.63,176.37,172.98,170.83,160.64,149.54,137.40,129.46,128.31,126.47,122.81,80.43,70.83,57.20,53.51,51.65,48.31,40.94,40.78,37.93,37.27,36.47,30.12,28.28,25.75,24.24,20.52,20.04,19.42,17.97,17.76,15.76,11.02,-4.66,-4.91；HR-ESIMSm/z:理论检测C₄₇H₇₇N₅O₈SSiNa⁺[M+Na]⁺:922.5262,实际检测为922.5267。

(6)终产物活性多肽Tubulysin M(化合物1)的制备

将化合物10(2.50g,2.78mmol)溶于甲醇(150mL)，加入氟化铵固体(5.6g,150mmol)，加热回流反应过夜，减压浓缩，加水(200mL)稀释，乙酸乙酯(200mL)萃取三次，合并有机相用饱和食盐水(200mL)洗涤，分液，有机相加无水硫酸钠干燥，减压浓缩，得到第一中间体；

将上述中间体溶于四氢呋喃/水混合溶剂(1:1，200mL)，加入氢氧化钠固体(1.6g,40mmol)，然后加热回流反应10h，冰水浴冷却，加稀盐酸酸化至溶液的pH＝2，乙酸乙酯(200mL)萃取三次，合并有机相用水(200mL)洗，饱和食盐水(200mL)洗涤，分液，有机相加无水硫酸钠干燥，减压浓缩，得到第二中间体；

将上述中间体溶于吡啶(50mL)，加入醋酸酐(15mL)，于室温下搅拌反应20h，加水(400mL)淬灭反应，冰水浴冷却，再加浓盐酸酸化至溶液的pH＝2，乙酸乙酯(250mL)萃取三次，合并有机相用水(200mL)洗，饱和食盐水(200mL)洗涤，分液，有机相加无水硫酸钠干燥，减压浓缩，得到第三中间体；

将上述中间体溶于二氯甲烷(50mL)，加入三氟乙酸(10mL)，于室温下搅拌反应4h，减压浓缩，真空干燥得到第四中间体；

将上述中间体溶于乙腈和甲醇的混合溶剂(1:1，100mL)，加入质量分数37％的甲醛水溶液(5.0mL)，于室温下搅拌反应0.5h，加入氰基硼氢化钠(3.15g,50mmol)，再搅拌反应0.5h后，滴加冰醋酸至溶液的pH＝5，然后于室温下搅拌反应过夜，减压浓缩，首先用硅胶柱层析分离纯化(流动相是甲醇：二氯甲烷1：10)，最后用异丙醚打浆纯化得到1.83g终产物1，五步总产率78％。

合成的化合物1，经¹HNMR,¹³CNMR,HRMS检测，其产品为纯的化合物，其各性能指标或表征数据如下：[α]_D ²⁵-14.4(c0.26,MeOH)；¹H NMR(400MHz,MeOD)δ8.05(s,1H),7.19(t,J＝4.1Hz,4H),7.12(dd,J＝8.5,4.2Hz,1H),5.67(dd,J＝10.7,2.7Hz,1H),4.68(d,J＝7.9Hz,1H),4.32(d,J＝6.0Hz,2H),3.28–3.27(m,1H),3.13(d,J＝12.0Hz,1H),3.07(d,J＝5.0Hz,3H),2.88(d,J＝6.9Hz,2H),2.48(dd,J＝20.5,11.9Hz,2H),2.39(s,3H),2.36–2.18(m,2H),2.11(s,3H),2.01–1.94(m,1H),1.89–1.52(m,9H),1.45–1.36(m,1H),1.12(d,J＝7.1Hz,3H),0.97(dd,J＝15.2,6.6Hz,6H),0.87(d,J＝7.5Hz,3H),0.78(d,J＝6.6Hz,3H)；¹³C NMR(101MHz,MeOD)δ180.23,174.57,171.91,171.70,170.10,163.01,150.29,139.38,130.38,129.23,127.33,125.96,71.23,68.31,56.23,55.82,50.97,43.09,30.87,30.27,25.28,24.20,22.95,22.43,20.81,20.44,20.23,19.12,16.18,11.19；HR-ESIMSm/z:理论计算C₃₈H₅₇N₅O₇S⁺[M+H]⁺:728.3979，实际检测为728.3983。

虽然本发明所揭露的实施方式如上，但所述的内容仅为便于理解本发明而采用的实施方式，并非用以限定本发明。任何本发明所属领域内的技术人员，在不脱离本发明所揭露的精神和范围的前提下，可以在实施的形式及细节上进行任何的修改与变化，但本发明的专利保护范围，仍须以所附的权利要求书所界定的范围为准。