基于自组装的电荷反转型核/壳药物载体、其制备方法及应用
阅读说明：本技术 基于自组装的电荷反转型核/壳药物载体、其制备方法及应用 (Charge reversal type core/shell drug carrier based on self-assembly, preparation method and application thereof ) 是由 张蓬 李琳 郭妍 孙考祥 于 2020-11-23 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种基于自组装的电荷反转型核/壳药物载体、其制备方法及应用。以壳聚糖衍生物为负电性外壳,以PAMAM@DOX为正电性内核,以CMCS为中间分子,基于静电作用自组装构建核/壳药物载体并用于HepG2肝癌细胞药效学评价。该纳米复合物在正常生理环境荷负电,提高肿瘤靶向和高效肿瘤富集；到达肿瘤组织后,实现“由负到正的电荷反转”。联合乳糖酸的主动靶向作用,增加细胞摄取；在内含体/溶酶体酸性环境下,纳米复合物重新暴露PAMAM@DOX内核,并发挥“质子海绵效应”以细胞膜亲和作用,诱导溶酶体逃逸,实现高效的抗肿瘤效果。通过体内外活性评价,证明了该纳米复合物优于单一DOX输运,能够显著提高药物抗癌活性,具有明确的增强治疗效果。(The invention discloses a charge reversal type core/shell drug carrier based on self-assembly, and a preparation method and application thereof. The chitosan derivative is used as a negative electric shell, PAMAM @ DOX is used as a positive electric core, CMCS is used as an intermediate molecule, and a core/shell drug carrier is constructed by self-assembly based on electrostatic interaction and is used for HepG2 hepatoma cell pharmacodynamics evaluation. The nano-composite is negatively charged in a normal physiological environment, so that the tumor targeting and efficient tumor enrichment are improved; upon reaching the tumor tissue, "charge reversal from negative to positive" is achieved. In combination with the active targeting effect of lactobionic acid, cellular uptake is increased; under the acidic environment of an inclusion body/lysosome, the nano compound re-exposes the PAMAM @ DOX inner core, exerts a proton sponge effect to perform a cell membrane affinity effect, induces lysosome escape and realizes a high-efficiency anti-tumor effect. In-vivo and in-vitro activity evaluation proves that the nano compound is superior to single DOX (DOX) transport, can obviously improve the anticancer activity of the medicine, and has definite enhanced treatment effect.)
技术领域
本发明涉及具有pH响应性、肿瘤细胞靶向性的核/壳药物载体，尤其涉及一种基于自组装电荷反转型核/壳药物载体，本发明还涉及所述药物载体的制备方法以及应用方法。属于药物载体、其制备方法及其应用技术领域。
背景技术
癌症(即恶性肿瘤)已经成为人类健康的严重威胁之一。根据世界卫生组织的数据报告，2018年全球恶性肿瘤死亡人数约960万人，是全球第二大死亡原因。
大部分肿瘤治疗药物在体内的非特异性组织分布及快速肾清除率，使得许多本应有效的肿瘤治疗药物无法达到理想的效果。纳米药物载体利用其独特的化学结构和尺寸效应，能够有效调控化疗药物的体内分布过程和起效方式，改变药物在肿瘤组织的分布与蓄积，改善药物的细胞摄取与释放行为，为化疗药物的肿瘤治疗提供了新的机遇。
纳米药物载体的体内递送要经过多个步骤，如纳米载体需要通过血液循环、肿瘤部位富集、肿瘤穿透、肿瘤细胞摄取和肿瘤细胞内释放药物等。然而，每个阶段对纳米载体的要求并不相同，且有时存在矛盾，譬如血液循环与细胞摄取两个阶段存在的“PEG和电荷”矛盾、血液循环与肿瘤穿透之间的“尺寸”矛盾以及细胞外药物保留与细胞内药物释放之间的“稳定性”矛盾等等。
表面电荷反转药物载体，即由亲水性“隐秘”聚合物修饰的中性或负电荷纳米药物载体在血液循环中荷负电，避免网状内皮系统清除，提高药物稳定性和有效肿瘤富集；在肿瘤部位，响应肿瘤微环境(如微酸性、酶异常或氧化还原环境等)，刺激药物载体结构发生变化，进而改变自身性能，发生电荷反转，整体荷正电，从而增强与细胞的亲和力，提高纳米药物载体的肿瘤渗透、细胞摄取以及靶向亚细胞能力。
目前，实现电荷反转的途径主要分为两种，一种是通过自身结构的质子化/去质子化过程来实现电荷反转；另一种途径是发生部分化学键的断裂，脱去电荷屏蔽层，从而裸露之前被屏蔽的正电性结构来实现电荷反转。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是，提供一种基于自组装的电荷反转型核/壳药物载体、其制备方法及应用，克服纳米药物载体在药物输送中面临的多重递送屏障，实现更加高效的靶向药物递送及胞内药物释放，已达到改善药物抗肿瘤效果的目的。
本发明采用以下技术方案：
基于自组装的电荷反转型核/壳药物载体，其特征在于采用如下质量比例的原料制备而成：负电性壳聚糖衍生物CS-LA-DMMA 100份，正电性内核[email protected]质量为100～1000份，羧甲基壳聚糖中间分子CMCS 400-600份；
其中，负电性壳聚糖衍生物CS-LA-DMMA的化学结构式如下：
优选地，所述的负电性壳聚糖衍生物的制备反应式如下：
优选地，所述的负电性壳聚糖衍生物(即CS-LA-DMMA)合成方法如下：分子量为2000-500000的壳寡糖通过酰胺反应交联特异性亲和ASPGR的靶向分子乳糖酸，合成CS-LA；CS-LA通过酰胺反应交联pH敏感电荷反转基团DMMA，合成CS-LA-DMMA。
所述的正电性内核[email protected](即[email protected])优选为第四代氨基末端的树枝状大分子包载广谱抗癌药物阿霉素。
所述的羧甲基壳聚糖中间分子(即CMCS)优选为分子量2000-100000的水溶性羧甲基壳聚糖。
所述的基于自组装的电荷反转型核/壳药物载体的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)、用水溶解CS-LA-DMMA得CS-LA-DMMA水溶液；
(2)、用水溶解CMCS，并与CS-LA-DMMA水溶液混合得混合液；
(3)、用水溶解[email protected]，并调节pH 4～6得[email protected]水溶液；
(4)、将混合液和[email protected]水溶液混合均匀得基于自组装的电荷反转型核/壳药物载体。
基于自组装的电荷反转型核/壳药物载体的第二种制备方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)、以DMSO溶解CS-LA-DMMA，得到A组分；
其中，CS-LA-DMMA按照以下步骤制备：
在CS-LA的DMSO溶液中，加入3～5倍摩尔当量的DMMA，并加入1～10倍摩尔当量的三乙胺(Triethylamine,TEA)和DMAP，TEA与DMAP之间的摩尔比为1：2，在室温条件下反应2-12h，反应结束后，向反应产物中加入冰乙醇进行沉淀至沉淀产物不再增加，离心收集沉淀产物，得CS-LA-DMMA；
其中CS-LA按照以下步骤合成：采用经HCl调节的pH 5.0～pH 6.0的含10mM TEMED的水溶液为溶剂，以LA羧基1.5倍摩尔当量的EDCI和1.2倍摩尔当量的NHS，在室温条件下活化LA羧基两小时，之后加入LA羧基5倍摩尔当量的CS氨基进行酰胺反应，在室温条件下继续反应12-48小时，反应结束后，向反应产物中加入冰乙醇进行沉淀至沉淀产物不再增加，离心收集沉淀产物，得CS-LA；
(2)、以混合溶剂溶解[email protected]，得到B组分；所述的混合溶剂由甲醇与DMSO混合而成且甲醇占比10％～35％(体积比)；
其中，[email protected]按照以下步骤制备：
以PAMAM为基准，将5倍摩尔当量的DOX·HCl溶于甲醇，加入DOX·HCl 3～4倍摩尔当量的TEA，避光搅拌10-24h进行脱盐；之后将此反应液加入PAMAM的水溶液，继续避光搅拌24h进行DOX包埋反应，得到[email protected]；
(3)、将1～5份的A组分与1份的B组分在磁力搅拌下搅拌2～3分钟，得到的粒径为500～700nm的基于自组装的电荷反转型核/壳药物载体。
基于自组装的电荷反转型核/壳药物载体的第三种制备方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)、以混合溶剂溶解CS-LA-DMMA得到A组分；所述的混合溶剂由DMSO与PBS混合而成且DMSO占比90％～100％(体积比)；
其中，CS-LA-DMMA按照以下步骤制备：
在CS-LA的DMSO溶液中，加入3～5倍摩尔当量的DMMA，并加入1～10倍摩尔当量的三乙胺(Triethylamine,TEA)和DMAP，TEA与DMAP之间的摩尔比为1：2，在室温条件下反应2-12h，反应结束后，向反应产物中加入冰乙醇进行沉淀至沉淀产物不再增加，离心收集沉淀产物，得CS-LA-DMMA；
其中CS-LA按照以下步骤合成：采用经HCl调节的pH 5.0～pH 6.0的含10mM TEMED的水溶液为溶剂，以LA羧基1.5倍摩尔当量的EDCI和1.2倍摩尔当量的NHS，在室温条件下活化LA羧基两小时，之后加入LA羧基5倍摩尔当量的CS氨基进行酰胺反应，在室温条件下继续反应12-48小时，反应结束后，向反应产物中加入冰乙醇进行沉淀至沉淀产物不再增加，离心收集沉淀产物，得CS-LA；
(2)、以混合溶剂溶解[email protected]得到B组分；所述的混合溶剂由DMSO与PBS混合而成且DMSO占比80％～100％(体积比)；
其中，[email protected]按照以下步骤制备：
以PAMAM为基准，将5倍摩尔当量的DOX·HCl溶于甲醇，加入DOX·HCl 3～4倍摩尔当量的TEA，避光搅拌10-24h进行脱盐；之后将此反应液加入PAMAM的水溶液，继续避光搅拌24h进行DOX包埋反应，得到[email protected]；
(3)、将2～8份的A组分与1～8份的B组分在磁力搅拌下搅拌2～3分钟，得到粒径为360～590nm的基于自组装的电荷反转型核/壳药物载体。
基于自组装的电荷反转型核/壳药物载体的第四种制备方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)、以DMSO溶解CS-LA-SA得到A组分；
(2)、以混合溶剂[email protected]得到B组分；所述的混合溶剂由甲醇与DMSO混合而成且甲醇占比25％(体积比)；
其中，[email protected]按照以下步骤制备：
以PAMAM为基准，将5倍摩尔当量的DOX·HCl溶于甲醇，加入DOX·HCl 3～4倍摩尔当量的TEA，避光搅拌10-24h进行脱盐；之后将此反应液加入PAMAM的水溶液，继续避光搅拌24h进行DOX包埋反应，得到[email protected]；
(3)、将3～5份的A组分与1份的B组分在磁力搅拌下搅拌2～3分钟，得到粒径为100～120nm的基于自组装的电荷反转型核/壳药物载体。
所述的基于自组装的电荷反转型核/壳药物载体，用于HepG2肝癌细胞体外药效学评价。
本发明具有以下优点：
第一、本发明的电荷反转型核/壳药物载体以壳聚糖衍生物作为负电性外壳，不仅使复合物具有良好的生物相容性，同时可以在体内降解，降解产物对人体无毒性，从而解决了合成材料导致的载体生物相容性差、体内毒性等问题。
第二、本发明的壳聚糖衍生物以壳聚糖为骨架，化学交联特异性亲和ASPGR的靶向分子乳糖酸和pH敏感电荷反转基团DMMA，提高了肿瘤靶向性和肿瘤富集，增加了细胞摄取。
第三、本发明的电荷反转型核/壳药物载体以[email protected])为正电性内核，在内含体/溶酶体酸性环境诱导下，发挥PAMAM介导的“质子海绵效应”以及PAMAM阳离子电荷驱动的细胞膜亲和作用，诱导溶酶体逃逸，实现了细胞核靶向药物释放。
第四、本发明的电荷反转型核/壳药物载体以羧甲基壳聚糖为中间分子，增加了制剂稳定性，且能够响应肿瘤酸性微环境，实现了“由负到正的电荷反转”。
第五、本发明药物载体主要基于自组装实现电荷反转型核/壳药物载体的制备，制备方式为滴加混合，操作方便，条件温和。
第六、本发明的电荷反转型核/壳药物载体在生理环境荷负电，提高了肿瘤靶向和高效肿瘤富集；进一步响应肿瘤酸性微环境，实现了“由负到正电荷反转”，克服了“电荷困境”，实现了更加高效的靶向药物递送并有效改善了药物的抗肿瘤效果。
附图说明
图1为本发明实施例1中CS-LA-DMMA的核磁共振氢谱图。
图2为本发明实施例1中CS-LA-DMMA的红外谱图。
图3为本发明实施例2中各个载体紫外谱图。
图4为本发明实施例3中自组装的电荷反转型核/壳药物载体的电位分布图。
图5为本发明实施例4中自组装的电荷反转型核/壳药物载体的透射电镜分布图。
图6为本发明实施例5中自组装的电荷反转型核/壳药物载体的体外释放图。
图7为本发明实施例6中自组装的电荷反转型核/壳药物载体的细胞毒性图。
图8为本发明实施例7中自组装的电荷反转型核/壳药物载体的细胞定量摄取图。
图9为本发明实施例8中自组装的电荷反转型核/壳药物载体的细胞凋亡图。
具体实施方式
以下将结合附图和实施例进一步说明本发明。
实施例1：CS-LA-DMMA的合成与鉴定
CS-LA的合成：采用经HCl调节的pH 5.0～pH 6.0的含10mM TEMED的水溶液为溶剂，以LA羧基1.5倍摩尔当量的EDCI和1.2倍摩尔当量的NHS，在室温条件下活化LA羧基两小时，之后加入LA羧基5倍摩尔当量的CS氨基进行酰胺反应，在室温条件下继续反应12-48小时，反应结束后，向反应产物中加入冰乙醇进行沉淀至沉淀产物不再增加，离心(3500rpm，5min)收集沉淀产物，所得沉淀产物干燥备用。
CS-LA-DMMA的合成：在CS-LA的DMSO溶液中，加入3～5倍摩尔当量的DMMA，并加入1～10倍摩尔当量的TEA和DMAP，TEA与DMAP之间的摩尔比为1：2，在室温条件下反应2-12h，反应结束后，向反应产物中加入冰乙醇进行沉淀至沉淀产物不再增加，离心(3500rpm，5min)收集沉淀产物，所得沉淀产物干燥备用。
CS-LA-DMMA通过核磁共振氢谱和红外光谱鉴定结构。图1 1H-NMR结果可知：在CS-LA-DMMA图谱中，化学位移2.0～2.1ppm，2.6～2.9ppm归属于CS氢的特征峰，化学位移3.5～4.0ppm归属于LA氢的特征峰，化学位移1.6～1.9ppm归属于DMMA甲基氢的特征峰，上述特征峰均有显示，说明CS-LA-DMMA合成成功。
图2FT-IR结果可知：3450cm-1的宽谱带归属于CS中N-H伸缩振动和O-H伸缩振动的重叠峰，1738cm-1归属于LA的羧基信号。在CS-LA图谱中，由于LA的-OH信号增加，3450cm-1峰变宽；同时由于酰胺反应，在1738cm-1处的LA羧基信号峰减弱，说明CS-LA成功合成。与LA-CS图谱相比，在LA-CS-DMMA图谱中，新峰1700cm-1和959cm-1分别归属于DMMA中羧基的伸缩振动ν(C＝O)以及弯曲振动δ(O-H)，说明CS-LA-DMMA成功合成。
实施例2：[email protected]的制备与鉴定
[email protected]的制备：以PAMAM为基准，将5倍摩尔当量的DOX·HCl溶于甲醇，加入DOX·HCl3～4倍摩尔当量的TEA，避光搅拌10-24h进行脱盐；之后将此反应液加入PAMAM的水溶液，继续避光搅拌24h进行DOX包埋反应，得到[email protected]。反应结束后，通过氮气吹干去除甲醇，向反应液中加入去离子水进行沉淀至沉淀产物不再增加，通过离心(8000rpm，2min)去除游离DOX沉淀，上清液经冷冻干燥后，保存备用。
图3紫外-可见图谱结果可知：DOX经PAMAM包埋后，紫外最大吸收波长由477nm(游离DOX)红移至494nm([email protected])。且通过紫外-可见分光光度计检测，DOX的包封率为38.03％，DOX的载药率为14.17％。
实施例3：自组装的电荷反转型核/壳药物载体的制备
将0.2mg实施例1制备的CS-LA-DMMA溶于0.2mL去离子水，并加入0.5mL浓度为2mg/mL的羧甲基壳聚糖水溶液；随后加入经2～2.5μL pH 0.15的经盐酸调节pH为4～6的1mg/mLPAMAM水溶液0.2～2mL，静置即得基于自组装的不同粒径范围的电荷反转型核/壳药物载体。
图3紫外-可见图谱结果可知：负电性外壳CS-LA-DMMA-CMCS在400～800nm无紫外吸收，与正电性内核[email protected]自组装后，CS-LA-DMMA-CMCS/[email protected]出现紫外最大吸收波长503nm，证明成功自组装。
表1
本发明通过动态光散射(Dynamic light scattering，DLS)监测粒径。表1为本发明实施例3中自组装的电荷反转型核/壳药物载体的粒径分布表。由表1可知：复合物粒径随核/壳质量比紧密相关，负电性外壳固定，随着[email protected]用量增加，复合物粒径增大。
表2
实施例3自组装的电荷反转型核/壳药物载体，在4℃条件下储存，评价复合物稳定性。表2为本发明实施例3自组装的电荷反转型核/壳药物载体的稳定性表。由表2可知：用量为0.2，0.5，1.3，1.4mg的[email protected]形成复合物的粒径在96h内仍然保持良好的稳定性。
图4电荷反转结果可知：CS-LA-DMMA-CMCS/[email protected]在中性pH7.4条件下，电位为-28.06mV，在模拟肿瘤细胞外(pH 6.8)和细胞内(pH5.0)微环境下，电位分别反转为-1.812mV和+19.49mV；而CS-LA-SA-CMCS/[email protected](琥珀酸酐(Succinic anhydride，SA)，CS-LA-SA合成方法同实施例1)由中性pH7.4条件下的-29.55mV反转为pH5.0条件下的6.753mV，以上电位反转结果说明酸性环境诱导的β-羧酸酰胺键水解和氨基质子化，使负电性外壳脱落，重新暴露[email protected]内核。
实施例4：实施例中自组装的电荷反转型核/壳药物载体的外观形态
制备自组装的电荷反转型核/壳药物载体后，取10～20μL样品溶液滴加到含有碳支持膜的200目铜网上，恒温干燥，重复操作3～4次，用透射电镜观察样品形态。
图5透射电镜结果可知：在模拟生理(pH7.4)微环境下，CS-DMMA-CMCS/[email protected]呈现清晰的核/壳结构，而在模拟肿瘤酸性微环境下(pH5.0)，此纳米复合物发生外壳脱落，自组装作用力破坏，使纳米制剂结构膨胀解离，粒径由221.9nm增加至5360nm；而CS-SA-CMCS/[email protected]在此酸性条件下，基本保持完整均一的结构。
实施例5：实施例中自组装的电荷反转型核/壳药物载体的体外释放
以pH 5.0、pH 6.8(1％吐温80，W/V)和pH 7.4磷酸盐缓冲液为释放介质，考察核/壳载体的pH响应性体外释放情况。将DOX含量为140μg的[email protected]、CS-LA-DMMA-CMCS/[email protected]和CS-LA-SA-CMCS/[email protected]纳米制剂置于透析袋(MWCO 3.5KDa)中，并浸入pH5.0的35mL PBS、pH 6.8的35mL PBS(1％吐温80，W/V)和pH 7.4的35mL PBS(1％吐温80，W/V)的50mL EP管中。在37℃恒温摇床内振摇，并在预定时间点(2，4，12，24，48，72，96h)进行取样1mL，并补充等体积新鲜介质。取得的样品经0.22μm微孔滤膜过滤，用HPLC法测定样品中DOX浓度，并进行DOX累积释放曲线绘制。
图6体外释放结果可知：随着pH值降低，DOX的释放速度加快。CS-LA-DMMA-CMCS/[email protected]制剂组在96h，pH 7.4条件下，DOX的累计释放率为43.41±1.93％，在酸性pH 6.8和pH 5.0的条件下，DOX的累计释放率分别为53.78±2.05％和65.08±1.69％。然而，CS-LA-SA-CMCS/[email protected]制剂组在96h，pH 7.4条件下，DOX的累计释放率为28.12±1.69％，在酸性pH 6.8和pH 5.0的条件下，DOX的累计释放率分别为33.48±1.39％和50.25±1.82％。此结果说明模拟肿瘤酸性微环境诱导DMMA发生电荷反转，使复合物解离，加速药物释放。[email protected]制剂组在96h，pH 7.4和pH 5.0的条件下，DOX的累计释放率分别为44.34±2.14％和82.25±1.51％，显著高于上述核/壳药物载体制剂组，进一步说明负电性外壳可减小核/壳纳米复合物在模拟正常生理条件下的突释；而在模拟肿瘤酸性微环境诱导下，壳聚糖衍生物发生氨基质子化以及DMMM的“负—正”电荷反转，降低与正电性内化[email protected]的静电作用，促使负电性外壳脱落，加速药物释放。
实施例6：自组装的电荷反转型核/壳药物载体对人肝癌细胞(HepG2)的体外抑制效果
采用MTT法考察游离DOX、[email protected]、CS-LA-DMMA-CMCS/[email protected]以及CS-LA-SA-CMCS/[email protected]四组不同制剂对HepG2的细胞毒性。对数生长期的HepG2细胞接种于96孔培养板中，接种密度为5×103/mL，于37℃、5％CO2细胞培养箱中培养24h后，分别加入等量DOX梯度浓度(15、35、40、50、70、85、100、140μM)的药物培养液，其中游离DOX组DOX浓度设置为：0.035、0.085、0.15、0.35、0.85、1.5、3.5、8.5μM，各组药物每个浓度设置6个复孔，同时建立对照组，培养48h后，每孔加入20μL MTT(5mg·mL-1)继续培养4h，弃去孔内液体后，每孔加入150μL DMSO，微型振荡器振荡混匀，酶标仪检测490nm处吸光度(absorbance，A)，根据吸光度A值及下列公式计算细胞存活率。
图7MTT结果可知：DOX浓度增加导致细胞存活率下降，表明纳米制剂对HepG2细胞的生长抑制作用呈现浓度依赖性。游离DOX、[email protected]、CS-LA-DMMA-CMCS/[email protected]以及CS-LA-SA-CMCS/[email protected]的IC50值分别为0.3456±0.0388μM，40.07±1.94μM，44.06±2.38μM以及51.04±2.66μM。
实施例7：自组装的电荷反转型核/壳药物载体的细胞定量摄取
取对数生长期的HepG2细胞，以2×105/孔细胞数量接种于6孔板，放入细胞培养箱中，孵育24h。分别加入等量DOX浓度(10μg/mL)的游离DOX、[email protected]、CS-LA-DMMA-CMCS/[email protected]以及CS-LA-SA-CMCS/[email protected]四组不同制剂，每孔2mL，放入细胞培养箱中，37℃、5％CO2条件下，分别孵育2，4，8，12h。孵育完成后，弃去上清液，用1mL浓度为0.01M的PBS洗三次，0.5mL胰酶消化并收集细胞悬液，1000r·min-1离心5min，弃去上清液，细胞沉淀用PBS漂洗，1000r·min-1离心5min，弃去上层液体，0.5mLPBS重悬细胞。用流式细胞仪分析并检测平均荧光强度(Mean fluorescent intensity，MFI)。
图8细胞定量摄取结果可知：MFI随时间延长而增强，提示时间性的细胞摄取。与CS-LA-SA/[email protected]组相比，[email protected]组和CS-LA-DMMA/[email protected]组的MFI增加，表明静电吸附诱导的细胞摄取。
实施例8：自组装的电荷反转型核/壳药物载体的细胞凋亡
取对数生长期的HepG2细胞，以2×105/孔细胞数量接种于6孔板，放入细胞培养箱中，孵育24h。分别加入等量DOX梯度浓度(15、40、75、80、100μM)的[email protected]、CS-LA-DMMA-CMCS/[email protected]以及CS-LA-SA-CMCS/[email protected]三组不同制剂的培养液，游离DOX组中DOX浓度设置为：0.035、0.14、0.35、0.85、1.4μM，阴性对照组加入等量空白培养液，每孔2mL，放入细胞培养箱中，37℃、5％CO2条件下，继续孵育48h。孵育完成后，把细胞培养液吸出至4mLEP管内，PBS洗涤细胞一次，并用400μL胰酶消化细胞，加入上述收集的细胞培养液，把细胞轻轻吹打下来，转移到离心管内，1000g离心5min，弃上清，PBS洗涤细胞沉淀，再次1000g离心5min，弃上清，在收集的细胞中依次加入195μL Annexin V/FITC结合液、5μL Annexin V/FITC、10μL碘化丙啶PI染色液，轻轻混匀后于室温避光的条件下孵育20min，随后用流式细胞仪分析并检测。
图9体外细胞凋亡结果可知：在CS-LA-SA-CMCS/[email protected]制剂组，细胞凋亡/坏死率基本维持在70％，当DOX浓度从15μM增加至100μM时，细胞凋亡/坏死率从71.78％增加至99.58％，表明浓度依赖性的细胞凋亡/坏死。
实施例9：壳聚糖衍生物CS-LA-DMMA与[email protected]的自组装
荷相反电荷的壳聚糖衍生物CS-LA-DMMA与[email protected]直接在水相环境进行自组装，很容易产生絮凝。本发明利用CS-LA-DMMA在甲醇易析出沉淀的性能，定制化设计聚沉包覆法(Coagulation coated method)，使荷负电的CS-LA-DMMA在[email protected]表面析出，进而自组装为符合粒径要求的纳米粒。
表3
本发明通过DLS监测粒径。表3为本发明实施例9中自组装的电荷反转型核/壳药物载体在有机相环境的粒径分步表。由表3可知：由于DMMA与SA在甲醇中溶解性不同，按照CS-LA-SA处方设计CS-LA-DMMA，粒径不同，比如CS-LA-SA为1mg时，自组装过程出现沉淀，而CS-LA-DMMA为1mg时，自组装的电荷反转型核/壳药物载体的粒径在600nm左右；
(1)CS-LA-DMMA质量：3，4mg时，粒径在200nm左右；1mg时，618nm(0.06)；5mg时，515nm(0.274)，但与CS-LA-SA相比，粒径不稳定；
(2)[email protected]溶剂中甲醇用量：在CS-LA-DMMA为1mg时，[email protected]溶剂中(2mL)甲醇用量为0.5mL，粒径为618nm(0.06)，而甲醇用量为0mL，粒径为在微米级别；在CS-LA-SA为2.5mg时，[email protected]溶剂中(2mL)甲醇用量为0.3mL，粒径为在微米级别，而甲醇用量为0.7mL，粒径为588nm(1.5)；在CS-LA-SA为3mg时，[email protected]溶剂中(2mL)，甲醇用量为0mL，粒径为在微米级别；甲醇为0.1mL，粒径为1500nm(0.7)；甲醇为0.2mL，粒径为688nm(0.614)；甲醇为0.5mL，粒径为257nm(4.36)，粒径合适，但不稳定；在CS-LA-SA为5mg时，[email protected]溶剂中(2mL)，甲醇为0.1mL，粒径为4.408×103nm(3.2)；甲醇为0.2mL，粒径为4.758×103nm(2.88)；甲醇为0.5mL，粒径为515nm(0.274)，粒径合适，但不稳定；甲醇为0.7mL，粒径为3.0×103nm(3)。
(3)溶解[email protected]时溶剂顺序：在CS-LA-SA为3mg时，先用甲醇溶解PAMAM，再混合DMSO，粒径为700～800nm(0.25)；先用DMSO溶解PAMAM，再混合甲醇，粒径为257nm(4.36)，粒径合适，但不稳定。
结论：(1)、以DMSO溶解实施例1制备的CS-LA-DMMA，得到A组分；
(2)、以混合溶剂溶解实施例2制备的[email protected]，得到B组分；所述的混合溶剂由甲醇与DMSO混合而成且甲醇占比10％～35％(体积比)。
(3)、将1～5份的A组分与1份的B组分在磁力搅拌下搅拌2～3分钟，得到粒径为500～700nm的基于自组装的电荷反转型核/壳药物载体。
所述的份指质量份。
表4
为进一步验证甲醇在聚沉包覆自组装的作用，在保持外壳、内核质量与上述处方基本一致时，在DMSO，不同pH值PBS中进行自组装。本发明通过DLS监测粒径。表4为本发明实施例9中自组装的电荷反转型核/壳药物载体在水相环境的粒径分步表。由表4可知：在DMSO与不同pH值PBS混合溶剂中进行自组装，均呈现“千”数量级的大粒径，甚至出现沉淀。
(1)、与在水相PBS相比，在DMSO中自组装粒径相对较小，比如在CS-LA-DMMA为0.5mg，5mL(0.1PBS7.4+4.9DMSO)时，[email protected]为2mg，5mL(1DMSO+0.1PBS5.0+3.9DMSO)时，粒径为503.5nm(0.045)，而在2mg，5mL(1DMSO+0.1PBS5.0+0.45PBS5.0+0.45PBS 7.4+3DMSO)时，粒径为微米级别。在CS-LA-DMMA为1mg，2.5mL(0.2PBS7.4+2.3DMSO)时，[email protected]为0.25mg，2.5mL(0.125DMSO+0.2PBS5.0+2.175DMSO)时，粒径为1.570×103nm(0.232)，在0.25mg，2.5mL(0.125DMSO+2.375DMSO)时，粒径为367.2nm(0.06)。
(2)、[email protected]质量影响粒径，比如在CS-LA-DMMA为1mg，2.5mL(0.2PBS7.4+2.3DMSO)时，[email protected]为0.25mg，2.5mL(0.125DMSO+2.375DMSO)时，粒径为367.2nm(0.06)，而在0.5mg，2.5mL(0.25DMSO+2.25DMSO)时，粒径为586.7nm(0.397)。
(3)、CS-LA-DMMA溶剂用量：[email protected]为2mg，1mL(0.4水+0.6PBS 5.0)时，CS-LA-DMMA为2mg，3mL DMSO，粒径为2.880×103nm(0.46)，而在2mg，5mL DMSO，粒径为1.450×103nm(0.066)。
结论：(1)、以混合溶剂溶解实施例1制备的CS-LA-DMMA得到A组分；所述的混合溶剂由DMSO与PBS混合而成且DMSO占比90％～100％(体积比)；
(2)、以混合溶剂溶解实施例2制备的[email protected]得到B组分；所述的混合溶剂由DMSO与PBS混合而成且DMSO占比80％～100％(体积比)；
(3)、将2～8份的A组分与1～8份的B组分在磁力搅拌下搅拌2～3分钟，得到粒径为360～590nm的基于自组装的电荷反转型核/壳药物载体。
所述的份指质量份。
实施例10：壳聚糖衍生物CS-LA-SA与[email protected]的自组装
荷相反电荷的壳聚糖衍生物CS-LA-SA与[email protected]直接在水相环境进行自组装，很容易产生絮凝。本发明利用CS-LA-SA在甲醇易析出沉淀的性能，定制化设计聚沉包覆法(Coagulation coated method)，使荷负电的CS-LA-SA在[email protected]表面析出，进而自组装为符合粒径要求的纳米粒。
表5
本发明通过DLS监测粒径。表5为本发明实施例10中自组装的电荷反转型核/壳药物载体在水相环境的粒径分步表。由表5可知：聚沉包覆法中，制备粒径稳定合适的纳米粒，需要控制多种因素：
(1)CS-LA-SA质量：3，4，5mg时，粒径在130～170nm范围，1mg时，出现沉淀；
(2)CS-LA-SA所用溶剂：在CS-LA-SA为3mg，2mL时，全部为甲醇，由于CS-LA-SA在甲醇不溶解，自组装纳米粒过程出现沉淀，全部为PBS 7.4，出现大粒径1460nm(0.4)；
(3)[email protected]溶剂中甲醇用量：在CS-LA-SA为3mg时，[email protected]溶剂中(2mL)甲醇用量为0.5mL，粒径为120nm(0.02)，而甲醇用量为1mL，粒径为2109nm(3.056)；在CS-LA-SA为5mg时，[email protected]溶剂中(2mL)甲醇用量为0.5mL，粒径为12h后稳定在138～153nm，而甲醇用量为0mL，粒径由2000nm迅速团聚为微米级别。
结论：(1)、以DMSO溶解CS-LA-SA得到A组分；
(2)、以混合溶剂溶解实施例2的[email protected]得到B组分；所述的混合溶剂由甲醇与DMSO混合而成且甲醇占比25％(体积比)；
(3)、将3～5份的A组分与1份的B组分在磁力搅拌下搅拌2～3分钟，得到粒径为100～120nm的基于自组装的电荷反转型核/壳药物载体。
所述的份指质量份。
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