阅读说明：本技术 一种用于检测鼠痘病毒的rpa试剂盒、引物、探针及方法 (RPA kit, primers, probe and method for detecting varicella virus ) 是由 熊炜 薛俊欣 魏晓锋 林颖峥 李健 于 2019-04-25 设计创作，主要内容包括：本发明属生物技术领域,具体涉及一种用于检测鼠痘病毒核酸的RPA试剂盒、引物、探针及方法。本发明的试剂盒包括RPA反应体系,所述的RPA反应体系包括RPA引物探针混合液,所述RPA引物探针混合液包括一引物对和探针,所述引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示,所述探针如SEQ ID NO.3+FAM-dt+THF+BHQ1-dt+SEQ ID NO.4+C3所示。本发明的试剂盒可用于检测鼠痘病毒,反应时间短、检测速度快,且灵敏度和特异性高。(The invention belongs to the technical field of biology, and particularly relates to an RPA kit, primers, a probe and a method for detecting a varicella virus nucleic acid. The kit comprises an RPA reaction system, wherein the RPA reaction system comprises an RPA primer probe mixed solution, the RPA primer probe mixed solution comprises a primer pair and a probe, the nucleotide sequence of the primer pair is shown as SEQ ID No.1 and SEQ ID No.2, and the probe is shown as SEQ ID No.3+ FAM-dt + THF + BHQ1-dt + SEQ ID No.4+ C3. The kit can be used for detecting the varicella virus, and has the advantages of short reaction time, high detection speed, high sensitivity and high specificity.)

一种用于检测鼠痘病毒的RPA试剂盒、引物、探针及方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于检测鼠痘病毒核酸的RPA试剂盒、引物、探针及方法。

背景技术

资料公开了由鼠痘病毒(Ectromelia virus，EV)引起的小鼠鼠痘(Mouse pox)是一种高度接触性、毁灭性的烈性传染病，该病在世界各地的实验鼠群广泛流行，死亡率达96.6％。该疾患其临床以四肢、头和尾肿胀、坏死甚至脚趾脱落为特征，是危害小鼠最为严重的病毒病之一。英国Marchal等于1929年首先在英国实验鼠群中发现本病患，并于次年首次报道；我国汤飞凡1951年首次报道北京中央生物制品研究所发生鼠痘疫情；吴惠英等(1986)、徐蓓等(1989)对全国各地鼠群进行血清学流行病学调查，证实鼠痘在我国鼠群中呈散发性流行。目前本病患广泛存在于世界各国，尤以英德美法最为严重，在我国至今仍时有发生。研究显示，本病多呈爆发性流行，致死率高，常造成全群淘汰，严重影响实验动物的生产繁育，对动物实验的顺利进行和科研数据的准确性和可重复性造成极其严重的影响。研究显示，在自然条件下，鼠痘病毒可感染各种年龄的小鼠，但以乳鼠和1岁以上的老龄鼠病死率较高，而6～12周龄的小鼠较低，不同品系小鼠的易感性上有所差异；由于鼠痘病毒能隐性感染，小鼠不表现临床症状，但病毒能持久存在于体内并且繁殖，而且病毒不断地从粪便中排出，成为可怕的感染源，因此，对鼠痘的早期诊断尤其对隐性感染鼠的检出，显得尤其重要。

现有技术中，血清学方法和PCR方法是检测EV最常用的方法，然而，该两种方法方法或需要昂贵的仪器设备，或需要技术娴熟的技术人员，或检测周期长，因此，不适合普通实验室或现场诊断的推广应用。

2006年，一种新等温基因扩增技术——重组酶聚合酶扩增(Recombinasepolymerase amplification，RPA)被发明，该技术可在37～42℃条件下、10～30min内等温体外大量扩增目的基因片段；随后，英国TwistDx公司开发出了RPA商品化试剂盒，加快了RPA技术的研发、推广和应用；与聚合酶链式反应(PCR)相比，PRA具有扩增速度快、反应温度恒定、所需仪器简单等优点，特别适用于DNA或RNA的快速检测。目前，RPA已经在病毒、衣原体、支原体、细菌、寄生虫等病原检测方面得到了开发与应用；该技术通过利用重组酶结合引物形成蛋白-DNA混合物，启动寻找模板DNA上的同源序列；当同源序列定位后，则会引发链置换反应；引物结合到对应模板上，聚合酶进而从引物3’末端开始启动DNA合成，实现在常温下两条引物对靶基因的几何级数扩增；同时，在RPA反应体系中，对引物碱基突变具有较强的耐受性，在引物个别碱基突变后，RPA反应依然可以顺利进行。

实践显示，重组酶聚合酶扩增是一种可以替代PCR的核酸检测技术，其能在20分钟内进行常温下的单分子核酸检测；该技术对硬件设备的要求很低，特别适合野外及检疫现场使用。

基于现有技术的基础与现状，为加强口岸对入境噬齿类实验动物和野生动物鼠痘疫情的监测和流行病学调查，本申请在建立实时荧光RPA检测EV的方法以及对该方法的特异性、敏感性和稳定性进行了验证的基础上，提供一种用于检测鼠痘病毒的RPA试剂盒、引物、探针及方法。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是为了克服目前对鼠痘病毒检测的灵敏度和敏感性低，且反应时间长等缺陷，基于建立实时荧光RPA检测EV的方法以及对该方法的特异性、敏感性和稳定性进行验证的基础，提供一种用于检测EV核酸的重组酶聚合酶扩增技术(RPA)试剂盒、引物、探针及方法。本发明的用RPA建立的检测EV核酸的快速检测方法具有很高的特异性和敏感性，为EV感染的诊断提供了快速、简便、准确的检测方法。

本发明主要通过以下技术方案解决现有技术存在的技术问题。

本发明提供了一种用于检测鼠痘病毒(EV)核酸的试剂盒，其包括RPA反应体系，所述的RPA反应体系包括RPA引物探针混合液，所述RPA引物探针混合液包括一引物对和探针，所述引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，所述探针如SEQ ID NO.3+FAM-dt+THF+BHQ1-dt+SEQ ID NO.4+C3所示。

为提高扩增效率，所述的RPA反应体系的引物的浓度较佳地分别为5～20μM，更佳地为10μM；所述探针的浓度较佳地为5～10μM，更佳地为10μM。

较佳地，所述的RPA反应体系还包括核心反应液、反应缓冲液、Exo反应液、探针酶混合物、醋酸镁和dNTP；其中，所述醋酸镁的浓度优选260～300μM，更优选280μM。所述dNTP的浓度优选20～220μM，更优选200μM。

在本发明一较佳实施例中，所述的引物探针混合液由所述引物对和所述探针组成，所述引物对中各引物的量为2.1μL、浓度为10μM，所述探针的量为0.6μL、浓度为10μM。所述核心反应液的量为2.5μL，所述反应缓冲液的量为25μL，所述探针酶混合物的量为5μL，以及所述Exo反应液的量为1μL；所述醋酸镁的量为2.5μL、浓度为280μM；所述dNTP的量为7.2μL、浓度为11mM。其中：

所述的核心反应液优选20倍核心反应液(即：20×核心反应液；下同)。

所述的反应缓冲液优选2倍反应缓冲液。

所述的探针酶混合物优选10倍探针酶混合物；

所述的Exo反应液优选50倍Exo反应液

更佳地，为了更直观、准确地判定检测结果，所述的试剂盒还包括阴性对照，所述的阴性对照优选ddH₂O。

本发明还提供一种检测鼠痘病毒(EV)核酸的引物对，所述的引物对的核苷酸序列分别如序列表中SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示；较佳地，所述的检测为RPA检测。

本发明还提供一种检测鼠痘病毒(EV)核酸的探针，所述的探针如SEQ ID NO.3+FAM-dt+THF+BHQ1-dt+SEQ ID NO.4+C3所示；较佳地，所述的检测为RPA检测。

本发明还提供一种检测鼠痘病毒(EV)核酸的组合，所述的组合包括引物对和探针，所述引物对的核苷酸序列分别如序列表中SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示；所述探针如SEQ ID NO.3+FAM-dt+THF+BHQ1-dt+SEQ ID NO.4+C3所示；较佳地，所述的检测为RPA检测。

本发明还提供如上所述的引物对和/或探针，或者所述的组合在制备检测鼠痘病毒(EV)的试剂盒中的应用。

本发明还提供一种非诊断目的的检测鼠痘病毒(EV)的方法，其包括如下步骤：

(1)使用DNA提取试剂提取待检样品中的总DNA；

(2)以步骤(1)提取的总DNA为模板，利用如上所述试剂盒中的RPA反应体系进行RPA反应，所述RPA反应中扩增反应的时间优选25min、温度优选39℃；

(3)分析检测结果。

利用本方法分别检测鼠的其它病毒，如小鼠肝炎病毒(MHV)、小鼠细小病毒(MPV)、小鼠仙台病毒(SV)、小鼠呼肠孤病病毒III型(Reo-3)、小鼠微小病毒(MVM)、淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)作为对照，同时与PCR方法进行对比，检测所建立方法的特异性，结果证实，本发明建立的鼠痘病毒(EV)的RPA检测方法具有很高的特异性和敏感性，为基层单位普通实验室SIV感染的诊断提供了一个快速、简便、准确的检测手段。

在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。

本发明所用试剂和原料均市售可得。

本发明的有益效果在于：

本发明提供了一种用于检测鼠痘病毒(EV)核酸的RPA新方法，与普通PCR方法相比，该RPA具有以下优势：首先，RPA属于等温扩增技术，对仪器设备要求低，仅需要恒温水浴锅即也可完成反应；其次，RPA检测速度快，反应时间在40min以内，比常规PCR反应时间(通常为1～2h)明显短；第三，试验条件允许的条件下加入荧光标记的探针序列，在GENIEⅡ恒温扩增仪上进行扩增，可实现核酸扩增的实时监控，所述特点使得本发明建立的RPA方法适用于基层单位普通实验室EV快速检测和鉴别诊断。

附图说明

图1为实时荧光RPA检测EV的特异性；其中，孔1为EV；孔2-孔8分别为MHV、MPV、SV、Reo-3、MVM、LCMV和空白对照。

图2为PCR检测EV的特异性；其中，M为DNA Marker DL2000；泳道1-8检测的病毒样品分别为：1.EV、2.MHV、3.MPV、4.SV、5.Reo-3、6.MVM、7.LCMV、8.空白对照。

图3为实时荧光RPA检测EV的敏感性；其中，扩增曲线从左至右分别为1ng、100pg、10pg、1pg、100fg、10fg、1fg、0.1fg的鼠痘病毒DNA模板。

图4为RT-PCR检测EV的敏感性试验；其中，M为DNA Marker DL2000；泳道1-8cDNA模板的浓度分别为为1ng、100pg、10pg、1pg、100fg、10fg、1fg和、0.1fg。

图5荧光RPA检测鼠痘阳性组织样本；其中，7条阳性扩增曲线从上至下分别为肝、脾、肺、肾、心、血液和肠，未扩增曲线为空白对照。

图6 PCR检测鼠痘阳性组织样本；其中，M为DNA Marker DL2000；其余泳道分别为：1.血液、2.肝、3.脾、4.肺、5.肾、6.心、7.肠、8.空白对照。

具体实施方式

下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。

实施例1 实时荧光PRA引物和探针的设计

使用Vector NTI Suite软件分析不同国家和地区分离的鼠痘病毒血凝蛋白编码基因的保守序列，用Primer Express软件设计RPA引物和探针，引物和探针由上海辉睿生物科技有限公司合成。

表1引物和探针组合

其中，RPAY-EVP的核苷酸序列组成为：SEQ ID NO.3+FAM-dt+THF+BHQ1-dt+SEQ IDNO.4+C3。

实施例2 反应体系的建立和优化

1)实时荧光RPA检测

反应体系为50μL：25μL 2倍反应缓冲液、7.2μL浓度为11mM的dNTP、5μL 10倍探针酶混合物、上下游引物(RPAY-EVF、RPAY-EVR)各2.1μL(浓度均为10μM)、10μM荧光探针0.6μL；混匀后，再加入2.5μL 20倍核心反应液、1μL 50倍Exo反应液；混匀后，最后加入2.5μL的280mM醋酸镁、2μL待检核酸溶液，反应条件为：39℃孵育25min。在反应结束后，查看荧光扩增曲线并进行结果判定；

2)最佳反应时间的确定

为确定RPA最佳反应时间，以1×10³拷贝/μL的重组质粒pT-EV-P72 DNA为模板，分别以10min、20min、25min、30min、35min和40min为不同的反应时间进行RPA扩增，RPA反应结束后，取5μL产物进行2％琼脂糖凝胶电泳，并用紫外凝胶成像系统分析电泳结果，结果显示，40℃下RPA反应时间为20min时，电泳即可获得一条大小约为167bp的特异性条带，对RPA产物条带用紫外凝胶成像系统进行半定量分析，RPA反应30min min后，条带约为20min时条带的5.7倍，反应25min后扩增的条带没有显著增加，因此，将EV RPA最佳反应时间确定为25min；

3)RPA最佳反应温度的确定

为准确比对不同温度下RPA反应的扩增效率，配制50μL RPA反应体系，充分混匀后，分别在30、35、37、39、41和45℃进行扩增反应，30min后分别从各管中取10μL扩增液，结果显示，该检测体系在25～45℃的温度范围内均可有效进行，其中39℃时扩增效率最佳，紫外凝胶成像系统分析时条带最深，因此最佳反应温度确定为39℃；

4)核酸提取及cDNA模板制备

对于DNA病毒样品，取100μL组织上清液或体液样本，按DNA抽提试剂盒(市售可得，例如购自QIAGEN的试剂盒)说明书要求进行病毒DNA提取，最后将DNA用50μL水溶解，即得PCR模板；对于RNA病毒样品，取100μL上清液或体液，用TRIzol方法提取RNA，再进行逆转录，得cDNA模板；具体操作如下：

4.1向100μL组织上清液或体液样本中加入700μL 65℃预热缓冲液1的离心管，混匀后将离心管放在65℃水浴20min，水浴过程中颠倒离心管以混合样品数次；

4.2加入700μL氯仿，充分混匀，12 000rpm离心5min；

4.3将上层水相转入一个新的离心管中，加入700μL缓冲液2，充分混匀，转移到吸附柱中，12 000rpm离心30s，弃掉废液；

4.4向吸附柱中加入500μL缓冲液3，12 000rpm离心30s，弃掉废液，将吸附柱放入收集管中；

4.5向吸附柱中加入600μL漂洗液，12 000rpm离心30s，弃掉废液，将吸附柱放入收集管中；充分本操作一次；

4.6将吸附柱放入收集管中，12 000rpm离心2min，弃掉废液。将吸附柱置于室温放置数分钟；

4.7将吸附柱转入另一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50～200μL洗脱缓冲液，室温放置3min，12 000rpm离心2min，将溶液收集到离心管中。

实施例3 PCR检测

引物针对EV血凝蛋白编码基因的保守区域设计，扩增基因片段大小为406bp，其上游引物(EVF)序列为：5’ATA CGC TAC ACC TTA TCC TCA GAC AC 3’，下游引物(EVR)序列为：5’CGG TGA ATG TGT AGA TCC AGA TAG TA 3’，在PCR薄壁管中，加cDNA或DNA模板1μL、10倍Taq酶浓缩缓冲液2.5μL、dNTP 0.5μL、上下游引物各0.25μL、Taq酶0.25μL，加水补足总体积至25μL，将PCR管置PCR仪上，按如下程序扩增：首先94℃3min；然后94℃15s，56℃15s，72℃30s，35个循环；最后72℃3min。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后，以凝胶成像系统分析。

实施例4 实时荧光RPA检测EV的特异性试验

本发明分析EV血凝蛋白编码基因的保守区域基因序列，设计引物及探针，建立实时荧光RPA检测EV方法，并分别使用鼠的其它病毒，如小鼠肝炎病毒(MHV)、小鼠细小病毒(MPV)、小鼠仙台病毒(SV)、小鼠呼肠孤病病毒III型(Reo-3)、小鼠微小病毒(MVM)、淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)，作为对照，同时与PCR方法进行对比，确认所建立方法的特异性，结果显示，经荧光RPA检测，EV阳性样品在反应5～10min后荧光信号出现显著增强，而对照病毒和细菌样品未检测到荧光信号(如图1所示)；PCR检测仅有EV阳性样品出现特异性扩增，其它病毒对照均呈阴性(如图2所示)。

实施例5 实时荧光RPA检测EV的敏感性试验

为测试所建立的荧光RPA方法的敏感性，将鼠痘病毒DNA进行定量并梯度稀释，制备浓度分别为1ng/μL、100pg/μL、10pg/μL、1pg/μL、100fg/μL、10fg/μL、1fg/μL、0.1fg/μL的模板，再用建立荧光RPA方法和PCR方法进行对比检测，结果显示，PCR检测样品EV阳性DNA模板的下限量为1～10pg/μL(如图5所示)，RPA检测EV的DNA模板的下限量同样为1～10pg/μL(如图4所示)。

实施例6 试剂盒的组装

按照核酸的提取和RPA反应两个部分完成试剂盒组分的配制，以下提供的数据及试剂组分为单次检测所需试剂：

1)核酸提取(室温保存)

核酸提取试剂包括缓冲液1(40ml)、缓冲液2(40ml)、缓冲液3(15ml)、漂洗液(15ml)、洗脱缓冲液(15ml)、吸附柱和收集管；

2)RPA检测(-20℃保存)

引物探针混合液管：10μM上下游引物各2.1μL、10μM探针0.6μL，合计4.8μL；

反应液管：2×反应缓冲液25μL、dNTP 8.2μL、10×探针酶混合物5μL、20×核心反应液2.5μL、50×Exo反应液1μL；2.5μL的280mM醋酸镁。

实施例7 试剂盒的应用——实时荧光RPA检测EV的重复性试验

为进一步验证建立核酸检测方法的可靠性，将鼠痘不同组织器官的阳性样本分别用荧光RPA和PCR进行检测，结果显示，使用荧光RPA方法和PCR方法检测病鼠的心、肝、脾、肺、肾、肠、血液等组织器官均得到了阳性结果，与实际样本的符合率为100％(如图5、图6所示)。

序列表

<110> 上海出入境检验检疫局动植物与食品检验检疫技术中心,上海实验动

物研究中心

<120> 一种用于检测鼠痘病毒的RPA试剂盒、引物、探针及方法

<130> 20190425

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 32

<212> DNA

<213> RPAY-EVF

<400> 1

aggagcccaa ttccattatt ctcttagctg cc 32

<210> 2

<211> 33

<212> DNA

<213> RPAY-EVR

<400> 2

gaatgcacat acataagtac cggcatctcc agc 33

<210> 3

<211> 34

<212> DNA

<213> SEQ ID NO. 3

<400> 3

cttacgattc tccatacgat gatctagtta caac 34

<210> 4

<211> 17

<212> DNA

<213> SEQ ID NO. 4

<400> 4

acaattaaat cattgac 17

<210> 5

<211> 26

<212> DNA

<213> EVF

<400> 5

atacgctaca ccttatcctc agacac 26

<210> 6

<211> 26

<212> DNA

<213> EVR

<400> 6

cggtgaatgt gtagatccag atagta 26