阅读说明：本技术 未折叠蛋白反应的激活剂 (Activator of unfolded protein response ) 是由 D·J·夏皮罗 P·J·赫甘罗斯尔 M·W·布德罗 于 2019-07-01 设计创作，主要内容包括：一组杀死治疗抗性ERα阳性乳腺癌细胞、卵巢癌细胞和子宫内膜癌细胞的小分子ERα生物调节剂。由于与BHPI和其他常规治疗(内分泌治疗、三苯氧胺和氟维司群/ICI)相比,杀死治疗抗性乳腺癌细胞的能力增强,因此这些小分子具有增加的治疗潜力。新化合物不仅抑制癌细胞的增殖,而且实际杀死癌细胞,从而防止多年后肿瘤的再激活。(A panel of small molecule era bioregulators that kill therapy resistant era positive breast, ovarian and endometrial cancer cells. These small molecules have increased therapeutic potential due to their enhanced ability to kill therapy-resistant breast cancer cells compared to BHPI and other conventional therapies (endocrine therapy, tamoxifen, and fulvestrant/ICI). The novel compounds not only inhibit the proliferation of cancer cells, but actually kill cancer cells, thereby preventing tumor reactivation after many years.)

未折叠蛋白反应的激活剂

相关申请

本申请根据35U.S.C.§119(e)要求享有2018年7月3日提交的第62/693,641号美国临时专利申请的优先权，所述美国临时专利申请通过引用的方式纳入本文。

政府支持

本发明是在美国国立卫生研究院(National Institutes of Health)授予的授权号RO1DK071909的政府支持下完成的。美国政府对本发明具有一定权利。

背景技术

大约70％的乳腺癌为ERα阳性。这些肿瘤的内分泌(激素)治疗手段包括阻断雌激素产生的芳香化酶抑制剂、与雌激素竞争以与ERα结合的三苯氧胺(tamoxifen)以及与雌激素竞争并促进ERα降解的氟维司群(fulvestrant)/Faslodex/ICI 182，780。尽管起初是有效的，但抗性有时会在原发性肿瘤中发展，并且在转移性环境中几乎普遍存在。尽管抗性机制不同，但最近的研究表明，这些转移性肿瘤中约30％聚藏ERα突变，最常见的是ERαD538G和ERαY537S。有大量证据表明这些肿瘤表现出雌激素非依赖性增殖，因此对阻断雌激素产生的芳香化酶抑制剂具有抗性。它们还对三苯氧胺具有很大抗性，并且对氟维司群具有部分抗性。值得注意的是，与转移性肿瘤包含非突变野生型ERα的患者相比，转移性肿瘤包含ERαD538G突变的患者的存活时间短了6个月，转移性肿瘤具有ERαY537S突变的患者的存活时间短了12个月。因此，开发针对包含这些突变的乳腺癌细胞的化疗剂的努力是大量而广泛的。

ERα阳性乳腺癌的病理异常。尽管5年存活率令人印象深刻，但肿瘤通常在最初诊断后10-20年复发。这被认为是由于休眠的乳腺癌细胞的增殖的再激活所致。因此，特别重要的是实际杀死肿瘤细胞，而不允许它们保持休眠状态并易于再激活。当前的内分泌治疗具有细胞生长抑制作用，而不具有细胞毒性，因此不会杀死残留的乳腺癌细胞。这使细胞处于休眠状态，并在以后再激活。这些复发的肿瘤的治疗选择手段贫乏，并且大多数乳腺癌死亡是在ERα阳性肿瘤患者中。

卵巢癌通常表现为晚期。肿瘤在手术后经常复发。尽管30-70％的卵巢肿瘤为ERα阳性，并且ERα表达与预后不良(poor outcome)有关，但内分泌治疗是无效的，并且复发的肿瘤通常用基于铂的化疗和紫杉醇治疗。尽管最初是有反应的，但经过几个治疗周期后，肿瘤复发为具有抗性卵巢癌，且治疗选择手段贫乏。超过一半的卵巢癌患者在5年内死亡。在卵巢癌中，对紫杉醇和其他化疗剂具有抗性的一种非常常见的机制是多抗药性；ATP依赖性外排泵的超表达引起的能量依赖性药物外排，尤其是多抗药性蛋白1(MDR1)/P-糖蛋白/ABCB1。尽管付出了巨大的努力，但有效的无毒MDR1抑制剂仍难以找到。

尽管许多子宫内膜癌为ERα阳性，但内分泌治疗效果不佳。

因此，重要的治疗目标是鉴定新的具有细胞毒性而不仅仅具有细胞生长抑制作用的小分子，并开发相应的治疗方法。

发明内容

本公开提供具有改善的实际杀死治疗抗性乳腺癌细胞的能力的小分子的益处，所述小分子具有极大增加的治疗潜力。具体而言，为了防止复发，至关重要的是消灭正在生长的和休眠的治疗抗性乳腺癌细胞的整个种群。与BHPI相比，以及与内分泌治疗三苯氧胺和氟维司群/ICI相比，活性对映(-)C-105具有极大增强的杀死乳腺癌细胞的能力。因此，化合物(-)C-105显示出显著增加的治疗潜力(图4A-4C)。

本公开提供式I的化合物或其盐或溶剂化物：

其中

R¹、R²、R³和R⁴各自独立地为H、卤素、-OR^A、-SR^A、-N(R^A)₂、烷基、环烷基、杂环基、芳基或杂芳基；

A¹、A²、A³和A⁴各自独立地为H、卤素或烷基；

G¹为卤素、-OR^B、-SR^B、-S(＝O)₂R^B或烷基；

G²为卤素、-OR^C、-SR^C、-S(＝O)₂R^C或烷基；

X和Z各自独立地为O、S或-NR^D；和

R^A、R^B、R^C和R^D各自独立地为H或烷基，其中，当存在时，-OR^B和-OR^C不都为-OH；

其中每个烷基、环烷基、杂环基、芳基和杂芳基任选地被一个或多个取代基取代。

上述化合物可通过内质网中未折叠蛋白反应(UPR)的过度激活(hyperactivation)与α雌激素受体(ERα)结合并杀死或抑制癌细胞的生长。

此外，本公开提供一种治疗癌症的方法，所述方法包括向有需要的ERα阳性癌症受试者给予治疗有效量的上述化合物，从而治疗该受试者的癌症。

本发明提供新的式I-IV的化合物、用于合成式I-IV的化合物的中间体以及制备式I-IV的化合物的方法。本发明还提供用作合成其他有用化合物的中间体的式I-IV化合物。本发明提供式I-IV的化合物在制备用于治疗哺乳动物例如人类的癌症的药物中的用途。

本发明提供本文所述的组合物用于药物治疗的用途。所述药物治疗可以是治疗癌症，例如乳腺癌、卵巢癌、子宫癌、宫颈癌、子宫内膜癌、肺癌、胰腺癌、前列腺癌或结肠癌。本发明还提供本文所述的组合物用于制备治疗哺乳动物的疾病(例如人类的癌症)的药物的用途。所述药物可包括药学上可接受的稀释剂、赋形剂或载体。

附图说明

以下附图构成本说明书的一部分，并且被包括在内以进一步说明本发明的某些实施方案或各个方面。在一些情况下，通过参考附图并结合本文提供的详细说明可以充分地理解本发明的实施方案。说明书和附图可以突出本发明的某个特定实施例或某个方面。然而，本领域技术人员将理解，该实施例或方面的部分可与本发明的其他实施例或方面结合使用。

图1.(±)-105对ERα阳性和ERα阴性人类癌细胞作用的剂量反应研究。Alamarblue 24小时死亡试验来测定化合物105的IC₅₀。

图2.比较BHPI和(±)-105杀死ERα阳性T47D细胞的能力的剂量反应研究。化合物(±)-105有效地诱导乳腺癌细胞死亡。

图3.(±)-105杀死ERα阳性细胞的能力与其不能杀死ERα阴性细胞的能力的比较。

图4.(-)105有效且定量地杀死癌细胞。MCF7(ER+)细胞，24小时温育，通过AlamarBlue荧光读取，死亡对照：Raptinal，n＝3(A、B)。当口服给予时(-)-105有效(C)。视轴矫正的(orthoptic)小鼠异种移植乳腺癌TYS细胞，通过生物发光成像可视化。治疗：每日40mg/kg(-)-105，连续3天，通过经口喂食(oral gavage)或腹腔注射。

图5.显示出单个对映体的拆分的(±)-105的手性分离。

图6.显示出可分辨峰的(±)-105手性HPLC示踪。

图7.分离的对映体的(-)-105手性HPLC示踪。

图8.其他分离的对映体的(+)-105手性HPLC示踪。

图9.在T47D细胞系中，105的(-)对映体是活性的，而(+)对映体是非活性的。

图10.(-)-105诱导MCF-7细胞的剂量依赖性死亡；(+)-105是非活性的。

图11.剂量反应研究表明(-)-105在杀死T47D细胞方面优于BHPI。

图12.剂量反应研究表明(-)-105在杀死MCF-7和TYS细胞方面优于BHPI。

图13.剂量反应研究表明(-)-105在杀死TDG-Luc细胞方面优于BHPI和当前的内分泌治疗。

图14.剂量反应研究来测定通过(-)-105杀死癌细胞的IC₅₀。

图15.在长期实验中，(-)-105而非BHPI杀死100％的TYS-Luc细胞。

图16.在模拟治疗的长期实验中，(-)-105而非BHPI根除致死性治疗抗性乳腺癌细胞。

图17.使用萤光素酶的生物发光成像(BLI)表明几乎根除了小鼠中的治疗抗性TYS-luc乳腺肿瘤。

图18.(-)-105杀死对BHPI杀死具有抗性的乳腺癌细胞。

图19.(-)-105有效地激活UPR，如诱导剪接的XBP-1mRNA所示。

图20.(-)-105在治疗抗性Caov-3 ERα阳性卵巢癌细胞中抑制蛋白质合成方面优于BHPI。

图21.通过使用2-APB阻断钙从内质网的流出，抑制(-)-105诱导的癌细胞死亡。

图22.-105降低细胞内ATP水平；通过用毒胡萝卜素灭活内质网SERCA泵来阻断该ATP水平的降低。

图23.通过用毒胡萝卜素阻断ATP水平下降，抑制-105诱导的细胞死亡。

图24.测试化合物和BHPI杀死TDG细胞的能力的比较。

图25.测试化合物和BHPI杀死TYS细胞的能力的比较。

图26.测试化合物4、6、105和BHPI杀死TYS细胞的能力的比较。

图27.测试化合物和BHPI杀死T47D细胞的能力的比较。

图28.测试化合物和BHPI均未杀死ERα阴性非致瘤MCF-10A乳腺细胞。

图29.测试化合物和BHPI杀死T47D细胞的能力的评估。

图30.比较BHPI和测试化合物抑制T47D、TYS和TDG细胞增殖的能力的剂量反应研究。

图31.(-)105对ER+癌细胞(包括对致死性ER+突变体)具有高度选择性。

图32.(-)105具有与BHPI相同的作用机制(MOA)。

图33.105而非BHPI杀死治疗抗性卵巢CaOV-3卵巢癌细胞。(±)-105；细胞死亡试验：自动台盼蓝排除法。((±)-105后24小时)

图34.(-)105几乎根除ER+抗药性肿瘤。原位乳腺癌模型，TYS-Luc细胞，40mg/kg(-)-105腹腔注射，每日。注射后7天图像比注射前图像在更高的增益下曝光时间更长。

图35.在模拟癌症治疗的长期实验中，额外的PPT载玻片(-)-105优于BHPI。细胞：T47D-荧光素酶。

图36.SERK-F6(也称为C(-)-105、(-)-105、(R)-105、(-)-1或(R)-1)的发现，一种杀死ERα阳性癌细胞的化合物。a，BHPI和外消旋化合物1(即(±)-1)的化学结构，以及其在以nM所示的浓度下温育24小时后对T47D乳腺癌细胞的细胞毒性活性。通过流式细胞术分析之前，将细胞用膜联蛋白V-FITC和PI染料染色。误差线代表3个独立重复的S.E.M。b，SERK-F6对ERα阳性细胞系MCF-7具有细胞毒性，但对ERα阴性细胞系MDA-MB-231具有极小的效果。将细胞与SERK-F6或阳性对照Raptinal温育24小时，然后用膜联蛋白V-FITC和PI染料染色，并通过流式细胞术进行分析。误差线代表3个独立重复的S.E.M。c，进行24小时温育后，SERK-F6对一组按其报告的ERα状态分组的癌细胞系的IC₅₀值。通过Alamar blue荧光测量细胞活性，并相对于载体对照和用Raptinal处理的定量死亡对照进行设置。误差线代表3个独立实验的S.E.M。d，在所示化合物和浓度下温育24小时后，T47D细胞的结晶紫染色。图像代表2个独立实验。e、f，T47D、TDG和TYS细胞的长期细胞培养实验。将细胞与化合物(1μM)温育2周，然后洗出化合物，并将细胞培养2个月。细胞数通过MTS测定。

图37.SERK-F6是导致ERα阳性细胞根除的活性物质。a，在24小时的化合物温育后，通过一组ERα阳性细胞系的台盼蓝排除试验。b，用1μM BHPI或SERK-F6温育的MCF-7、MDG和MYS细胞的长期细胞培养实验。

图38.SERK-F6激活预期的UPR。a，由于指定时间后的化合物处理的结果，T47D细胞中sp-XBP1 mRNA的诱导。将BHPI和SERK-F6在1μM下给药。mRNA水平通过RT-PCR来定量。误差线代表6个生物学重复的S.E.M。b，细胞内ATP消耗(此处需要详细信息)，此处还需要T47D数据。c，SERK-F6处理(1μM)导致T47D细胞中快速的蛋白质合成抑制。

图39.SERK-F6通过aUPR的过渡激活根除野生型ERα肿瘤。a，在Nu/J切除卵巢的小鼠中建立MCF-7原位肿瘤，补充60天E2沉淀(pellet)(0.36mg)并生长至～400mm³(建立28天)，随机化，然后用以下方式处理：每日载体(n＝3)，每周载体(n＝3)，每周氟维司群(5mg/小鼠，皮下注射，n＝6)，每日SERK-F6(10或40mg/kg口服)。载体臂是平均的。p值：＊：p≤0.05，＊＊：p≤0.01，＊＊＊：p≤0.001，＊＊＊＊：p≤0.0001。肿瘤图像在研究结束时(第21天)拍摄，并代表所有肿瘤(n＝6)。b-e，在每日用载体或SERK-F6(40mg/kg口服)处理之前，将MCF-7细胞原位双侧移植，并使肿瘤生长直至总肿瘤负荷为～400mm³。3天(b、c)和7天(d、e)后处死小鼠(n＝5/臂)并收获肿瘤。肿瘤负荷显示为两种肿瘤的总和(b、d)。c、e，aUPR标记、P-PERK和P-EIF2α以及ERα的蛋白质印记分析。纽带蛋白(Vin)用作加样对照。显示的蛋白质印迹代表4个技术重复。在显示的所有实验进程过程中均存在E2沉淀。误差线代表S.E.M。

图40.耐受SERK-F6，其达到生物学相关浓度，并在体内穿过血脑屏障。a，指定剂量、给药途径和时间后血清SERK-F6的浓度。通过LC/MS/MS分析测定浓度。SERK-F6的平均24小时IC₅₀为42nM。b，计算的SERK-F6的药物代谢动力学参数。AUC：曲线下面积，C_max：最大浓度，t_1/2：半衰期。c、d，用指定剂量和时间处理小鼠(CD-1)，然后处死并收集其血清和脑。通过LC/MS/MS分析测定浓度。每只小鼠的平均血液约为58.5mL/kg。f-j，SERK-F6治疗携带原位MCF-7肿瘤的小鼠。f，比较第0天和第21天肿瘤测量值的肿瘤变化百分比。治疗臂：每日载体(n＝3)，每周载体(n＝3)，每周氟维司群(5mg/小鼠，皮下注射，n＝6)，每日SERK-F6(10或40mg/kg口服)。将载体臂合并。g，从小鼠收获的肿瘤质量。i，在该MCF-7研究期间观察到的小鼠体重(n＝6)。i、j，MCF-7双侧原位模型的肿瘤测量值(n＝4-5)。

图41.SERK-F6根除突变ERα原发性和转移性乳腺癌。a-c，在NSG切除卵巢的小鼠中建立TYS-luc.原位肿瘤(无E2沉淀，建立60天)，并按指示每日给药(n＝5-6)。b，SERK-F6处理的小鼠(7天)的生物发光图像的代表性实例。d、e，在NSG切除卵巢的小鼠中建立TDG-luc.原位肿瘤(无E2沉淀，建立120天)，并按指示每日给药(n＝4-5)。e，SERK-F6处理的具有TDG-luc.肿瘤负荷的小鼠7天后的生物发光图像。f，在NSG切除卵巢的小鼠中的MYS-luc.原位肿瘤(无E2沉淀，建立45天)，并按指示每日给药(n＝4-5)。g，在NSG切除卵巢的小鼠中的MDG-luc.原位肿瘤(无E2沉淀，建立45天)，并按指示每日给药(n＝4-5)。h，向NSG切除卵巢小鼠的尾静脉注入MDG-luc.细胞转移模型(无E2沉淀，建立1.5个月)，并按指示每日给药小鼠(n＝4-5)。

图42.结果表明，SERK-F6介导的突变ERα的根除取决于定量的细胞杀死。a，21次每日剂量的SERK-F6(40mg/kg腹腔注射)后停止治疗，并通过生物发光追踪小鼠肿瘤负荷。b、c，SERK-F6治疗期间携带TYS肿瘤的小鼠体重。d，以较低剂量的SERK-F6(10mg/kg口服)治疗的具有TYS肿瘤的小鼠再生长肿瘤，然而以较高剂量的SERK-F6(40mg/kg口服)再次治疗则导致完全退缩。e，TDG模型期间观察到的小鼠体重。f，将带有TDG的小鼠连续治疗14天，并停止治疗，从而通过生物发光成像观察肿瘤再生长。g，在NSG切除卵巢的小鼠中建立TDG-luc.原位肿瘤(无E2沉淀，建立～120天)，并按指示每日给药(n＝5-6)。h，以较低剂量的SERK-F6(10mg/kg口服)治疗的具有TDG-luc.肿瘤的小鼠在没有治疗的2个月后再生长肿瘤，然而以较高剂量的SERK-F6(40mg/kg腹腔注射)再次治疗则导致完全退缩。显示的误差线为S.E.M。

图43.SERK-F6介导的MYS/MDG肿瘤的根除取决于定量的细胞杀死。a-b，在NSG切除卵巢的小鼠中建立MYS-luc.原位肿瘤(无E2沉淀，建立～45天)，并按指示每日给药(n＝5-6)。b，每日21次剂量的SERK-F6后停止MYS-luc.肿瘤的治疗，并通过生物发光追踪小鼠肿瘤负荷。在第60天，给再生长肿瘤给药SERK-F6(40mg/kg每日腹腔注射)。c，代表性生物发光图像。c-d，在NSG切除卵巢的小鼠中建立MDG-luc.原位肿瘤(无E2沉淀，建立～45天)，并按指示每日给药(n＝5-6)。通过总光子通量追踪肿瘤体积。d，使用40mg/kg SERK-F6每日口服治疗的MDG-luc.肿瘤在停止治疗后再生长。使用40mg/kg SERK-F6腹腔注射再治疗再生长的肿瘤并观察到肿瘤退缩。

具体实施方式

癌细胞可以长时间保持休眠，然后再激活。因此，期望杀死肿瘤细胞，而不仅仅防止它们增殖。本公开还提供用于测试化合物杀死癌细胞如乳腺癌细胞的能力的各种试验的说明。

本公开还鉴定了在杀死乳腺癌细胞方面比BHPI更有效的新化合物，所述乳腺癌细胞表达常见于转移性乳腺癌的野生型雌激素受体α(ERα)和ERα突变。这些突变与对当前疗法的抗性有关。本发明还鉴定了对卵巢癌细胞、子宫癌细胞和其他含有ERα的癌细胞具有活性的化合物。

化合物C(-)-105的发现在结构上与BHPI有关。所发现化合物105的左旋对映体的绝对构型被确定为具有(R)-构型(即(R)-105)。其经鉴定对癌细胞具有细胞毒性，而不是仅抑制癌细胞生长。(R)-105的表型杀死癌细胞，进而杀死肿瘤。鉴于化合物BHPI、氟维司群、三苯氧胺和01-15，由于它们不会杀死癌细胞，因此该发现出人意料。这些化合物仅减慢癌细胞生长，即，它们具有细胞生长抑制作用。因此，识别出(R)-105独特的细胞毒性谱和体外定量杀死癌细胞的能力。从另外的体内研究中收集的数据已证明了该化合物在退缩肿瘤方面的有效性。

定义

包括以下定义以提供对本说明书和权利要求书的清晰和一致的理解。如本文中所用，所引用的术语具有以下含义。如本领域技术人员将理解的，本说明书中使用的所有其他术语和短语具有其普通含义。所述普通含义可以通过参考技术词典例如Hawley’sCondensed Chemical Dictionary第14版，由R.J.Lewis编辑，John Wiley&Sons，New York，N.Y.，2001而获得。

说明书中对“一个实施方案”等的引用表明所描述的实施方案可包括特定方面、特征、结构、部分或特性，但并非每个实施方案都必须包括该方面、特征、结构、部分或特性。此外，这样的短语可以但不是必须是指说明书的其他部分中所提及的相同的实施方案。此外，当结合一个实施方案描述特定方面、特征、结构、部分或特性时，在本领域技术人员的知识范围内影响所述方面、特征、结构、部分或特性或将其与其他实施方案结合，无论是否明确描述。

除非上下文另有明确规定，否则单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括复数形式的引用。因此，例如，对“化合物”的引用包括多个这样的化合物，以使化合物X包括多个化合物X。还应注意，可以撰写权利要求书来排除任何任选的要素。因此，该声明旨在作为使用与本文所述的任何要素结合的排他性术语(例如“单独地”、“仅”等)，和/或列举权利要求要素或使用“否定”限制的前提基础。

术语“和/或”意指与该术语相关的任意一个项目、项目的任意组合或所有项目。短语“一或多个/种”和“至少一个/种”容易被本领域技术人员理解，特别是在其使用的上下文中阅读时。例如，该短语可意指一、二、三、四、五、六、十、100或比所列举的下限高约10倍、100倍或1000倍的任何上限。例如，苯环上一个或多个取代基是指环上一至五个取代基。

如本领域技术人员将理解的，所有数字，包括表示成分的数量、特性如分子量、反应条件等的那些，均为近似值，并且在所有情况下应理解为由术语“约”任选地修饰。这些值可根据本领域技术人员利用本文说明书的教导寻求获得的所需性能而变化。还应理解，这些值固有地包含因其各自测试测量中存在的标准偏差而必然产生的可变性。当通过使用先行词“约”将值表示为近似值时，应当理解，没有修饰语“约”的特定值也形成另一方面。

术语“约”和“大约”可互换使用。这两个术语都可以表示所指定值的±5％、±10％、±20％或±25％的变化。例如，在一些实施方案中，“约50％”可以具有从45％至55％的变化，或者如特定权利要求另外所定义的。对于整数范围，术语“约”可以包括一个或两个大于和/或小于范围各端所列举的整数的整数。除非本文另有说明，否则术语“约”和“大约”旨在包括接近所列举范围的值(例如重量百分比)，其就各个成分、组合物或实施方案的功能而言是等效的。术语“约”和“大约”还可以修饰本段以上所讨论的所列举范围的端点。

如本领域技术人员将理解的，出于任何目的和所有目的，特别是就提供书面说明而言，本文所列举的所有范围还包括任何和所有可能的子范围及其子范围的组合，以及组成该范围的各个值，特别是整数值。因此，应当理解，还公开了两个特定单元之间的每个单元。例如，如果公开了10至15，则还分别公开了11、12、13和14，并且作为范围的一部分。所列举的范围(例如重量百分比或碳基团)包括该范围内的每个比值、整数、小数或恒等式。任何所列范围都可以容易地识别为充分公开了同一范围分解为至少相等的两等份、三等份、四等份、五等份或十等份。作为非限制性实例，本文所讨论的每个范围均可以容易地分解为下三分之一、中间三分之一和上三分之一等。如本领域技术人员还将理解的，所有语言，例如“最高达”、“至少”、“大于”、“小于”、“多于”、“或更多”等包括所列举的数字，并且这些术语是指可以随后分解为如上所讨论的子范围的范围。以同样的方式，本文所列举的所有比例还包括落入较宽比例内的所有子比例。因此，针对基团、取代基和范围所列举的具体值仅用于说明；它们不排除其他所定义的值或在自由基和取代基的定义范围内的其他值。还应当理解，每个范围的端点相对于另一个端点以及独立于另一个端点都具有重要意义。

本领域技术人员还将容易认识到，在以通用方式将成员分组在一起的情况下，例如在马库什群组中，本发明不仅包括作为一个整体列出的整个组，而且还分别包括该组的每个成员以及该主组的所有可能的子组。另外，出于所有目的，本发明不仅包括主组，而且还包括缺少一个或多个组成员的主组。因此，本发明设想明确排除所列举组的任何一个或多个成员。因此，前提条件可以应用于任何所公开的类别或实施方案，由此可从所述类别或实施方案中排除任何一个或多个所列举的要素、种类或实施方案，例如用于明确的否定限制。

术语“接触”是指触摸、使接触或进行直接或紧密接近的行为，包括在细胞水平或分子水平上，例如为了引起生理反应、化学反应或物理变化，例如在溶液中、在反应混合物中、在体外或在体内。

“有效量”是指有效治疗疾病、病症和/或病况或产生所述效果的量。例如，有效量可以是有效降低所治疗的病况或症状的进程或严重程度的量。治疗有效量的确定完全在本领域技术人员的能力范围内。术语“有效量”旨在包括本文所述的化合物的量，或本文所述化合物的组合的量，例如，其有效治疗或预防宿主中的疾病或病症，或治疗所述疾病或病症的症状。因此，“有效量”通常意指提供预期效果的量。

或者，如本文中所用，术语“有效量”或“治疗有效量”是指给予足够的量的药剂或组合物或组合物的组合，在一定程度上将减轻所治疗疾病或病况的一种或多种症状。所述结果可以是减少和/或缓解疾病的体征、症状或病因，或生物系统的任何其他期望的改变。例如，用于治疗用途的“有效量”是提供疾病症状临床上显著减少所需的包含本文所公开的化合物的组合物的量。在任何个别情况下，都可以使用诸如剂量递增研究的技术来确定适当的“有效”量。所述剂量可以一次或多次给予的形式来给予。然而，可以根据每个患者的个体因素精确确定所认为的有效剂量，每个患者的个体因素包括但不限于患者的年龄、大小、疾病类型或程度、疾病阶段、给予组合物的途径、所用补充治疗的类型或程度、正在进行的疾病过程以及所需的治疗类型(例如，积极治疗与常规治疗)。

术语“治疗”包括(i)预防疾病、病理性或医学病况的发生(例如预防)；(ii)抑制疾病、病理性或医学病况或阻止其发展；(iii)减轻疾病、病理性或医学病况；和/或(iv)减少与疾病、病理性或医学病况有关的症状。因此，术语“治疗”可扩展至预防并且可包括预防、降低、阻止或逆转所治疗的病况或症状的进程或严重程度。因此，术语“治疗”可适当包括医学、治疗和/或预防性给药。

如本文中所用，“受试者”或“患者”意指具有疾病或其他恶性肿瘤的症状或风险的个体。患者可以是人类或非人类，并且可以包括例如出于研究目的用作“模型系统”的动物品系或物种，例如本文所述的小鼠模型。同样地，患者可以包括成人或青少年(例如儿童)。此外，患者可以意指可受益于本文所预期的组合物的给予的任何活生物体，优选哺乳动物(例如人类或非人类)。哺乳动物的实例包括但不限于哺乳动物类的任何成员：人类、非人灵长类动物(例如黑猩猩)以及其他猿类和猴类物种；农场动物，例如牛、马、绵羊、山羊、猪；家畜，例如兔子、狗和猫；实验动物，包括啮齿动物，例如大鼠、小鼠和豚鼠等。非哺乳动物的实例包括但不限于鸟类、鱼类等。在本文所提供的方法的一个实施方案中，所述哺乳动物是人。

如本文中所用，术语“提供”、“给予”、“引入”在本文中可互换使用，并且是指通过导致组合物至少部分定位于所需位置的方法或途径将本公开的组合物置于受试者体内。所述组合物可通过导致递送到受试者体内所需位置的任何合适的途径来给予。

本文所述的组合物可与另外的组合物一起给予以延长组合物的稳定性和活性，或与其他治疗药物结合。

术语“抑制”是指减慢、阻止或逆转疾病、感染、病况或细胞群的生长或进程。例如，与不进行治疗或接触而出现的生长或进程相比，抑制率可大于约20％、40％、60％、80％、90％、95％或99％。

如本文中所用，术语“基本上”是广义的术语，并以其通常的意义使用，包括但不限于很大程度上但不一定是所指定的全部。例如，该术语可以指可能不是100％完整数值的数值。所述完整数值可以少约1％、约2％、约3％、约4％、约5％、约6％、约7％、约8％、约9％、约10％、约15％、或约20％。

本公开提供了制备本发明的化合物和组合物的方法。所述化合物和组合物可通过任何本文所述的适用技术来制备，任选地与有机合成的标准技术结合。许多技术例如醚化和酯化是本领域众所周知的。然而，这些技术中的许多详细阐述于以下文献中：Compendiumof Organic Synthetic Methods(John Wiley&Sons，New York)，第1卷，Ian T.Harrison和Shuyen Harrison，1971；第2卷，Ian T.Harrison和Shuyen Harrison，1974；第3卷，LouisS.Hegedus和Leroy Wade，1977；第4卷，Leroy G.Wade，Jr.，1980；第5卷，Leroy G.Wade，Jr.，1984；和第6卷；以及标准有机参考文献例如March′s Advanced Organic Chemistry：Reactions，Mechanisms，and Structure，第5版，由M.B.Smith和J.March编辑(John Wiley&Sons，New York，2001)；Comprehensive Organic Synthesis.Selectivity，Strategy&Efficiency in Modern Organic Chemistry.在第9卷，Barry M.Trost，总编辑(PergamonPress，New York，1993印刷)；Advanced Organic Chemistry，部分B：Reactions andSynthesis，第二版，Cary和Sundberg(1983)；

本文所述的式和化合物可使用保护基团进行修饰。合适的氨基和羧基保护基团是本领域技术人员已知的(参见，例如Protecting Groups in Organic Synthesis，第二版，Greene，T.W.，和Wutz，P.G.M.，John Wiley&Sons，New York，以及其中所引用的参考文献；Philip J.Kocienski；Protecting Groups(Georg Thieme Verlag Stuttgart，New York，1994)，以及其中所引用的参考文献)；和Comprehensive Organic Transformations，Larock，R.C.，第二版，John Wiley&Sons，New York(1999)，以及其中所引用的参考文献。

如本文中所用，术语“取代的”或“取代基”旨在表示在使用“取代的”(或“取代基”)的表述中所指定基团上的一个或多个(例如，在不同实施方案中1-20，在其他实施方案中1-10，1、2、3、4或5；在一些实施方案中1、2或3；以及在其他实施方案中1或2)氢被所指定基团中的选择替代，或被本领域技术人员已知的合适基团替代，条件是不超过所指定原子的正常化合价，并且所述取代产生稳定的化合物。合适的指定基团包括例如烷基、烯基、炔基、烷氧基、卤素、卤代烷基、羟基、羟烷基、芳基、杂芳基、杂环、环烷基、烷酰基、烷氧基羰基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、三氟甲硫基、二氟甲基、酰胺基、硝基、三氟甲基、三氟甲氧基、羧基、羧基烷基、酮基、硫代(thioxo)、烷硫基、烷基亚磺酰基、烷基磺酰基和氰基。此外，可与取代的碳(或其他)原子键合的取代基的非限制性实例包括F、Cl、Br、I、OR′、OC(O)N(R′)₂、CN、CF₃、OCF₃、R′、O、S、C(O)、S(O)、亚甲基二氧基、亚乙基二氧基、N(R′)₂、SR′、SOR′、SO₂R′、SO₂N(R′)₂、SO₃R′、C(O)R′、C(O)C(O)R′、C(O)CH₂C(O)R′、C(S)R′、C(O)OR′、OC(O)R′、C(O)N(R′)₂、OC(O)N(R′)₂、C(S)N(R′)₂、(CH₂)_0-2NHC(O)R′、N(R′)N(R′)C(O)R′、N(R′)N(R′)C(O)OR′、N(R′)N(R′)CON(R′)₂、N(R′)SO₂R′、N(R′)SO₂N(R′)₂、N(R′)C(O)OR′、N(R′)C(O)R′、N(R′)C(S)R′、N(R′)C(O)N(R′)₂、N(R′)C(S)N(R′)₂、N(COR′)COR′、N(OR′)R′、C(＝NH)N(R′)₂、C(O)N(OR′)R′或C(＝NOR′)R′，其中R′可为氢或碳基部分，并且其中所述碳基部分本身可被进一步取代。当取代基为一价时，例如F或Cl，其与通过单键取代的原子键合。当取代基大于一价时，例如二价的O，其可与通过多于一个键取代的原子键合，即二价取代基通过一个双键键合；例如，被O取代的C形成羰基(C＝O)，其中C和O是双键合的。或者，二价取代基例如O、S、C(O)、S(O)或S(O)₂可通过两个单键与两个不同的碳原子连接。例如，O，作为一个二价取代基，可与两个相邻碳原子中的每一个键合以提供环氧基团，或者O可在相邻或不相邻的碳原子之间形成一个桥接醚基，例如，将环己基的1，4-碳桥接形成[2.2.1]-氧杂双环体系。此外，任何取代基都可通过连接基例如(CH₂)_n或(CR′₂)_n(其中n为1、2、3或更大，并且独立地选择每个R′)与碳原子或其他原子键合。

术语“卤代”或“卤化物”是指氟代、氯代、溴代或碘代。类似地，术语“卤素”是指氟、氯、溴和碘。

术语“烷基”是指具有例如1-20个碳原子且经常具有1-12、1-10、1-8、1-6或1-4个碳原子的支链或直链烃。如本文中所用，术语“烷基”还包括下文所定义的“环烷基”。实例包括但不限于甲基、乙基、1-丙基、2-丙基(异丙基)、1-丁基、2-甲基-1-丙基(异丁基)、2-丁基(仲丁基)、2-甲基-2-丙基(叔丁基)、1-戊基、2-戊基、3-戊基、2-甲基-2-丁基、3-甲基-2-丁基、3-甲基-1-丁基、2-甲基-1-丁基、1-己基、2-己基、3-己基、2-甲基-2-戊基、3-甲基-2-戊基、4-甲基-2-戊基、3-甲基-3-戊基、2-甲基-3-戊基、2，3-二甲基-2-丁基、3，3-二甲基-2-丁基、己基、辛基、癸基、十二烷基等。所述烷基可为未取代的或例如被下文所述的取代基取代。所述烷基还可任选地为部分或完全不饱和的。因此，烷基的列举可包括烯基和炔基。如上文所述和所例证，所述烷基可为一价烃基，或其可为二价烃基(即亚烷基)。

术语“环烷基”是指具有单个环或多个稠合的环的例如3至10个碳原子的环烷基。环烷基基团包括例如单环结构，例如环丙基、环丁基、环戊基、环辛基等，或多环结构例如金刚烷基等。所述环烷基可为未取代的或取代的。所述环烷基可为一价或二价，并且可如针对烷基所述的那样被任选地取代。所述环烷基可任选地包括一个或多个不饱和位点，例如，所述环烷基可包括一个或多个碳-碳双键，例如1-环戊-1-烯基、1-环戊-2-烯基、1-环戊-3-烯基、环己基、1-环己-1-烯基、1-环己-2-烯基、1-环己-3-烯基等。

术语“杂环烷基”或“杂环基”是指在至少一个环中包含至少一个选自氮、硫、氧的杂原子，优选1至3个杂原子的饱和或部分饱和的单环、双环或多环。每个环优选为3至10元，更优选为4至7元。合适的杂环烷基取代基的实例包括吡咯烷基、四氢呋喃基、硫代四氢呋喃基(tetrahydrothiofuranyl)、哌啶基、哌嗪基(piperazyl)、四氢吡喃基、吗啉代(morpholino)、1，3-二氮杂环庚烷(diazapane)、1，4-二氮杂环庚烷、1，4-氧氮杂环庚烷(oxazepane)和1，4-氧硫杂环庚烷(oxathiapane)。所述基团可为末端基团或桥接基团。

术语“芳族”是指本文所述的芳基或杂芳基基团或取代基。此外，芳族部分可为双芳族部分、三芳族部分等。双芳族部分在两个芳族部分之间具有一个单键，例如但不限于联苯或联吡啶。类似地，三芳族部分在每个芳族部分之间具有一个单键。

术语“芳基”是指衍生自除去母体芳族环体系的单个碳原子中至少一个氢原子的芳族烃基。自由基连接位点可在母体环体系的饱和或不饱和碳原子上。所述芳基可具有6至30个碳原子，例如约6-10个碳原子。在其他实施方案中，所述芳基可具有6至60个碳原子、6至120个碳原子或6至240个碳原子。所述芳基可具有一个单环(例如苯基)或多个稠合的(condensed，fused)环，其中至少一个环是芳族的(例如萘基、二氢菲基(dihydrophenanthrenyl)、芴基或蒽基)。典型的芳基包括但不限于衍生自苯、萘、蒽、联苯等的基团。所述芳基可为未取代的或任选取代的。

术语“杂芳基”是指包含一个、两个或三个芳环并在芳环中包含至少一个氮、氧或硫原子的单环、双环或三环环体系。如“取代的”的定义中所述，杂芳基可为未取代的或例如被一个或多个且特别是一至三个取代基取代。典型的杂芳基基团除一个或多个杂原子外，在环骨架中还包含2-20个碳原子。杂芳基基团的实例包括但不限于2H-吡咯基、3H-吲哚基、4H-喹嗪基(4H-quinolizinyl)、吖啶基(acridinyl)、苯并[b]噻吩基、苯并噻唑基、β-咔啉基(β-carbolinyl)、咔唑基、色烯基(chromenyl)、噌啉基(cinnolinyl)、二苯并[b，d]呋喃基、呋咕基(furazanyl)、呋喃基、咪唑基、imidizolyl、吲唑基、indolisinyl、吲哚基、异苯并呋喃基、异吲哚基、异喹啉基、异噻唑基、异噁唑基、萘啶基(naphthyridinyl)、噁唑基、啶基(perimidinyl)、菲啶基(phenanthridinyl)、菲咯啉基(phenanthrolinyl)、吩吡嗪基(phenarsazinyl)、吩嗪基、吩噻嗪基(phenothiazinyl)、吩噁噻基(phenoxathiinyl)、吩噁嗪基(phenoxazinyl)、酞嗪基(phthalazinyl)、蝶啶基、嘌呤基、吡喃基、吡嗪基、吡唑基、哒嗪基、吡啶基、嘧啶基、吡咯基、喹唑啉基(quinazolinyl)、喹啉基、喹喔啉基(quinoxalinyl)、噻二唑基(thiadiazolyl)、噻蒽基(thianthrenyl)、噻唑基、噻吩基、三唑基、四唑基和呫吨基(xanthenyl)。在一个实施方案中，术语“杂芳基”表示含有五个或六个环原子的单环芳族环，所述环原子包含碳和1、2、3或4个独立地选自非过氧化物氧、硫和N(Z)的杂原子，其中Z不存在或为H、O、烷基、芳基或(C₁-C₆)烷基芳基。在一些实施方案中，杂芳基表示由此衍生的约8至10个环原子的邻稠合双环杂环，特别是苯并衍生物或通过将亚丙基、三亚甲基或四亚甲基双自由基与之稠合而衍生的那些。

如本文中所用，术语“对映体富集”(“ee”)是指具有一种对映体比另一种对映体存在更大程度的混合物。因此，提供一种对映体比另一种对映体存在更大程度的反应会具有“对映选择性”(或证明“对映选择性”)。在本发明的一个实施方案中，术语“对映体富集”是指具有至少约2％ee的混合物；在本发明的另一个实施方案中，术语“对映体富集”是指具有至少约5％ee的混合物；在本发明的另一个实施方案中，术语“对映体富集”是指具有至少约20％的混合物；在本发明的另一个实施方案中，术语“对映体富集”是指具有至少约50％的混合物；在本发明的另一个实施方案中，术语“对映体富集”是指具有至少约80％的混合物；在本发明的另一个实施方案中，术语“对映体富集”是指具有至少约90％的混合物；在本发明的另一个实施方案中，术语“对映体富集”是指具有至少约95％的混合物；在本发明的另一个实施方案中，术语“对映体富集”是指具有至少约98％的混合物；在本发明的另一个实施方案中，术语“对映体富集”是指具有至少约99％的混合物。术语“对映体富集”包括对映体纯的混合物，其为基本上不含具有相反旋光性的物质或一种对映体以非常低的量(例如0.01％、0.001％或0.0001％)存在的混合物。

术语“IC₅₀”通常定义为在24小时内杀死50％的细胞所需的浓度。

在整个本公开中，术语“(-)-105”是指化合物105的左旋对映体，其可与术语C(-)-105、(-)-1、(R)-105、(R)-1或SERK-F6互换使用。类似地，(+)-105为右旋对映体，也称为(S)-105、(S)-1或(+)-1。另外，术语“(±)-105”是指化合物105的外消旋体，其可与术语(±)-1互换使用。

本发明的实施方案

本公开提供式I的化合物或其盐或溶剂化物的各种实施方案：

其中

R¹、R²、R³和R⁴各自独立地为H、卤素、-OR^A、-SR^A、-N(R^A)₂、烷基、环烷基、杂环基、芳基或杂芳基；

A¹、A²、A³和A⁴各自独立地为H、卤素或烷基；

G¹为卤素、-OR^B、-SR^B、-S(＝O)₂R^B或烷基；

G²为卤素、-OR^C、-SR^C、-S(＝O)₂R^C或烷基；

X和Z各自独立地为O、S或-NR^D；和

R^A、R^B、R^C和R^D各自独立地为H或烷基，其中，当存在时，-OR^B和-OR^C不都为-OH；

其中每个烷基、环烷基、杂环基、芳基和杂芳基任选地被一个或多个取代基取代。

在本文所述的式I-IV的各种实施方案中，R⁵为A¹邻位上的取代基。在各种实施方案中，R⁶为A²邻位上的取代基。在各种实施方案中，R⁷为A³邻位上的取代基。在各种实施方案中，R⁸为A⁴邻位上的取代基。在各种实施方案中，R⁵、R⁶、R⁷和R⁸各自独立地为H、卤素、-OR^A、-SR^A、-N(R^A)₂、烷基、环烷基、杂环基、芳基或杂芳基。

在一些实施方案中，所述化合物为(S)-对映体。在其他实施方案中，所述化合物为(R)-对映体。在另外的实施方案中，R^A、R^B、R^C和R^D各自独立地为H或-(C₁-C₆)烷基，并且R¹、R²、R³和R⁴各自独立地为H、卤素或-(C₁-C₆)烷基。在一些其他实施方案中，A¹、A²、A³和A⁴各自独立地为H或卤素，并且G¹为-OR^B。在其他实施方案中，X为-NR^D且Z为O。在其他实施方案中，R^A、R^B、R^C、R^D、R¹、R²、R³和R⁴各自独立地为-(C₂-C₆)烷基、-(C₃-C₆)烷基或-(C₃-C₆)环烷基。

在各种另外的实施方案中，R¹为CH₃、CH₂CH₃、CF₃、CHF₂、CH₂CF₃、CF₂CH₃或CF₂CF₃。在其他另外的实施方案中，G¹为-OR^B，并且R^B为H、CH₃、CH₂CH₃、CF₃、CHF₂、CH₂CF₃、CF₂CH₃或CF₂CF₃。

在其他实施方案中，所述化合物为式II或式(III)的化合物：

在一些其他实施方案中，所述化合物为式IV的化合物：

其中G¹为-OR^B，并且R^B和R¹各自独立地为烷基或环烷基，其中所述烷基和环烷基任选地被一个或多个卤素基团取代。

在各种其他实施方案中，一个或多个氢原子为氘或氚，一个或多个碳原子为碳同位素，或其组合。

在其他实施方案中，所述化合物为化合物(S)-或(R)-2、4、6、8或105中的任何一种：

在另外的实施方案中，所述化合物为所示化合物中的任何一种：

或其对映体。

在一些另外的实施方案中，所述化合物是左旋的。在其他实施方案中，所述化合物是右旋的。在其他实施方案中，所述化合物为(R)-105或(S)-105。在其他实施方案中，所述化合物为(R)-105。

在其他另外的实施方案中，所述化合物(对映体或外消旋体)对α雌激素受体(ERα)具有结合亲和力，并且结合亲和力的IC₅₀小于约500nM。在其他实施方案中，ERα的IC₅₀为约1pM至约1000nM、约0.1nM至约750nM、约1nM至约250nM、约5nM至约500nM或约10nM至约5000nM。在各种其他实施方案中，所述化合物通过内质网中未折叠蛋白反应(UPR)的过度激活来杀死或抑制癌细胞的生长。在其他实施方案中，癌细胞为ERα阳性癌细胞。在一些其他实施方案中，癌细胞为乳腺癌细胞、卵巢癌细胞或子宫内膜癌细胞。

本公开还提供包含本文所公开的化合物和第二种药物的组合物。本公开还提供包含与药学上可接受的稀释剂、载体、赋形剂或缓冲剂结合的所述化合物的药物组合物。在药物组合物的一些实施方案中，所述化合物为(R)-105和(S)-105的外消旋混合物。在各种实施方案中，化合物的外消旋混合物为对映体的混合物，其中对映体的混合物的比例为约50∶50、约45∶55、约40∶60、约30∶70、约20∶80、约10∶90或约5∶95。

本公开还提供一种治疗癌症的方法，所述方法包括向有需要的ERα阳性癌症受试者给予治疗有效量的化合物，从而治疗该受试者的癌症。在其他实施方案中，所述化合物通过内质网中未折叠蛋白反应(UPR)的过度激活来杀死或抑制ERα阳性癌症的生长。在其他实施方案中，所述化合物为(R)-105和(S)-105的外消旋混合物。在其他实施方案中，所述ERα阳性癌症为乳腺癌、卵巢癌、子宫癌、宫颈癌或子宫内膜癌。

本公开还提供所述化合物用于在有需要的受试者中治疗ERα阳性疾病的用途，其中将治疗有效量的所述化合物给予受试者，从而治疗该受试者的癌症。在各种实施方案中，ERα阳性疾病为ERα阳性癌症。在其他实施方案中，ERα阳性癌症为乳腺癌、卵巢癌、子宫癌、宫颈癌或子宫内膜癌。在另外的实施方案中，口服、通过注射、皮下、舌下、直肠、通过输注、静脉内、通过皮肤吸收或通过体腔或孔口给予所述化合物。

本公开提供变量如体积、质量、百分比、比例等的范围、极限和偏差。本领域普通技术人员应理解，范围，例如“数1”至“数2”意指包括非负整数和分数的连续的数字范围。例如，1至10意指1、2、3、4、5、...、9、10。其还意指1.0、1.1、1.2、1.3、...、9.8、9.9、10.0，以及意指1.01、1.02、1.03等。如上所述，如果所公开的变量是小于“数10”的数，则其意指包括小于数10的非负整数和分数的连续范围。类似地，如果所公开的变量是大于“数10”的数，则其意指包括大于数10的非负整数和分数的连续范围。这些范围可由术语“约”修饰，其含义已在上文描述。

结果与讨论

使用CRISPR/Cas9基因编辑系统以用两种在转移性乳腺癌中最常见的ERα突变，即ERαY537S和ERαD538G，替代T47D人类乳腺癌细胞中的野生型ERα。所得细胞系TYS-4(也称为TYS)和TDG-1(也称为TDG)(T47DERαY537S克隆4和T47DERαD538G克隆1)表现出对三苯氧胺(三苯氧胺的活化型为z-4-羟基三苯氧胺；z-OHT)和氟维司群/ICI的显著抗性。(Mao等人，2016)。

为了使活体动物中聚藏这些突变的肿瘤可视化，分离了稳定表达萤火虫荧光素酶的TYS和TDG细胞克隆系。包含这些TYS-Luc和TYDG-Luc细胞的原位小鼠肿瘤通过生物发光成像(BLI)在活体动物中可视化。由于体内成像系统(IVIS)的检测范围超过10,000倍，并且可用于使原发性肿瘤和转移性肿瘤的进程可视化，因此使用IVIS的BLI技术被认为是评估新型抗癌药在动物模型中的功效的最先进的方法。在大学、制药公司或生物技术公司中没有其他研究团队开发出将乳腺癌ERα突变和荧光素酶的表达结合用于BLI的细胞系。

无偏高通量筛选方法用于阻断ERα作用的小分子来鉴定新型ERα生物调节剂(biomodulator)。BHPI是从该搜索中出现的第一代先导小分子。BHPI是一种有效的首创非竞争性小分子ERα生物调节剂，其杀死治疗抗性ERα阳性乳腺癌细胞和子宫内膜癌细胞，并阻断卵巢癌细胞的生长。与三苯氧胺和氟维司群相比，BHPI在ERα上的不同位点结合，并且具有不同的作用机制。已证明BHPI通过ERα发挥作用，诱导未折叠蛋白反应(UPR)激活的预期途径的持续致死性过度激活。在细胞培养模型中，BHPI选择性地阻断生长，并经常杀死治疗抗性乳腺癌细胞、卵巢癌细胞和子宫内膜癌细胞。值得注意的是，BHPI阻断了表达转移性乳腺癌中经鉴定的ERα突变的TYS和TDG细胞的增殖。

在ERα阳性乳腺癌的小鼠异种移植模型中，在合理剂量下，BHPI阻止肿瘤的生长，并诱导快速而实质性的肿瘤退缩。

在使用TYS-Luc和TDG-Luc细胞的异种移植研究中，经过4周后，载体对照乳腺肿瘤的细胞增长了大约四倍。相比之下，用BHPI治疗的小鼠中的肿瘤表现出97％-99.5％退缩。

在使用对不同抗癌药物具有高度抗性的OVCAR-3细胞的原位卵巢癌异种移植模型中，紫杉烷紫杉醇是无效的。单独使用BHPI强有力地降低了肿瘤生长。值得注意的是，在用BHPI加紫杉醇治疗的小鼠中无法检测到肿瘤，并且循环的癌症生物标记CA125的水平逐渐下降至无法检测到。在两项研究中，小鼠对BHPI的耐受性均良好。

具有优异的杀死治疗抗性乳腺癌细胞能力的新化合物

通过合成和评估，鉴定了在杀死治疗抗性乳腺癌细胞的能力方面优于BHPI的新化合物。与该组中的先导化合物BHPI相比，C-105表现出更强的效力和功效。

开发了针对具有改善的杀死癌细胞能力的化合物的试验。一种试验是基于经典的细胞死亡标准，通过摄取染料台盼蓝测量的膜完整性的损失。这是一种基于仪器的试验，其测定群体中已摄取台盼蓝的细胞的百分比。摄取台盼蓝的所有细胞均死亡。这种新试验对于所公开的筛选工作流程是独特的。尽管台盼蓝摄取普遍认为是细胞死亡的量度，但其尚未被其他人用来测试潜在的抗癌药物。另外的用于评估细胞死亡的试验包括荧光激活细胞分选(FACS)和基于增殖抑制率和测定细胞数的试验，有时与raptinal(一种已知的诱导100％细胞死亡的化合物)结合。

通过合成，获得了包含新颖结构特征的小分子，所述新颖结构特征赋予出人意料的结果。与先导小分子BHPI相比，C-105表现出高的多的效力和功效。值得注意的是，与BHPI不同，在长期细胞培养实验中，C-105的活性(-)对映体杀死了100％的TYS-Luc细胞。

此外，当前的内分泌治疗药物三苯氧胺和氟维司群具有细胞生长抑制作用，并且完全不具有杀死TYS和TDG乳腺癌细胞的能力。C-105展示出目标特异性，即使在比有效杀死ERα阳性乳腺癌细胞的浓度高10倍以上的浓度下，C-105在几种ERα阴性细胞系中也没有效果。另外，非活性(+)对映体在ERα阳性和ERα阴性细胞系中无效且无毒。

值得注意的是，在小鼠异种移植中，在给予活性(-)C-105仅3天后，肿瘤被消灭。使用BLI使肿瘤可视化，五个肿瘤中的四个缩小(退缩)了超过99.9％，并且所有五个肿瘤均缩小了超过99％。使用卡尺，在7天内，所有5个肿瘤均已缩小至无法检测的大小。三周后，一只小鼠的肿瘤完全消失(竞争退缩-100％)，而其余4只小鼠中的3只的肿瘤缩小了超过99.9％。在剩余信号是否是由于死亡或休眠的肿瘤细胞、或肿瘤细胞是否会再生长的长持续时间测试中，在停止治疗并等待4周后，一个完全消失的肿瘤(完全退缩-100％)保持在-100％，并且在其他小鼠中不存在“微肿瘤(MICRO-TUMOR)”再生长。这是前所未有的反应。

-105的作用机制：-105的作用包括但不限于诱导内质网应激传感器未折叠蛋白反应(UPR)的致死性过度激活。内质网(EnR)应激传感器未折叠蛋白反应(UPR)平衡新蛋白质的合成与蛋白伴侣和其他有助于在细胞内折叠和运输蛋白的蛋白质的可用性。在未折叠蛋白质不存在的情况下，预期的UPR途径被激活，并预测未来对新蛋白质折叠能力的需求(图32)。

为了诱导未折叠蛋白反应的致死性过度激活，-105与癌细胞中的ERα结合。这导致磷脂酶Cγ(PLCγ)的激活，激活的PLCγ酶促产生三磷酸肌醇(IP₃)。IP₃结合并打开EnR中内质网IP₃受体钙通道。打开IP₃R钙通道导致储存在内质网内腔(内部)中的钙非常快速地流出到细胞体内。这使UPR过度激活。激活后，UPR的一个臂(PERK臂)抑制蛋白质合成。UPR的另一个臂IRE1α的激活诱导来自编码转录因子XBP-1的mRNA的活性剪接的形成(spXBP-1)。为了恢复钙稳态，强有力的SERCA泵在内质网膜中进行ATP依赖性的钙从细胞体泵入EnR内部。由于IP₃R钙通道保持开放，因此泵入EnR内腔的钙泄漏回去。这产生了一个无效循环，耗尽细胞内的ATP。

UPR标记和抑制剂：spXBP-1 mRNA的形成用作UPR激活的标记。广泛使用的小分子2-APB将IP₃R锁定为封闭状态，并防止钙外排和UPR过度激活。小分子毒胡萝卜素(THG)有效地抑制SERCA泵，并防止细胞耗尽其ATP储备。

在一项治疗和载体对照的小鼠肿瘤研究中，人类乳腺癌细胞被设计成既包含在转移性乳腺癌中发现的致死性ERαY537S突变，又包含萤火虫荧光素酶基因——当添加适当的化学物质时，萤火虫荧光素酶使化学物质分解并产生光。使用称为成像系统的灵敏检测器，这允许我们对活小鼠体内的肿瘤成像。这称为生物发光成像或BLI。允许形成大肿瘤。然后每日在皮肤下注射(-)-105三周。使用成像系统，监测(-)-105对肿瘤的效果。同时，还监测溶解(-)-105的载体对肿瘤的效果。除了未接受测试药物(-)-105之外，这些肿瘤进行相同的治疗。

图17中的图像显示了在研究结束时注入载体的对照肿瘤之一与用(-)-105治疗的5只小鼠中的4只并排比较(成像仪一次只能拍摄5只小鼠)。表1显示了肿瘤发射的光。在小鼠异种移植中，(-)105诱导大的治疗抗性乳腺肿瘤的快速而深刻的退缩。即使无法从视觉上看到图17中的肿瘤，通过极大增加曝光时间和灵敏度，也可使治疗的小鼠中微小数量的发光细胞成像(图34)。

进行了一项研究以确定停止用(-)-105治疗后会发生什么(表2)。该研究旨在表明微肿瘤是否会保持休眠或其是否会再生长。在为期三周的治疗结束时，存在发出微量的光的残留物质，其被称为“微肿瘤”。基于成像系统的灵敏度，据信这些微肿瘤包含0-～1,000个癌细胞；微肿瘤肉眼不可见。观看它们需要强大的成像系统或显微镜。为了测试这些细胞究竟是死亡还是不再分裂并处于休眠状态，使细胞在其停止接受任何治疗后两周和四周成像。该研究测试了是否已根除生长中的癌细胞；该研究仍在继续。

使用萤光素酶的生物发光成像(BLI)显示了在一只注射载体的对照小鼠和5只经(-)-105-处理的小鼠中的4只的并排成像中几乎根除了小鼠中治疗抗性乳腺肿瘤(图17)。在一项为期3周的研究中，大的乳腺肿瘤在治疗开始时出现，并如图17的图像所示退缩。该研究使用Orthotopic TYS-Luc(注射细胞：T47DERαY537-Luc人类乳腺癌细胞)，例如人类转移性乳腺癌中最致死性ERα突变进行。肿瘤在NSG小鼠中生长。实施例中提供其他详细信息。

表2.(-)-105治疗停止后4周微肿瘤没有再生长。

研究的主要结果如下所示：

(a)(-)-105迅速而显著地消灭肿瘤。仅三天后，所有5只小鼠的肿瘤缩小或退缩了超过99％。五个肿瘤中的四个缩小了超过99.9％。

(b)在为期三周的研究结束时，一只小鼠中没有可检测到的肿瘤(肿瘤被根除；-100％)，其他四只小鼠中的肿瘤几乎被根除，其中它们当中的两个非常接近于成像系统可检测到的极限。

(c)停止治疗后两周，微肿瘤没有再次开始生长。五只小鼠中的两只没有可检测到的肿瘤(肿瘤被根除；-100％)，两只非常轻微地减退，而一只非常轻微地增加。

(d)总体而言，对照载体处理的肿瘤继续生长。因此观察到显著的肿瘤退缩是由于给予测试药物(-)-105。

(e)使用卡尺测量肿瘤大小，仅用(-)-105治疗3天后，所有5只小鼠的肿瘤已缩小(退缩)至无法检测到。

(f)总体而言，用(-)-105治疗的小鼠的健康状况良好。无毒。

一般合成方法

本发明还涉及制备本发明的化合物和组合物的方法。所述化合物和组合物可通过有机合成的任何适用技术来制备，例如本文中所述的技术。许多这样的技术在本领域中是众所周知的。然而，许多已知的技术详细阐述于Compendium of Organic SyntheticMethods(John Wiley&Sons，New York)，第1卷，Ian T.Harrison和Shuyen Harrison，1971；第2卷，Ian T.Harrison和Shuyen Harrison，1974；第3卷，Louis S.Hegedus和Leroy Wade，1977；第4卷，Leroy G.Wade，Jr.，1980；第5卷，Leroy G.Wade，Jr.，1984；和第6卷，MichaelB.Smith；以及标准有机参考文献例如March′s Advanced Organic Chemistry：Reactions，Mechanisms，and Structure，第5版，由M.B.Smith和J.March编辑(John Wiley&Sons，NewYork，2001)，Comprehensive Organic Synthesis；Selectivity，Strategy&Efficiency inModern Organic Chemistry，在第9卷，Barry M.Trost，总编辑(Pergamon Press，NewYork，1993印刷))；Advanced Organic Chemistry，部分B：Reactions and Synthesis，第二版，Cary和Sundberg(1983)；

Protecting Groups in Organic Synthesis，第二版，Greene，T.W.，和Wutz，P.G.M.，John Wiley&Sons，New York；以及Comprehensive Organic Transformations，Larock，R.C.，第二版，John Wiley&Sons，New York(1999)。

下文提供了制备本发明的化合物的许多示例性方法。这些方法旨在说明此类制备的性质，并不旨在限制可适用方法的范围。

通常，反应条件例如温度、反应时间、溶剂、后处理步骤等是本领域对于待进行的特定反应而言常见的条件。所引用的参考资料以及其中所引用的资料均包含此类条件的详细说明。通常，温度为-100℃至200℃，根据所需条件溶剂为非质子性或质子性，并且反应时间为1分钟至10天。后处理通常包括淬灭任何未反应的试剂，然后在水/有机层体系之间进行分隔(萃取)并分离包含产物的层。

氧化和还原反应通常在接近室温(约20℃)的温度下进行，尽管对于金属氢化物还原而言通常温度会降低至0℃至-100℃。适当时也可使用加热。溶剂通常对于还原而言为非质子性，而对于氧化而言可为质子性或非质子性。调节反应时间以获得所需的转化率。

缩合反应通常在接近室温的温度下进行，尽管对于非平衡、动力学受控的缩合反应，降低温度(0℃至-100℃)也很常见。溶剂可为质子性(常见于平衡反应)，或非质子性(常见于动力学受控的反应)。标准合成技术，例如共沸去除反应副产物和使用无水反应条件(例如惰性气体环境)在本领域是常见的，并且将在适用时应用。

保护基团。术语“保护基团”是指当与羟基或其他杂原子结合时防止在该基团处发生不希望的反应并且可通过常规化学或酶促步骤除去以重建羟基的任何基团。所采用的特定可去除的保护基团并不总是关键的，并且优选的可去除的羟基保护基团包括常规的取代基，例如烯丙基、苄基、乙酰基、氯乙酰基、硫代苄基、亚苄基、苯甲酰甲基、甲基甲氧基、甲硅烷基醚(例如三甲基甲硅烷基(TMS)、叔丁基-二苯基甲硅烷基(TBDPS)或叔丁基二甲基甲硅烷基(TBS))以及任何其他可化学引入羟基官能团并随后在与产物性质相容的温和条件下通过化学或酶促方法选择性地去除的基团。

合适的羟基保护基团是本领域技术人员已知的，并更详细地公开于T.W.Greene，Protecting Groups In Organic Synthesis；Wiley：New York，1981(″Greene″)和其中所引用的参考文献，以及Kocienski，Philip J.；Protecting Groups(Georg Thieme VerlagStuttgart，New York，1994)中，两者均通过引用方式纳入本文。

保护基团是可获得的、众所周知的和常用的，并且任选地用于在合成步骤(即通过本发明的方法制备化合物的途径或方法)中防止被保护基团的副反应。在很大程度上，决定保护哪些基团、何时保护以及化学保护基团“PG”的性质取决于待保护的反应的化学性质(例如，酸性、碱性、氧化性、还原性或其他条件)以及合成的预期方向。

方案1.(+)105和(-)105的合成。

方案2.合成化合物1-6的一般合成路线。

方案3.化合物7和8的合成。

方案1-3显示了本文所公开的化合物例如方案4中的化合物的一般合成。实施例中提供详细的实验条件。

方案4.通过方案1-3制备的合成化合物的结构。

杀死癌细胞的试验依据。

台盼蓝：数十年来，通过活细胞排斥染料台盼蓝的能力来测量活细胞。具有完整膜的细胞不会吸收台盼蓝。已失去细胞膜完整性的死细胞吸收染料并呈蓝色。因此，死细胞的百分比是在总细胞群体中呈台盼蓝阳性的细胞的百分比。台盼蓝摄取的定量评估使用购自Fisher的细胞计数器。由于该试验是基于仪器的，因此在测定台盼蓝阳性细胞的百分比时不存在观察者偏差。

ALAMAR BL UE/RAPTINAL试验：活细胞保持还原环境。Alamar(刃天青(resazurin))的非荧光性细胞可渗透成分被细胞吸收。在活细胞中，它被还原为荧光化合物试卤灵(resorufin)。使用细胞数对荧光的标准曲线，可以确定测试样品中的活细胞数。在高浓度下，raptinal杀死100％的细胞。溶解测试化合物的载体是无毒的。因此，在减去单独的培养基空白后，载体的荧光读数对应于100％活细胞，而raptinal的信号对应于0％活细胞。尽管与台盼蓝试验相比，该试验提供的对细胞死亡的测量较不直接，但它更易于按比例扩展至大量样品。

流式细胞术(FITC)：垂死细胞(Dying cell)表现出特定变化，这些变化可使用荧光激活细胞分选仪(FACS)进行监测。一种这样的变化是质膜极性的损失。使用膜联蛋白V对其进行监测。垂死细胞也吸收染料碘化丙啶。当碘化丙啶(PI)被插入DNA时其发出荧光。这些试验监测处于细胞死亡的特定阶段的细胞。例如，死亡的和DNA已被破坏以及呈小碎片使得其不再吸收PI的细胞是死亡的，但不再视为PI阳性。

试验实施和条件

台盼蓝试验：在6孔板中的细胞上进行试验：将300,000个细胞铺板于3ml培养基中的6孔板的每个孔中。24小时后，添加DMSO载体或所指定化合物(体积的千分之一)。将细胞再温育24小时，然后在0.25ml胰蛋白酶中收获，收获后0.75ml培养基。将细胞离心分离(spun down)并再悬浮于细胞沉淀上方剩余的100-200μl培养基中(通过上下吸移几次使细胞再悬浮)。将10μl加入10μl的台盼蓝中。然后将10μl插入计数载玻片。将载玻片插入Fisher TC20后，自动计数(由于台盼蓝阳性细胞与台盼蓝阴性细胞的精确比例要求约200个细胞在仪器计数的场中，因此需要许多细胞)。

ALAMAR BLUE RAPTINAL试验：通常在50μl的培养基中，将细胞以4,000-10,000个细胞/孔(96孔板)铺板。约18小时后，向每个孔中再加入50μl包含2X所需最终浓度的测试化合物(C-105)的培养基。24小时后，加入Alamar Blue试剂并读取孔中的荧光(BMGPheraStar或Molecular Devices Spectra Max M3 Microplate Reader)。通过将raptinal处理的细胞的读数设置为100％死细胞，而将载体处理的细胞的读数设置为0％死细胞来确定相对死亡％。

流式细胞术(FITC)试验：将细胞接种在12孔板中(75,000个细胞/孔)，并使其粘附过夜。第二天，添加指定浓度的raptinal(阳性对照)、(-)-105、(±)-105和(+)-105，并使其在37℃下温育24小时(最终体积：1ml，0.1％DMSO)。温育后，收获细胞并将其再悬浮于350μl的与膜联蛋白V-FITC和PI染料预混的冷膜联蛋白结合缓冲液(10mM HEPES，140mM NaCl，2.5mM CaCl₂，pH 7.4)中。在BD Biosciences LSRII流式细胞仪上分析样品，并使用FSCExpress版本5-6进行数据分析。相对于DMSO处理的对照评估细胞死亡。

用于治疗靶点的细胞系：ERα阳性乳腺癌细胞

TDG和TDG-LUC(T47DERαD538G克隆1)：野生型ERα基因的两个副本都被转移性乳腺癌中所见的ERαD538G突变替代。这些细胞在没有雌激素的情况下生长，添加雌激素后其生长速率进一步适度增加。对z-OHT(三苯氧胺的活化型)和氟维司群//Faslodex/ICI 182，780具有实质性抗性。对z-OHT和氟维司群/ICI的抗性比ERαY537S细胞略弱。ERαD538G是转移性乳腺癌中最常见的单一突变。因此，这些细胞对于测试至关重要。(TDG-LUC)TDG细胞稳定转染以表达萤火虫荧光素酶。萤光素酶基因的转录由组成型活性CMV启动子驱动。

TYS和TYS-LUC(T47DERαY537S克隆4)：野生型ERα基因的两个副本都被转移性乳腺癌中所见的ERαY537S突变替代。在没有雌激素的情况下快速生长。没有通过雌激素的额外的生长刺激。对z-OHT和氟维司群/ICI具有实质性抗性。对当前药物的抗性比ERαD538G细胞略强。这是转移性乳腺癌中最致死性突变。(TYS-Luc)TYS细胞稳定转染以表达萤火虫荧光素酶。荧光素酶基因的转录由组成型活性CMV启动子驱动。

T47D：ERα阳性，需要雌激素来生长，对z-OHT和氟维司群/ICI敏感；亲本细胞系，广泛使用，但不如MCF-7细胞常见。与MCF-7细胞相比，T47D细胞中ERα的更低水平与实际乳腺癌中的ERα水平更为一致。部分测试T47D细胞，因为T47D细胞需要比表达突变ERα的两种细胞系更高浓度的BHPI来抑制增殖和杀死。

MCF-7(密歇根癌症基金会-7)：ERα阳性，最广泛使用的ERα阳性乳腺癌细胞系。雌激素极大地刺激其生长；对z-OHT和氟维司群/ICI敏感。

ECC-1：ERα阳性子宫癌细胞。

Caov3：抗药性ERα阳性卵巢癌细胞。BHPI阻断Caov-3细胞的生长，但不会杀死它们。这些细胞对三苯氧胺和氟维司群具有完全抗性，并对顺氯氨铂(cisplatin)和紫杉醇具有部分抗性。

用于测试毒性和脱靶效应的ERα阴性细胞

HeLα：这些是宫颈来源的ERα阴性细胞。最广泛使用的人类细胞系。

MDA-MB-231细胞：这些是ERα阴性细胞，并且是三阴性乳腺癌的最常见模型。高度转移性。使用这些细胞，因为在该项工作中，它们比大多数其他细胞系对非特异性生长抑制更敏感。因此，它们是对非特异性毒性的严格测试。

MCF-10A(密歇根癌症基金会-10A)：永生，但非致瘤，ERα阴性乳腺癌细胞系。

统计

除非另有说明，否则每个样品有至少3个生物重复(n＝3)。数据表示为重复的平均值±S.E.M。对于统计显著性的比较是用载体处理的细胞与用相同浓度的105、BHPI或其他化合物处理的细胞相比，其中P＜0.05、＊＊P＜0.01、＊＊＊P＜0.001均使用斯氏T检验。

药物制剂

本文所述的化合物可用于制备治疗药物组合物，例如通过将化合物与药学上可接受的稀释剂、赋形剂或载体结合。可将所述化合物以盐或溶剂化物的形式加入到载体中。例如，在化合物具有足够的碱性或酸性以形成稳定的无毒酸式盐或碱式盐的情况下，以盐的形式给予化合物可能是合适的。药学上可接受的盐的实例为与能形成生理上可接受的阴离子的酸所形成的有机酸加成盐，例如甲苯磺酸盐、甲磺酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐、丙二酸盐、酒石酸盐、琥珀酸盐、苯甲酸盐、抗坏血酸盐、α-酮戊二酸盐和β-甘油磷酸盐。还可以形成合适的无机盐，包括盐酸盐、卤化物、硫酸盐、硝酸盐、碳酸氢盐和碳酸盐。

药学上可接受的盐可使用本领域众所周知的标准方法获得，例如通过使具有足够碱性的化合物(例如胺)与合适的酸反应以提供生理上可接受的离子化合物。羧酸的碱金属(例如钠、钾或锂)盐或碱土金属(例如钙)盐也可通过类似方法制备。

本文所述式的化合物可配制成药物组合物，并以多种形式给予于哺乳动物宿主，例如人类患者。这些形式可特别适合于所选择的给药途径，例如口服或肠胃外给药，通过静脉、肌肉、局部或皮下途径。

本文所述的化合物可与药学上可接受的载体，例如惰性稀释剂或可吸收的可食用载体结合系统给药。对于口服给药，可将化合物封装在硬或软壳明胶胶囊中，压缩成片剂，或直接掺入患者饮食的食物中。化合物也可与一种或多种赋形剂结合，并以可吸收片剂、口含片剂、锭剂(troche)、胶囊剂、酏剂、悬浮剂、糖浆剂、糯米纸囊剂等形式使用。这样的组合物和制剂通常包含至少0.1％的活性化合物。所述组合物和制剂的百分比可以变化，并且可以方便地为给定单位剂型重量的约0.5％至约60％、约1％至约25％或约2％至约10％。此类治疗上有用的组合物中活性化合物的量可以使得可获得有效剂量水平。

片剂、锭剂、丸剂、胶囊剂等还可包含以下一种或多种：粘合剂，例如黄蓍胶、阿拉伯胶、玉米淀粉或明胶；赋形剂，例如磷酸二钙；崩解剂，例如玉米淀粉、马铃薯淀粉、海藻酸等；和润滑剂，例如硬脂酸镁。可以添加甜味剂，例如蔗糖、果糖、乳糖或阿斯巴甜；或调味剂，例如薄荷、冬青油或樱桃调味剂。当单位剂型为胶囊剂时，除上述类型的物质外，其还可包含液体载体，例如植物油或聚乙二醇。各种其他物质可作为包衣存在或以其他方式改变固体单位剂型的物理形式。例如，片剂、丸剂或胶囊剂可用明胶、蜡、虫胶或糖等包衣。糖浆剂或酏剂可包含活性化合物、蔗糖或果糖作为甜味剂，对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯作为防腐剂，染料和调味剂，例如樱桃或橙香料。用于制备任何单位剂型的任何物质应是药学上可接受的，并且在使用量上基本上无毒性。此外，可将活性化合物掺入缓释制剂和装置中。

所述活性化合物可通过输注或注射静脉内或腹腔内给予。活性化合物或其盐的溶液可在水中制备，任选地与无毒的表面活性剂混合。分散剂可在甘油、液态聚乙二醇、三醋汀或其混合物中或在药学上可接受的油中制备。在常规储存和使用条件下，制剂可包含防腐剂以防止微生物的生长。

适用于注射或输注的药物剂型可包括无菌水溶液、分散体或无菌粉末，其包含适于临时制备无菌可注射或可输注溶液或分散体的活性成分，任选地包囊于脂质体中。最终剂型在制造和储存条件下应是无菌的、流动的且稳定的。液体载体可以为溶剂或液体分散介质，其包含例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、液态聚乙二醇等)、植物油、无毒甘油酯和其合适的混合物。适当的流动性可例如通过形成脂质体、通过在分散体的情况下保持所需的粒度或通过使用表面活性剂来保持。防止微生物的作用可通过各种抗细菌剂和/或抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等来实现。在许多情况下，优选包括等渗剂，例如糖、缓冲液或氯化钠。可注射组合物的延长吸收可通过延迟吸收的试剂(例如单硬脂酸铝和/或明胶)来实现。

无菌注射溶液可通过将所需量的活性化合物与上文所列举的各种其他成分根据需要掺入适当的溶剂中，任选地随后进行过滤灭菌来制备。在用于制备无菌注射溶液的无菌粉末的情况下，制备方法可包括真空干燥和冷冻干燥技术，其产生活性成分外加存在于溶液中的任何其他所需成分的粉末。

对于局部给药，化合物可以纯形式给予，例如当它们为液体时。然而，通常期望以例如与皮肤病学上可接受的载体组合的组合物或制剂的形式将活性剂给予皮肤，所述载体可为固体、液体、凝胶等。

有用的固体载体包括细分的固体，例如滑石、粘土、微晶纤维素、二氧化硅、氧化铝等。有用的液体载体包括水、二甲基亚砜(DMSO)、醇、二醇或水-醇/乙二醇混合物，其中化合物可以有效水平溶解或分散，任选地借助于无毒表面活性剂。可以添加佐剂，例如芳香剂和另外的抗微生物剂，以优化给定用途的性能。所得的液体组合物可从吸收垫(absorbentpad)上给予，用于浸渍绷带和其他敷料(dressing)，或使用泵式或气溶胶喷雾器喷洒于患处。

增稠剂(例如合成聚合物、脂肪酸、脂肪酸盐和酯、脂肪醇、改性纤维素或改性矿物材料)也可与液体载体一起使用，以形成可涂抹的糊剂、凝胶、软膏剂、肥皂等，以直接施用于使用者的皮肤。

用于将活性剂递送至皮肤的皮肤病学组合物的实例是本领域已知的；例如，参见美国专利号4,992,478(Geria)、4,820,508(Wortzman)、4,608,392(Jacquet等人)和4,559,157(Smith等人)。这种皮肤病学组合物可与本文所述的化合物结合使用，其中所述组合物的成分可任选地被本文所述的化合物替代，或可将本文所述的化合物添加至组合物中。

本文所述的化合物的有用剂量可通过比较它们在动物模型中的体外活性和体内活性来确定。将小鼠和其他动物中的有效剂量外推给人类的方法是本领域已知的；例如，参见美国专利号4,938,949(Borch等人)。治疗所需的化合物或其活性盐或衍生物的量不仅随所选的具体化合物或盐变化，而且还随给药途径、正在治疗的病况的性质以及患者的年龄和病况变化，并且最终将由巡诊医生或临床医生决定。

然而，一般而言，合适的剂量为每日约0.5至约100mg/kg体重，例如每日约10至约75mg/kg体重，例如每日3至约50mg/kg接受者的体重，优选为6至90mg/kg/日，最优选为15至60mg/kg/日。

将所述化合物以单位剂型方便地配制；例如，每单位剂型包含5至1000mg、方便地10至750mg、最方便地50至500mg的活性成分。在一个实施方案中，本发明提供一种组合物，所述组合物包含以这种单位剂型配制的本发明的化合物。

所述化合物可方便地以单位剂型给予，例如每单位剂型包含5至1000mg/m²、方便地10至750mg/m²、最方便地50至500mg/m²的活性成分。所需剂量可方便地以单次剂量或适当间隔给予的分剂量表示，所述分剂量为例如每日两次、三次、四次或更多次亚剂量。所述亚剂量本身可进一步分为例如若干离散的松散间隔的给药。

所需剂量可方便地以单次剂量或以适当间隔给予的分剂量(例如以每日两次、三次、四次或更多次亚剂量)表示。所述亚剂量本身可进一步分为例如若干个离散的松散间隔的给药；例如从吹入器多次吸入或通过将多滴滴剂施用至眼中。

与BHPI相比，本文所述的化合物可以是有效的抗肿瘤剂并且具有更高的效力和/或降低的毒性。优选地，本发明的化合物比BHPI具有更强效力和更低毒性，和/或避免BHPI遇到的分解代谢的潜在位点，即，具有与BHPI不同的代谢谱。

本发明提供治疗哺乳动物癌症的治疗方法，其包括向患有癌症的哺乳动物给予有效量的本文所述的化合物或组合物。哺乳动物包括灵长类动物、人类、啮齿动物、犬、猫、牛、绵羊、马、猪、山羊、牛等。癌症是指任何各种类型的恶性肿瘤，例如结肠癌、乳腺癌、黑色素瘤和白血病，并且通常以不良细胞增殖为特征，例如不受控制的细胞生长、分化不足、局部组织侵袭和转移。

本发明的化合物治疗癌症的能力可通过使用本领域众所周知的试验来测定。例如，治疗方案的设计、毒性评估、数据分析、肿瘤细胞杀伤的定量以及使用可移植肿瘤筛查的生物学意义是已知的。此外，化合物治疗癌症的能力可使用如下所述的测试来测定。

以下实施例旨在说明上述发明，而不应解释为缩小其范围。本领域技术人员将容易地认识到，实施例表明许多可以实施本发明的其他方式。应当理解，在不脱离本发明范围的情况下，可以进行多种变化和修改。

实施例

实施例1.合成步骤。

一般信息：除非另有说明，否则所有试剂均从商业来源购买并且无需进一步干燥或纯化即可使用。将本文所用的溶剂通过活性氧化铝柱后干燥。所有反应均在氮气正压下于火焰干燥的玻璃器皿中进行。¹H NMR和¹³C NMR实验在Bruker冷冻探针上分别在500MHz和188MHz下进行。在CD₃OD中获得的光谱分别以¹H和¹³C NMR光谱的3.31ppm和49.00ppm为参考。NMR多重性记录为：s＝单峰，d＝双峰，t＝三重峰，q＝四重峰，m＝多重峰。除非另有说明，否则¹³C多重性均为单峰。

步骤A：向圆底烧瓶中装入所需的苯基溴化物(3.08mmol)，并将其溶解于THF(3.0mL)中。将反应混合物冷却至-78℃，并在10分钟内逐滴加入n-BuLi溶液(2.77mmol，1.7mL)。将反应搅拌1小时。在另一个烧瓶中，加入所需的靛红(1.54mmol)并将其溶解于THF(9.4mL)中。将该靛红溶液在10分钟内逐滴加入到反应容器中。将所得混合物在-78℃下搅拌1小时，温热至室温，然后搅拌1小时。将反应用水(10mL)淬灭。将溶液用乙酸乙酯萃取(3x)，并将合并的有机层经硫酸钠干燥，过滤并在真空中浓缩。使所得的油流过二氧化硅塞(洗脱溶剂梯度：10％EtOAc/己烷斜坡上升至100％EtOAc)。然后将洗脱的物质装入圆底烧瓶中，吹扫空气，置于氮气气氛下，并溶解于THF(15.4mL)中。将氟化四正丁基铵的溶液(5.4mL)加入反应容器中。搅拌16小时后，用1∶1的饱和氯化铵_水溶液∶水的溶液(30mL)淬灭反应。将溶液用乙酸乙酯萃取(3x)，并将合并的有机层经硫酸钠干燥，过滤，并在真空中浓缩。然后将所得的油通过柱色谱法纯化。

步骤B：向圆底烧瓶中装入所需的苯基溴化物(3.35mmol)，并将其溶解于THF(2.8mL)中。将反应混合物冷却至-78℃，并在10分钟内逐滴加入n-BuLi(2.79mmol，1.8mL)的溶液。将反应搅拌1小时。在另一个烧瓶中，加入所需的靛红(1.86mmol)，并将其溶解于THF(5.6mL)中。将该靛红溶液在10分钟内逐滴加入到反应容器中。将所得混合物在-78℃下搅拌1小时，温热至室温，然后搅拌1小时。将反应用水(10mL)淬灭。将溶液用乙酸乙酯萃取(3x)，并将合并的有机层经硫酸钠干燥，过滤并在真空中浓缩。使所得的油流过二氧化硅塞(洗脱溶剂梯度：10％EtOAc/己烷斜坡上升至100％EtOAc)。

步骤C：向圆底烧瓶中装入所需的叔醇(0.93mmol)和所需的苯酚(4.2mmol)，并将其溶解于二氯甲烷(4.7mL)中。然后将反应混合物置于冰浴中，然后逐滴加入三氟甲磺酸(TfOH，0.42mL)。从冰浴中移出反应容器，并在室温下搅拌1小时。然后将反应混合物倒入冰填充的碳酸氢钠中，并将水溶液用乙酸乙酯萃取(3x)。将合并的有机层经硫酸钠干燥，过滤，并在真空中浓缩。然后将所得的油通过柱色谱法纯化。

3-羟基-3-(4-羟基苯基)-7-甲基吲哚啉-2-酮(1)：利用通用步骤A，经过两个步骤以45％收率分离出1。¹H NMR(CD₃OD，500MHz)：δ7.19(d，J＝8.86Hz 2H)，7.10(d，J＝7.59Hz1H)，7.02(d，J＝7.46Hz 1H)，6.96(dd，J＝7.54Hz，7.49Hz 1H)，6.71(d，J＝8.72Hz 2H)，2.29(s，3H)。

¹³C NMR(CD₃OD，188MHz)：δ182.20，158.40，141.39，134.47，132.71，131.78，128.23，123.86，123.48，121.00，115.93，79.17，16.58。

3-(4-羟基苯基)-3-(4-甲氧基苯基)-7-甲基吲哚啉-2-酮(2)：利用通用步骤C，以83％收率分离出2。¹H NMR(CD₃OD，500MHz)δ：7.12(d，J＝8.93Hz，2H)，7.02(m，3H)，6.94(m，2H)，6.82(d，J＝6.82Hz，2H)，6.69(d，J＝8.74Hz)，3.74(s，3H)，2.30(s，3H)。

¹³C NMR(CD₃OD，188MHz)δ：182.87，160.24，157.71，140.70，135.73，135.65，134.26，130.58，130.54，130.38，124.48，123.51，121.02，116.02，114.64，63.36，55.67，16.81。

HRMS(ESI)：m/z对于C₂₂H₂₀NO₃[M+H]⁺计算值346.1443，实测值：346.1442。

3-羟基-3-(4-羟基苯基)-7-(三氟甲基)吲哚啉-2-酮(3)：利用通用步骤A，经过两个步骤以35％收率分离出3。¹H NMR(CD₃OD，500MHz)δ：7.54(m，1H)，7.43(d，J＝7.49Hz 1H)，7.19(m，3H)，6.74(d，J＝8.74Hz，2H)。

¹³C NMR(CD₃OD，188MHz)δ：181.60，158.73，140.54(q，J＝2.25Hz)，136.85，131.80，129.89，128.89，126.90(q，J＝4.6Hz)，125.16(q，J＝270.76Hz)，123.74，116.16，113.56(q，J＝33.17Hz)，77.66。

3-(4-羟基苯基)-3-(4-甲氧基苯基)-7-(三氟甲基)吲哚啉-2-酮(4)：利用通用步骤C，以82％收率分离出4。¹H NMR(CD₃OD，500MHz)δ：7.50(dd，J＝8.09Hz，0.62Hz，1H)，7.40(dd，J＝7.76Hz，0.64Hz，1H)，7.18(ddd，J＝8.08Hz，7.46Hz，0.87Hz，1H)，7.12(d，J＝8.87Hz，2H)，7.01(d，J＝8.76Hz，2H)，6.86(d，J＝8.87Hz，2H)，6.72(d，J＝8.75Hz 2H)，3.77(s，3H)。

¹³C NMR(CD₃OD，188MHz)δ：182.24，160.55，158.10，139.74(m)，137.85，134.73，133.30，130.98，130.50，130.49，125.72(q，J＝4.6Hz，125.23(q，J＝270.71Hz)，123.32，116.27，114.89，113.55(q，J＝33.50Hz)，62.12，55.72。

HRMS(ESI)：m/z对于C₂₂H₁₇NO₃F₃[M+H]⁺计算值400.1161，实测值：400.1154。

3-羟基-7-甲基-3-(4-(三氟甲氧基)苯基)吲哚啉-2-酮(5)：利用通用步骤B，经过两个步骤以68％收率分离出5。¹H NMR(CD₃OD，500MHz)δ：7.46(d，J＝8.83Hz 2H)，7.22(dd，J＝1.02Hz，8.98Hz，2H)，7.13(m，1H)，6.98(m，2H)，2.31(s，3H)。

¹³C NMR(CD₃OD，188MHz)δ：181.41，150.1(q，J＝1.6Hz)，141.55，141.46，134.03，132.19，128.67，124.13，123.4，121.90(q，J＝255.61Hz)，121.32，79.04，16.61。

3-(4-羟基苯基)-7-甲基-3-(4-(三氟甲氧基)苯基)吲哚啉-2-酮(6)：利用通用步骤C，以59％收率分离出6。¹H NMR(CD₃OD，500MHz)δ：7.30(d，J＝8.86Hz 2H)，7.20(m，2H)，7.08(m，1H)，7.03(d，J＝8.74Hz，2H)，6.99(m，2H)，6.72(d，J＝8.73Hz，2H)，2.31(s，3H)。

¹³C NMR(CD₃OD，188MHz)δ：182.00，158.02，149.56(q，J＝1.47Hz)，143.12，140.82，134.85，133.55，131.22，130.77，130.56，124.51，123.73，121.89(q，J＝255.61Hz)，121.78，121.32，116.23，63.49，16.82。

HRMS(ESI)：m/z对于C₂₂H₁₇NO₃F₃[M+H]⁺计算值400.1161，实测值：400.1163。

3-(4-羟基苯基)-3-(4-(三氟甲氧基)苯基)-7-(三氟甲基)吲哚啉-2-酮((±)-105)的合成：向圆底烧瓶中装入1-溴-4-(三氟甲氧基)苯(3.08mmol)并将其溶解于THF(3.0mL)中。将反应混合物冷却至-78℃，并在10分钟内逐滴加入n-BuLi溶液(2.77mmol，1.7mL)。将反应搅拌1小时。在另一个烧瓶中，加入所需的靛红(1.54mmol)并将其溶解于THF(9.4mL)中。将该靛红溶液在10分钟内逐滴加入到反应容器中。将所得混合物在-78℃下搅拌1小时，温热至室温，然后搅拌1小时。将反应用水(10mL)淬灭。将溶液用乙酸乙酯萃取(3x)，并将合并的有机层经硫酸钠干燥，过滤，并在真空中浓缩。向一个新的圆底烧瓶中装入粗叔醇和苯酚(6.95mmol)，并溶于二氯甲烷(7.7mL)中。然后将反应混合物置于冰浴中，然后逐滴加入三氟甲磺酸(TfOH，0.7mL)。从冰浴中移出反应容器，并在室温下搅拌1小时。然后将反应混合物倒入冰填充的碳酸氢钠中，并将水溶液用乙酸乙酯萃取(3x)。将合并的有机层经硫酸钠干燥，过滤并在真空中浓缩。然后将所得的油通过柱色谱法纯化。经过两个合成步骤以50％收率分离出(±)-105。

¹H NMR(CD₃OD，500MHz)δ：7.54(d，J＝7.95Hz，1H)，7.45(d，J＝7.48Hz，1H)，7.31(d，J＝8.91Hz 2H)，7.22(m，3H)，7.03(d，J＝8.85Hz，2H)，6.75(d，J＝8.80Hz，2H)。

¹³C NMR(CD₃OD，188MHz)δ：181.35，158.37，149.81(q，J＝1.78Hz)，142.17，139.84(q，J＝2.29Hz)，136.92，132.65，131.22，131.06，130.48，126.12(q，J＝4.58Hz)，125.15(q，J＝270.89Hz)，123.55，121.88(q，J＝255.84Hz)，122.01，116.48，113.77(q，J＝33.32Hz)，62.22。

HRMS(ESI)：m/z对于C₂₂H₁₄NO₃F₆[M+H]⁺计算值454.0878，实测值：454.0878。

(±)-105的手性分离：使用制备型手性HPLC分离(5μM纤维素-1，LC柱，250x 21.2mm，AXIA^TM Packed，等度：7％i-PrOH/己烷)将(±)-105分离为其相应的对映体。收集的馏分产生(-)-105(峰A)和(+)-105(峰B)：图5。该手性分离方法产生白色固体形式的(-)-105(对映体纯度＝＞99％，⁵⁸⁹[α]_CHCl3＝-14.6°(±0.1°))和白色固体形式的(+)-105(对映体纯度＝～98-99％，⁵⁸⁹[α]_CHCl3＝-13.8°(±0.1°))(参见实施例4)。对映体纯度测定通过分析型手性HPLC柱进行：IB-3(粒度3μM，尺寸：4.6mm x 100mm，分离方法，等度7.5％i-PrOH/己烷)(图6-8)。

6-氯-3-羟基-7-甲基-3-(4-(三氟甲氧基)苯基)吲哚啉-2-酮(7)：向反应容器中装入取代的苯胺(2.82mmol)、1M HCl(2.82mL)、水(18.8mL)、无水硫酸钠(16.92mmol)和盐酸羟胺(9.17mmol)。将混合物加热至沸腾，然后将水合氯醛作为一份加入。将反应在回流下保持40分钟，然后冷却至回流，并将水溶液用乙酸乙酯萃取(3x)。将合并的有机层经硫酸钠干燥，过滤并在真空中浓缩。然后将浓硫酸(3mL)加入到所得的残余物中。将该溶液加热至80℃保持20分钟，然后倒入冰中。将所得的含水混合物用乙酸乙酯萃取(3x)，并将合并的有机层经硫酸钠干燥，过滤，并在真空中浓缩。浓缩后获得的红棕色固体证明在大多数有机溶剂中难溶。

向一个新的反应容器中加入所需的苯基溴化物(3.08mmol)并将其溶解于THF(3.0mL)中。将反应混合物冷却至-78℃，并在10分钟内逐滴加入n-BuLi溶液(2.77mmol，1.73mL)。将反应搅拌1小时。在另一个烧瓶中，加入6-氯-7甲基靛红(1.54mmol)并将其溶解于THF(9.4mL)中。将该靛红溶液在10分钟内逐滴加入到反应容器中。将所得混合物在-78℃下搅拌1小时，温热至室温，然后搅拌1小时。将反应用水(10mL)淬灭。将溶液用乙酸乙酯萃取(3x)，并将合并的有机层经硫酸钠干燥，过滤，并在真空下浓缩。使所得的油流过二氧化硅塞(洗脱溶剂梯度：10％EtOAc/己烷斜坡上升至100％EtOAc)。

经过三个合成步骤以24％收率分离出7。¹H NMR(CD₃OD，500MHz)δ：7.46(d，J＝8.85Hz 2H)，7.23(d，J＝7.98Hz，2H)，7.10(d，J＝7.97Hz1H)，6.98(d，J＝8.02Hz，1H)，2.35(s，3H)。

¹³C NMR(CD₃OD，188MHz)δ：181.25，150.17(q，J＝1.83Hz)，143.14，140.98，136.68，132.74，128.63，124.53，124.40，121.88(q，J＝255.75Hz)，121.86，119.76，78.91，14.11。

HRMS(ESI)：m/z对于C₁₆H₁₁NO₃F₃ClNa[M+Na]⁺计算值380.0277，实测值：380.0284。

6-氯-3-(4-羟基苯基)-7-甲基-3-(4-(三氟甲氧基)苯基)吲哚啉-2-酮(8)：利用通用步骤C，以85％收率分离出8。¹H NMR(CD₃OD，500MHz)δ：7.30(d，J＝8.91Hz 2H)，7.21(m，2H)，7.10(d，J＝8.10Hz，1H)，7.02(m，4H)，6.73(d，J＝8.80Hz，2H)，2.35(s，3H)。

¹³C NMR(CD₃OD，188MHz)δ：181.81，158.16，149.67(q，J＝2.02Hz)，142.6，142.38，135.34，133.50，133.10，131.18，130.47，125.48，124.12，121.89(q，J＝255.49Hz)，121.8，119.66，116.35，63.45，14.30。

HRMS(ESI)：m/z对于C₂₂H₁₆NO₃F₃Cl[M+H]⁺计算值434.0771，实测值：434.0764。

105的对映体的分离：使用制备型手性HPLC分离法(5μM纤维素-1，LC柱，250x 21.2mm，AXIA^TM Packed，等度：7％i-PrOH/己烷)将105的外消旋混合物分离为相应的对映体(图5)。收集的馏分产生(-)-105(峰A)和(+)-105(峰B)。该手性分离方法产生白色固体形式的(-)-105(对映体纯度＝＞99％，[α]＝-134)和白色固体形式的(+)-105(对映体纯度＝98-＞99％，[α]＝未确定)。对映体纯度测定通过分析型手性HPLC柱进行：IB-3(粒度3μM，尺寸：4.6mm x 100mm，分离方法，等度7.5％i-PrOH/己烷)。化合物(-)-105沿负方向弯曲光([α]值)。图6是定量手性HPLC曲线，显示了以大约相等的浓度存在的(±)-105的分离峰。图7显示了分离后活性(-)-105峰是高纯的。图8显示了分离后非活性(+)-105峰也是纯的。由于在该制备中存在微量的活性(-)-105，并且由于(-)-105的显著效力，因此在极高的浓度下(+)-105可能表现出某些活性。

实施例2.化合物105的癌细胞死亡研究。

异种移植的实验内容：将TYS-Luc细胞(Matrigel中5,000,000个细胞)注入切除卵巢的雌性NSG(SCID)小鼠(Jackson实验室)的上部乳腺脂肪垫中。10周后，在第0天，出现大肿瘤(尺寸范围：100-600mm³)。使用用于溶解(-)-105或(-)-105的载体以每日40mg/kd通过皮下注射治疗小鼠。为了对肿瘤进行生物发光成像(BLI)，将小鼠用异氟烷麻醉，并将萤光素酶底物Lucerfin注入小鼠体内。通量，即一秒钟内撞击检测器的光子总数使用IVIS(体外成像系统)进行测量。显示的是包含每个肿瘤的整个区域的通量(以每秒百万个单位计)，或者当肿瘤很小或无法检测到时的等效区域的通量，以及每次进行测量(第0天、第3天、第1周、第2周、第3周)的肿瘤尺寸变化百分比。然后停止治疗，并在两周后进行另一项测量。注意，也用卡尺测量了肿瘤。由于一些肿瘤不会突出太多，因此其精确度远低于BLI。三天后，所有(-)-105肿瘤均已减少至使用卡尺无法检测。

图1显示了(±)-105对ERα阳性和ERα阴性人类癌细胞的剂量反应效果，从而证明抗癌活性。将ERα阳性MCF-7乳腺癌细胞、Caov-3卵巢癌细胞和ECC-1子宫癌细胞以及ERα阴性MDA-MB-231人类乳腺癌细胞和人类宫颈癌细胞HeLa和MCF-10A人乳腺上皮细胞以10,000个细胞/孔(96孔板)铺板于50μl培养基中。约18小时后，向每个孔中再加入50ul包含2X所需最终浓度的测试化合物(C-105)的培养基(最终体积100ul/孔)。24小时后，加入AlamarBlue试剂，并在1小时后读取孔中的荧光(BMG PheraStar Microplate Reader)。通过将10,000nM raptinal处理的细胞的读数设置为100％死细胞，而将载体处理的细胞的读数设置为0％死细胞来确定相对死亡％。(数据是3次独立实验的平均值±SEM，其中每个独立实验中每个样品有5个生物学重复。)

图2显示了比较BHPI和(±)-105杀死ERα阳性T47D细胞的能力的剂量反应。将人类乳腺癌细胞T47D以75,000个细胞/孔铺板。第二天，加入DMSO载体、10μm raptinal(100％细胞死亡的对照)，或0、50、100、500和1,000nM的BHPI或(±)-105，或1,000nM ICI/氟维司群或1,000nM OHT。24小时后，使用V-FITC和碘化丙啶染料通过FACS来测定活细胞。(n＝3独立实验±SEM)。该流式细胞术实验(检测死细胞)的结果表明(±)-105具有细胞毒性而非细胞生长抑制性。然而，化合物OHT、ICI和BHPI均具有基于低观察活性的细胞生长抑制性。在该试验中观察到的(±)-105的活性类似于阳性对照raptinal，raptinal是一种也可定量杀死癌细胞的化合物(另请参见图36A)。

图3比较了(±)-105杀死ERα阳性和ERα阴性细胞的能力。剂量反应测试了(±)-105快速杀死ERα阳性和ERα阴性细胞的能力。细胞系：ERα阳性乳腺癌：T47D，MCF-1TYS(Y537S)；子宫内膜：ECC-1；ERα阴性细胞系：乳腺MDA-MB-231；黑色素瘤：OMM1，A375；肺：H3122；结肠：HT-29；成纤维细胞：HFF-1。铺板4,000-8,000个细胞/孔。第二天，以0-10,000nM的浓度加入(±)-105。24小时后，加入Alamar Blue试剂并读取孔中的荧光。通过将1,000nM raptinal处理的细胞的读数设置为100％死细胞，而将载体处理的细胞的读数设置为0％死细胞来确定相对死亡％。(n＝3±SEM)。这些结果表明外消旋化合物105对ERα阳性癌细胞系具有选择性；在图36F中也用对映体纯的(-)-105证明。

图4A说明了如何测定细胞死亡的IC₅₀。4B测试了BHPI、(-)-105和01-15的杀死能力。4C显示了当口服给药时(-)-105是有效的。在免疫抑制的NSG小鼠中，允许TYD-Luc细胞(T47DERαD538G-荧光素酶人类乳腺癌细胞)的大的原位乳腺肿瘤4个月形成。仅用载体(载体)、以经口喂食40mg/kg(-)-105(口服)、或每日注射40mg/kg(-)-105(注射)治疗小鼠3天。肿瘤通过使用荧光素酶的生物发光成像来可视化。虚线表示-100％；肿瘤退缩至无法检测。因此，该结果表明(-)-105优于BHPI和01-15。

图9显示了105的(-)对映体是活性的，而(+)对映体是非活性的。每孔铺板75,000个ERα阳性T47D人类乳腺癌细胞。第二天，DMSO载体、10μm raptinal(100％细胞死亡的对照)或100、500和1,000nM的(+)-105或(-)-105。24小时后，使用V-FITC和碘化丙啶染料通过FACS测定活细胞。(n＝1)。

图10显示了(-)-105诱导MCF-7细胞的剂量依赖性死亡；(+)-105是非活性的。每孔铺板75,000个ERα阳性T47D人类乳腺癌细胞。第二天，添加DMSO载体、10μm raptinal(100％细胞死亡的对照)或1-500nM的(-)-105或1,000nM(+)-105或1,000nM(±)-105。24小时后，使用V-FITC和碘化丙啶染料通过FACS测定活细胞。(n＝3独立实验±SEM)。

图11显示了通过BHPI和通过C-105的活性(-)-105对映体杀死T47D-Luc细胞的剂量反应。台盼蓝细胞死亡试验用于比较C-105的活性(-)-105对映体和BHPI杀死雌激素受体α(ERα)阳性T47D，即表达荧光素酶的人类乳腺癌细胞(T47D-Luc细胞)的能力。将300,000个T47D-Luc细胞/孔于10％FBS中铺板于6孔板中，共3个重复。铺板后24小时，将指定浓度的C-105的活性(-)对映体[(-)-105]或BHPI或载体[Veh]加入到细胞中。24小时后，收获细胞，并使用Countess II自动血细胞计数器通过自动化台盼蓝排除法测定死细胞％。活细胞的百分比通过100-(细胞死亡％)来计算。(n＝3±SEM)。

图12显示了(-)-105在杀死MCF-7和TYS-Luc细胞方面的剂量反应优于BHPI。台盼蓝细胞死亡试验用于评估105(-)的活性对映体[(-)-105]杀死ERα阳性MCF-7和TYS-Luc人类乳腺癌细胞的能力。将300,000个T47D细胞/孔于10％FBS中铺板于6孔板中，共3个重复。铺板后24小时，加入指定浓度的BHPI或C-105的活性对映体105(-)[(-)-105]。24小时后，收获细胞，并使用Countess II自动血细胞计数器通过自动化台盼蓝排除法测定死细胞％。活细胞的百分比通过100-(细胞死亡％)来计算。(n＝3±SEM)。

图13显示了(-)-105在杀死TDG-Luc细胞方面的剂量反应研究优于BHPI和当前的内分泌治疗。在顶部图中，剂量反应表明(-)-105在杀死TDG-Luc细胞方面优于BHPI。左下图表明当前的内分泌治疗、ICI/氟维司群/Faslodex和z-4-羟基三苯氧胺(三苯氧胺的活化型)不会杀死TDG-Luc细胞。右下图表明(+)-105对映体是非活性的，并且不会杀死TDG-luc细胞。台盼蓝细胞死亡试验用于评估C-105的活性对映体[(-)-105]杀死ERα阳性TDG-Luc细胞的能力。对于所有研究，将300,000个TDG-Luc细胞/孔于10％FBS中铺板于6孔板中，共3个重复。铺板后24小时，添加指定浓度的(-)-105的活性对映体或BHPI(顶部)ICI或OHT(左下)或(+)-105(右下)。24小时后，收获细胞，并使用Countess II自动血细胞计数器通过自动化台盼蓝排除法测定死细胞％。活细胞的百分比通过100-(细胞死亡％)来计算。(n＝3±SEM)。

图14显示了通过(-)-105杀死癌细胞的IC₅₀。细胞系：ERα阳性乳腺癌：T47D，MCF-7TYS(T47D Y537S)TDG(T47D D538G)，BT-474；ERα阴性MDA-MB-231乳腺癌细胞；将6,000个细胞/孔铺板(96孔板)于100μl的培养基中。将每个孔中DMSO浓度调节至1％。以0-100,000nM浓度加入(-)-105。24小时后，加入Alamar Blue试剂(10μl的0.1mg/ml)。2-4小时后，读取孔中的荧光(λ_ex：555nM，λ_em：585nM，Spectra Max M3 Plate reader)。通过将10,000nMraptinal处理的细胞的读数设置为100％死细胞，而将载体处理的细胞的读数设置为0％死细胞来确定相对死亡％。(n＝3±SEM)。

图15显示了长期实验，其中(-)-105而非BHPI杀死100％的TYS-Luc细胞。为了模拟小鼠异种移植中治疗肿瘤几周的效果，进行了长期细胞培养实验。将TYS-Luc细胞(T47DERαY537S-Luc细胞；ERαY537S是转移性乳腺癌中所见的最致死性ERα突变)以4,000个细胞/孔铺板于96孔板中。将细胞首先在包含DMSO载体、1μM C-105的非活性(+)对映体、1μM BHPI或1μM的C-105的活性(-)对映体的培养基(治疗)中保持2周。2周后(每2天更换一次培养基)，使用MTS和TYS-Luc细胞的吸光度对细胞数的标准曲线测定细胞数。注意：(i)条表示实验的BHPI和(-)-105臂。在再生长期间没有药物存在。(ii)由于吸光度值极低，因此MTS试验无法准确定量少于200个细胞/孔(iii)分离后，非活性对映体仍包含～1-2％活性对映体；因此，当以1,000nM的高浓度使用时，其保留了一些活性。另一组类似处理的孔不使用MTS进行试验，并在用PBS洗涤4次后，将其置于包含10％cd-FBS的无雌激素培养基中4周(每两天更换一次培养基)(再生长)。这使得任何存活的细胞再生长。4周后，使用MTS分析细胞。值得注意的是，用活性(-)C-105处理的细胞没有再生长，而BHPI处理的细胞强劲再生长。(注意：对孔目视检查确认用活性(-)-105处理2周的孔中没有细胞。)为了测试BHPI处理后再生长的细胞是否对BHPI有抗性，将它们重新处理另一个周期(BHPI再治疗)，并显示出对BHPI杀死保持敏感性。(n＝8生物学重复±SEM)。

图16显示了模拟治疗的长期实验，其中(-)-105而非BHPI根除致死性治疗抗性乳腺癌细胞。细胞：MCF-7Y537S(MCF-7ERαY537S荧光素酶(源自MCF-7人类乳腺癌细胞。MCF-7细胞是最广泛的人类乳腺癌细胞系。这是转移性乳腺癌中最致死和第二常见的突变。)实验条件与图15中的图例相同。(+)-105对映体是非活性的。

图18显示了(-)-105杀死对BHPI杀死具有抗性的乳腺癌细胞。通过克隆生长选择包含能在1μM BHPI中存活的含ERα的T47D人类乳腺癌细胞的。评估了100nM和1μM BHPI以及(-)-105对(BHPI敏感)亲本T47D细胞和部分BHPI抗性T47D克隆1、3、8和11的生长的影响。铺板4,000个细胞/孔。细胞数是通过MTS试验由吸光度对细胞数的标准曲线确定。结论：BHPI阻断生长并杀死许多T47D细胞，而(-)-105杀死所有T47D细胞。BHPI抑制生长，但不能阻止抗性克隆的生长；(-)-105完全阻断抗性克隆的生长，并将其细胞数减少至低于4,000个细胞/孔的原始细胞数。因此，在4天内(-)-105杀死部分但非全部抗性细胞。

关于-105用于预期的未折叠蛋白反应(UPR)的作用机制，图19显示了(-)-105有效诱导剪接的XBP-1mRNA的形成。ERα阳性T47D-荧光素酶人类乳腺癌细胞在载体(Ctl，对照)、100nm BHPI或100nM(-)-105中保持指定的时间。在所指定的时间分离RNA，并通过qRT-PCR定量sp-XBP1 mRNA的水平。(n＝3±SEM)。UPR的(-)105或BHPI激活会激活UPR传感器IRE1α，从而导致非活性XBP1 mRNA裂解成活性剪接的(sp)-XBP1 mRNA。

增加的sp-XBP1 mRNA是广泛使用的未折叠蛋白反应(UPR)激活的标记。因此，(-)-105是比BHPI强得多的sp-XBP1的UPR超激活剂和诱导剂。

图20显示了(-)-105而非BHPI诱导新蛋白合成的近定量抑制。用1,000nm BHPI或1,000nM(-)-105处理ERα阳性Caov-3人类卵巢癌细胞指定的时间。用³⁵S-蛋氨酸(methionine)短暂标记细胞。在小型Whatman硬化无灰过滤器中通过三氯乙酸沉淀和捕获的沉淀的蛋白质(而非游离氨基酸)来确定标记的³⁵S-蛋氨酸掺入蛋白质中。用碱将过滤器中的蛋白质溶解并用酸中和后，将样品在液体闪烁计数器中计数。显示的是与0时间样品相比蛋白质合成的平均(n≥3)抑制百分比。(-)-105对蛋白质合成的近乎定量抑制与(-)-105诱导UPR的PERK臂的致死性过度激活相一致。即使是未生长的细胞也在不断地降解蛋白质并形成新蛋白质。几乎所有(＞90％)蛋白质合成被抑制的细胞无法生长并最终会死亡。

图21显示了使用2-APB阻断钙从内质网的流出抑制(-)-105-诱导的癌细胞死亡。ERα阳性MCF-7和TYS-Luc用DMSO载体(Veh)或BHPI或(-)-105加或减2-APB处理指定的时间。使用基于仪器的台盼蓝排除试验测定细胞死亡。在30分钟时，2-APB几乎完全阻断(-)-105-诱导的细胞死亡并在45分钟和60分钟时其部分阻断细胞死亡。这与(-)-105诱导预期的UPR路径的强有力的致死性激活相一致。(n＝3±SEM)。

图22显示了-105降低细胞内ATP水平；该ATP水平的降低通过用毒胡萝卜素灭活SERCA泵而阻断。TYS-Luc细胞在包含和不含10,000nM毒胡萝卜素(THG)的情况下保持在DMSO载体(Veh)、1,000nM BHPI、1,000nM-105指定的时间。使用试剂盒测定ATP水平，并且相对ATP水平来自标准曲线。注意，在1小时时，THG完全阻断-105-诱导的细胞内ATP水平的下降。(n＝3±SEM)。

图23显示了用毒胡萝卜素阻断ATP水平的下降抑制-105诱导的细胞死亡。TYS-Luc细胞在包含或不包含毒胡萝卜素(THG)的情况下在DMSO载体(Veh)或BHPI或(-)-105中保持指定的时间。用THG阻断ATP水平的下降(图19)抑制了(-)-105-诱导的细胞死亡。注意，当存在THG时，在1小时时对细胞(-)-105-诱导的细胞死亡具有很强的抑制作用。(n＝3±SEM)。

实施例3.与105相关的化合物的其他数据。

图24显示了测试化合物和BHPI杀死TDG细胞的能力的比较。将TDG细胞与75nM的BHPI或75nM的每种所指定的测试化合物：4、6和(±)-105(对映体未分离)温育24小时。使用基于仪器的台盼蓝排除试验测定细胞死亡。结构在合成部分中。结论：与BHPI相比，化合物4和105表现出极大增强的杀死TDG细胞的能力。(n＝3±SEM)。

图25显示了测试化合物和BHPI杀死TYS细胞的能力的比较。将TYS细胞与35nM的BHPI或35nM的每种所指定的测试化合物：2、4和105温育24小时。使用基于仪器的台盼蓝排除试验测定细胞死亡。(n＝3±SEM)。因此，与BHPI相比，化合物4和105表现出极大增强的杀死TYS细胞的能力。

图26显示了测试化合物4、6、105和BHPI杀死TYS细胞的能力的比较。将TYS细胞与50nM的BHPI或50nM的每种所指定的测试化合物：4、6和105温育24小时。使用基于仪器的台盼蓝排除试验测定细胞死亡。(n＝3±SEM)。因此，与BHPI相比，化合物4和105表现出增强的杀死TYS细胞的能力。

图27显示了测试化合物和BHPI杀死T47D细胞的能力的比较。将T47D细胞与75nM的BHPI或75nM的每种所指定的测试化合物：4和6温育24小时。使用基于仪器的台盼蓝排除试验测定细胞死亡。(n＝3±SEM)。因此，化合物4显示出极大增强的杀死包含野生型雌激素受体的乳腺癌细胞的能力。

在图28中，测试化合物和BHPI均未杀死非致瘤ERα阴性MCF-10A乳腺细胞。ERα阴性MCF-10A细胞在DMSO载体或75nM的BHPI或75nM的每种所指定的测试化合物：4、6和105中保持24小时。使用基于仪器的台盼蓝排除试验测定细胞死亡。(n＝3±SEM)。因此，在75nM时，BHPI和任何测试化合物均不会诱导ERα阴性MCF-10A细胞的明显死亡。

图29显示了对测试化合物和BHPI杀死T47D细胞的能力的评估。将T47D细胞用100nM BHPI或用100nM的每种测试化合物：6、8和105处理24小时(n.s.不显著)。使用基于仪器的台盼蓝排除试验测定细胞死亡。(n＝3±SEM)。因此，与BHPI相比，化合物105显示出增强的杀死T47D细胞的能力。

图30比较了BHPI和测试化合物抑制T47D、TYS和TDG细胞增殖的能力。T47D细胞在包含10FBS(含有雌激素)的培养基中，TYS-4和TDG-1细胞在包含10％cd-FBS(雌激素耗尽)的培养基中。将细胞以2,000个细胞/孔铺板于96孔板中。在包含FBS或活性炭-右旋糖酐处理的FBS(内源性雌激素耗尽)的培养基中24小时后，添加指定浓度的每种化合物(在DMSO中以培养基体积的1/1000)。2天后，更换培养基，并再次添加化合物。再过2天(总共4天)后，MTS试验用于评估细胞增殖。(n＝6±S.E.M.)。因此，BHPI和新化合物有效地抑制T47D、TYS-4和TDG-1细胞的增殖。数据表明，化合物2、4、6和105在杀死这些ERα阳性乳腺癌细胞方面比BHPI更有效。

其他数据示于图31和图33-43中。通过药物化学运动，发现(±)-1显示出意想不到的细胞毒性表型(图36A)。所有已知的雌激素受体α(ERα)的靶向治疗均具有细胞生长抑制作用，这意指它们仅阻止细胞生长并不会杀死癌细胞。制备型手性柱色谱法提供了通过旋光法鉴定为(-)-105和(+)-105的对映体纯物质(实施例4)的可能。化学衍生化和x射线晶体学进一步表征了具有(R)-构型的活性对映体和具有(S)-构型的非活性对映体(方案5)。生物学数据(图36B和实施例4)表明，(R)-1对ERα阳性细胞(MCF-7)具有细胞毒性，而在ERα阴性细胞(MDA-MB-231)中观察到的作用极小。因此，该化合物被重命名为选择性雌激素受体杀手的SERK-F6，其中该版本具有六个氟。针对ERα的一组癌细胞系(图36C和图37A)测定了SERK-F6的剂量依赖性活性。

细胞毒性治疗的一个重要方面是定量杀死细胞群体的能力。

SERK-F6在快速24小时结晶紫试验(图36D)和长期细胞培养实验(图36E-F和图37B)中定量杀死ERα细胞系。SERK-F6通过预期的未折叠蛋白反应(UPR)激活而杀死(图38)。该机制的重要标记是剪接的XBP1(sp-XBP1)水平升高(图38A)，细胞ATP水平快速降低(图38B)和蛋白质合成的快速抑制(图38C)。

在小鼠中测量了SERK-F6的药物代谢动力学(图40A-B)。其他研究表明SERK-F6是血脑屏障渗透剂(图40C-D)。另外，SERK-F6的长期治疗不会消融ERα组织，如通过循环雌二醇水平所测量的(图40E)。这些数据表明，SERK-F6可在体内达到生物学上相关浓度并具有良好的耐受性。

为了探测SERK-F6杀死ERα阳性肿瘤的功效，生长出大的MCF-7肿瘤，然后进行干预治疗。SERK-F6治疗导致显著的肿瘤退缩(图39A和图40F-G)。由于当前的治疗(即氟维司群，Fulv.)具有细胞生长抑制作用，因此无法获得针对这些大的且确定的肿瘤的显著效果。此外，在研究期间，每日SERK-F6治疗并未导致小鼠体重的任何变化，从而证明了SERK-F6在体内的耐受性(图40H)。此外，为了证明SERK-F6的体内作用机制，将MCF-7肿瘤移植到小鼠中，然后用SERK-F6治疗。然后在完全肿瘤根除之前处死小鼠。该数据表明随着P-PERK和P-eiF2alpha水平的增加，UPR的激活(图39B-E和图40I-J)。

由于导致组成性激活和治疗抗性的ERα突变代表临床挑战，因此这证明了SERK-F6也可应对这些抗性肿瘤。因此，SERK-F6以剂量依赖性方式和多次剂量给药(即腹腔注射和口服给药)根除Y537S肿瘤(即TYS细胞系)，并且也是耐受的(图41A-D和图42B-C)。治疗停止后，肿瘤没有再生长，表明完全的肿瘤根除(图42A)。使用较低的亚治疗剂量的SERK-F6(即10mg/kg口服)，肿瘤确实再生长，但用较高剂量的SERK-F6对这些肿瘤的再治疗表明，这些再生长的肿瘤仍对SERK-F6敏感，并且不具有抗性(图42D)。该结果表明完全的细胞杀死对于根除癌症的重要性。SERK-F6治疗还导致D538G突变肿瘤(TDG细胞系)的消灭(图41D-E)。SERK-F6治疗在较高剂量下再次是耐受的(图42E)，并且足以根除肿瘤(图42F)。虽然较低的剂量不会完全根除肿瘤，但用较高剂量的SERK-F6再治疗这些肿瘤会使肿瘤退缩(图42G-H)。

为了证实不仅仅是在T47D背景细胞系(TYS和TDG)中观察到肿瘤退缩，用SERK-F6对MCF-7细胞的ERα蛋白中的Y537S或D538G突变(分别为MYS和MDG细胞)进行处理。观察到显著的肿瘤退缩(图41F-G和图43A-D)。再次，较高剂量对于完全的肿瘤反应是必需的，而较低剂量导致非抗性肿瘤生长(图43B-D)。SERK-F6治疗也根除转移性肿瘤负荷(图41I)。

实施例4.化合物1(105)的对映体的绝对构型和IC50的测定。

种类	IC<sub>50</sub>(nM)	S.E.M.
			(±)-1	42.6	1.9
(R)-1	20.3	0.9
			(s)-1	＞1000	-

(±)-1的制备型克量级手性分离产生具有相反旋光性的纯对映体(R)-1和(S)-1(方案5)。(±)-1、(R)-1和(S)-1针对MCF-7细胞的IC₅₀值显示(R)-1为活性物质，称为SERK-F6。温育24小时后，利用Alamar blue荧光试验且已标准化为活体和死亡对照(经载体和raptinal处理)而获得数值。(S)-1IC₅₀＞1μM。误差显示为S.E.M。

方案5.获得可结晶的(R)-1和(S)-1衍生物的合成顺序：(R)-2和(S)-2的结构的X射线测定。

实施例5.药物剂型。

以下制剂说明可用于治疗性或预防性给予本文所述式的化合物、本文具体公开的化合物或其药学上可接受的盐或溶剂化物(下文称为“化合物X”)的代表性药物剂型：

这些制剂可通过制药领域众所周知的常规方法制备。应理解，可以根据公知的制药技术改变上述药物组合物以适应不同量和类型的活性成分“化合物X”。气雾剂制剂(vi)可与标准的计量剂量气溶胶喷罐一起使用。此外，特定成分和比例是出于说明目的。根据目的剂型的所需性质，可以将成分交换为合适的等同物，并且可以改变比例。

尽管上文已参考所公开的实施方案和实施例描述了具体实施方案，但这样的实施方案仅是说明性的，并不限制本发明的范围。本领域普通技术人员可以进行变化和修改，而不会脱离所附权利要求书中所限定的更宽范围内的本发明。

所有出版物、专利和专利文献均通过引用的方式纳入本文，就像通过引用的方式将其单独纳入一样。不应由此理解与本公开不一致的限制。已参考各种具体和优选的实施方案和技术描述了本发明。然而，应理解，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可以进行许多变化和修改。