具体实施方式

为了更好的理解本发明的实质，下面以本发明的实施例及试验例组成的药物组合物的药理作用结果来说明本发明的优异性，但不以此来限制本发明。

实施例1：药物组合物的制备

方法1：分别取斑蝥酸钠5μM、10μM、15μM，并添加药学上常用的辅料或辅助性成分，按常规方法制备成注射液、粉针、片剂、胶囊剂、颗粒剂。

方法2：取斑蝥酸钠15μM，吉西他滨0.1μM，混合均匀，并添加药学上常用的辅料或辅助性成分，按常规方法制备成注射液、粉针、片剂、胶囊剂、颗粒剂。

方法3：取斑蝥酸钠10μM，吉西他滨5μM，混合均匀，并添加药学上常用的辅料或辅助性成分，按常规方法制备成注射液、粉针、片剂、胶囊剂、颗粒剂。

方法4：取斑蝥酸钠5μM，吉西他滨10μM，混合均匀，并添加药学上常用的辅料或辅助性成分，按常规方法制备成注射液、粉针、片剂、胶囊剂、颗粒剂。

本发明人在研究中发现，斑蝥酸钠具有抗胰腺癌作用，且该药与吉西他滨联用可以发挥抗胰腺癌的协同作用。

以下是本发明涉及的药物组合物的药效试验例，试验过程如下：

试验例1：斑蝥酸钠及斑蝥酸钠联合吉西他滨在体外和体内的抗胰腺癌试验

1.1试验材料

1.1.1试验药物

斑蝥酸钠，由贵州柏强制药有限公司提供。

1.1.2试验试剂

吉西他滨(Gemcitabine)(Sigma，St.Louis，MO，USA)；胎牛血清(Fetal BovineSerum，FBS)(GIBCO，Invitrogen Corporation，NY，USA)；DMEM培养基或RPMI-1640培养基或MEM培养基(GIBCO，Invitrogen Corporation，NY，USA)；青霉素(Sigma，St.Louis，MO，USA)；链霉素(Sigma，St.Louis，MO，USA)；胰蛋白酶(Gibco，Grand Island，NY，USA)；MTT试剂，碧云天生物技术研究所。

1.1.3试验仪器

FORMA 700型超低温冰箱，Thermo公司；YC-300L型药品储存柜，中科美菱低温科技有限责任公司；Direct-Q with pump型超纯水仪，Millopore公司；SW-CJ-2FD型超净化工作台：3K15型低温高速离心机，Sigma公司；Forma 3111型水套式CO₂培养箱：Thermo Electroncompany；YXO-LS-50SII型立式压力蒸汽灭菌器：上海博讯实业医疗设备厂；BS224型电子天平：北京赛多利斯仪器系统有限公司；Berthold LB941微孔板式多功能酶标仪，Berthold公司。

1.1.4试验细胞株

PANC-1cell line购自American Tissue Culture Collection(ATCC，Rockville，MD，USA)。

1.1.5试验动物

来源、种系、品系：BALB/c nude小鼠，购自南京大学，合格证号SCXK(苏)2015-0001。日龄：28-56天，体重16-19g，性别：雄性。

1.2试验方法

1.2.1试验分组情况及药物浓度选择

细胞实验：化合物斑蝥酸钠浓度选择：0μM，2μM，5μM，10μM，20μM，40μM，80μM。

动物实验：阴性对照组(对照组control)6只，腹腔给予PBS(1×)；阳性药组(Gemcitabine)6只，腹腔给予吉西他滨；实验组(斑蝥酸钠)：6只，腹腔给予化合物斑蝥酸钠；联合用药组(combined)：6只，腹腔给予化合物斑蝥酸钠及吉西他滨。

表1：试验分组及用药

1.2.2细胞培养条件

细胞传代培养10-15代，培养条件为含有青霉素(终浓度为100U/mL)、链霉素(终浓度为100μg/mL)、10％FBS的DMEM培养基，当细胞融合至90％时，弃去旧培养基，用2mlPBS洗涤细胞2次，弃去PBS后加入2ml的0.25％(w/v)Trypsin-0.53mM EDTA混合消化液，置显微镜下观察，约30s，当细胞变圆后迅速加入2ml完全培养基终止消化，轻轻吹打，收集细胞。800rpm，4℃，离心5min，弃去上清，用完全培养基重悬细胞，分瓶培养，隔天换液。

1.2.3细胞MTT试验

将对数生长期细胞以1×10⁴cells孔接种于96孔板，置于37℃、5％CO₂条件下培养，直至细胞融合90％后，用无血清的DMEM培养基孵育2h使细胞同步化。随后，弃去上清，分别加入浓度为(0μM，2μM，5μM，10μM，20μM，40μM，80μM)的斑蝥酸钠完全培养基孵育72h。孵育结束前4h，每孔加入20μL MTT溶液(5mg/mL)。孵育结束后，弃去各孔上清液，每孔加入150μLDMSO，细胞振荡仪上振荡10min，待结晶物充分溶解后用酶标仪测定OD₅₇₀。

按同样的方法，进行吉西他滨(0μM，0.01μM，0.1μM，1μM，10μM，100μM，1000μM)和吉西他滨(0μM，0.1μM，1μM，10μM)联合斑蝥酸钠(0μM，5μM，10μM，15μM)用药的MTT实验。

抑制率＝(对照组OD值-实验组OD值)/对照组OD值×100％

1.2.4移植瘤模型的建立与药物治疗

PANC-1细胞传代培养10-12代，培养条件为含有青霉素(终浓度为100U/mL)、链霉素(终浓度为100μg/mL)、10％FBS的DMEM培养基，当细胞融合至90％时，弃去旧培养基，用5mlPBS洗涤细胞1次，弃去PBS后加入1ml胰蛋白酶-EDTA消化液，置显微镜下观察，约1min，当细胞变圆后迅速加入2ml完全培养基终止消化，轻轻吹打，收集细胞。500rpm，4℃，离心3min，弃去上清，用完全培养基重悬细胞，分培养皿培养，隔天换液。

选取健康的上述实验小鼠24只，饲养一周，待体重约为27g，每只小鼠右侧腋窝皮下注射0.2ml的细胞悬液，细胞浓度2×10⁶/tumor。小鼠移植瘤用游标卡尺测量移植瘤直径，待肿瘤生长至100mm³左右后，将动物随机分组记为第0天，然后开始按照分组方式中的给药方法给药21天。使用测量瘤径的方法，动态评估受试化合物的体内抗肿瘤活性。肿瘤直径的测量次数为每3天一次。给药体积各组不同。21天后，小鼠处死，手术剥取瘤块称重。肿瘤体积(Tumor volume，TV)的计算公式为：

TV＝0.52×a×b²

其中，a、b分别表示长宽。

1.2.5数据分析

得出数据后，GraphPad Prism 6拟合得出IC₅₀。

1.2.6

数据组间统计学差异采用one-way ANOVA检验，P值小于0.05认为有显著性差异。

1.3试验结果

表2：孵育72h后，吉西他滨和斑蝥酸钠对PANC-1细胞株的生长抑制作用((IC₅₀Values inμM)。

另外，不同浓度斑蝥酸钠和吉西他滨分别对PANC-1细胞生长的抑制情况分别如图1、图2所示。

从表2和图1、图2数据中可知，MTT试验中，斑蝥酸钠对PANC-1细胞的IC₅₀为13.24μM，吉西他滨对PANC-1细胞的IC₅₀为37.54μM，斑蝥酸钠对胰腺癌细胞的肿瘤抑制效果显著强于吉西他滨。

表3：MTT试验中，不同浓度斑蝥酸钠与吉西他滨混合孵育后对PANC-1细胞系的生长抑制作用。

从表3中可以得知，斑蝥酸钠与吉西他滨联合使用，有明显的协同增强对PANC-1细胞增殖的抑制作用。

为了检测斑蝥酸钠与吉西他滨的体内抗肿瘤联用效果，予荷瘤小鼠吉西他滨和斑蝥酸钠单独及混合处理，每3天检测肿瘤大小及荷瘤小鼠体重，试验结束时，分离肿瘤组织，进行拍照和称重。结果如图3-图6所示。(其中*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001，)表明吉西他滨和斑蝥酸钠单独使用都可以明显抑制肿瘤生长，两者联用比单独使用吉西他滨效果更好。

另外，本发明人对肿瘤组织还进行了H&E染色，结果如图7-图10所示。从图7-图10中可以看出，斑蝥酸钠和吉西他滨单独使用后，肿瘤组织中细胞数量均有明显减少，两者联用比吉西他滨单独使用效果更好。

试验例2：斑蝥酸钠在原代细胞中的抗胰腺癌活性试验

2.1试验材料

2.1.1试验药物

斑蝥酸钠，由贵州柏强制药有限公司提供。

2.1.2试验试剂

吉西他滨(Gemcitabine)(Sigma，St.Louis，MO，USA)；胎牛血清(Fetal BovineSerum，FBS)(GIBCO，Invitrogen Corporation，NY，USA)；RPMI-1640培养基(GIBCO，Invitrogen Corporation，NY，USA)；青霉素(Sigma，St.Louis，MO，USA)；链霉素(Sigma，St.Louis，MO，USA)；胰蛋白酶(Gibco，Grand Island，NY，USA)；MTT试剂，碧云天生物技术研究所。

2.1.3实验仪器

FORMA 700型超低温冰箱，Thermo公司；YC-300L型药品储存柜，中科美菱低温科技有限责任公司；Direct-Q with pump型超纯水仪，Millopore公司；SW-CJ-2FD型超净化工作台：3K15型低温高速离心机，Sigma公司；Forma 3111型水套式CO₂培养箱：Thermo Electroncompany；YXO-LS-50SII型立式压力蒸汽灭菌器：上海博讯实业医疗设备厂；BS224型电子天平：北京赛多利斯仪器系统有限公司；Berthold LB941微孔板式多功能酶标仪，Berthold公司。

2.1.4试验细胞株

Human primary pancreatic cancer cells(人源胰腺癌原代细胞)和Humanprimary paracancerous cells(人源胰腺癌的癌旁组织原代细胞)。

2.2试验方法

2.2.1试验分组情况及药物浓度选择

试验分组

化合物斑蝥酸钠浓度选择：0μM，1μM，5μM，10μM，50μM，100μM。

所有化合物处理细胞72h。

2.2.2人源胰腺癌原代细胞或人源胰腺癌的癌旁组织原代细胞分离

取人源胰腺癌组织和人源胰腺癌的癌旁组织，75％乙醇溶液消毒，无菌台内取癌组织或癌旁组织剪碎，加入0.125％胰蛋白酶与1％II型胶原酶混合液与37℃水浴振荡器中消化10min，用含10％胎牛血清(FBS)的RPMI 1640终止消化，吸取混合液。重复消化5次，收集消化液，然后用200目筛网过滤，滤液离心(800rpm，10min)，弃去上清液，加适量培养液悬浮沉淀，接种于25cm²培养瓶，置37℃、5％CO₂孵箱中培养。

培养条件为含有青霉素(终浓度为100U/mL)、链霉素(终浓度为100μg/mL)、10％FBS的RPMI-1640培养基，当细胞融合至90％时，弃去旧培养基，用2mlPBS洗涤细胞2次，弃去PBS后加入2ml的0.25％(w/v)Trypsin-0.53Mm EDTA混合消化液，置显微镜下观察，约30s，当细胞变圆后迅速加入2ml完全培养基终止消化，轻轻吹打，收集细胞。800rpm，4℃，离心5min，弃去上清，用完全培养基重悬细胞，分瓶培养，隔天换液。

2.2.3细胞MTT试验

将对数生长期细胞以1×10⁵cells孔接种于96孔板，置于37℃、5％CO₂条件下培养，直至细胞融合90％后，用无血清的RPMI-1640培养基孵育2h使细胞同步化。随后，弃去上清，按试验1.4.1和1.4.2分组所述方案加入化合物，孵育72h。孵育结束前4h，每孔加入20μLMTT溶液(5mg/mL)。孵育结束后，弃去各孔上清液，每孔加入150μL DMSO，细胞振荡仪上振荡10min，待结晶物充分溶解后用酶标仪测定OD₅₇₀。

抑制率＝(对照组OD值-实验组OD值)/对照组OD值×100％

2.2.4蛋白样品的收集

在按照实验1.4.3分组的处理条件下处理完细胞后，弃上清，用预冷PBS洗一遍，用细胞刮子刮下细胞，并用移液器吹打下细胞。离心收集细胞，吸尽上清，留下细胞沉淀备用。尽量避免用胰酶消化细胞，以免胰酶降解需抽提的目的蛋白。每20μL细胞沉淀加入200μL添加量PMSF的细胞浆蛋白抽提试剂A。最高速剧烈涡旋5s，把细胞沉淀完全悬浮并分散开。水浴10-15min，加入细胞浆蛋白抽提试剂B10μL。最高速剧烈涡旋5s，水浴1min。最高速剧烈涡旋5s，4℃12000-16000g离心5min。立即吸取上清至一预冷的Eppendorf管中，即为抽提得到的细胞浆蛋白，冬训与-80℃备用。对于沉淀，完全吸尽参与的上清，加入50μL添加了PMSF的细胞核蛋白抽提试剂。最高速剧烈涡旋15-30s，把细胞沉淀完全悬浮并分散开。然后放回冰浴中，每隔1-2min再高速剧烈涡旋15-30s，共30min，4℃12000-16000g离心10min。立即吸取上清至一预冷的Eppendorf管中，即为抽提得到的细胞核蛋白，混合细胞浆蛋白和核蛋白后样品制备完成，-20℃保存。

2.2.5RNA样品的收集

在按照试验1.4.3的处理条件下处理完细胞后，弃上清，加入0.5ml Trizol，反复吹打至澄清，并转移至EP管，静置5min，每管加入氯仿0.1ml(Trizol体积的1/5)，剧烈振摇，静置10min，12000rpm4℃离心15min，取上清(勿碰到中间层)，加等量异丙醇约200μL，剧烈振摇，-20℃静置30min，沉淀RNA，12000rpm4℃离心10min，弃上清。加入75％乙醇(DEPC水现配)1ml洗涤，7500rpm4℃离心5min，弃上清，自然干燥5-10min。用DEPC水10μL溶解RNA，吹打混匀，得到总RNA溶液，-20℃保存。

2.2.6数据分析

结果以mean±SD表示，之后根据抑制率通过GraphPad Prism 6拟合得出IC₅₀。

2.3试验结果

表4：斑蝥酸钠和吉西他滨处理细胞72h后，不同细胞株的生长抑制率(IC₅₀ValuesinμM)。

如表4所示，在MTT试验中考察了化合物吉西他滨或斑蝥酸钠孵育后对人源胰腺癌原代细胞和人源胰腺癌的癌旁组织原代细胞的抑制作用。结果发现斑蝥酸钠对人源胰腺癌原代细胞和人源胰腺癌的癌旁组织原代细胞的IC₅₀为20.63±2.26、85.47±5.32μM；阳性化合物吉西他滨对人源胰腺癌原代细胞和人源胰腺癌的癌旁组织原代细胞的IC₅₀为13.90±1.35、221.00±6.39，表明斑蝥酸钠具有抗胰腺癌的作用，且效果优于抗胰腺癌一线药物吉西他滨。

表5:斑蝥酸钠与吉西他滨联合使用时在不同比例条件下的IC₅₀和药物联用指数CI值。

如表5所示，在MTT试验中我们考察了化合物吉西他滨和斑蝥酸钠不同比例联合孵育后对人源胰腺癌原代细胞的抑制作用。结果发现化合物吉西他滨和斑蝥酸钠不同比例联合对人源胰腺癌原代细胞IC₅₀为15.28±1.04μM(2:1)、10.26±0.93μM(1:1)、8.52±0.51μM(1:2)。结果表明，当斑蝥酸钠和吉西他滨联合用药比例为1:2时，其CI值最小。表明斑蝥酸钠和吉西他滨比例为1:2联合用药效果最好。

综上所述，斑蝥酸钠能够有效治疗胰腺癌，且当斑蝥酸钠与吉西他滨联用时，抗胰腺癌效果显著强于单独使用吉西他滨或斑蝥酸钠。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。