阅读说明：本技术 一种欧李原花青素、其制备方法、其应用和药物 (Prunus humilis procyanidin, preparation method, application and medicine thereof ) 是由 李卫东 崔清宇 李宗朔 于 2020-07-15 设计创作，主要内容包括：本发明适用于医药技术领域,提供了一种欧李原花青素、其制备方法、其应用和药物,该欧李原花青素的制备方法包括以下步骤：取欧李,并进行去核处理,得到去核欧李；将去核欧李与乙醇水溶液置于30~50℃的温度下进行超声波提取,得到提取液；将提取液进行抽滤后,再进行真空浓缩和冻干处理,得到所述欧李原花青素。本发明通过将欧李中的活性成分提取制备成冻干粉,可以实现在维持其生物活性的同时,还便于储存运输,其对于欧李产业的发展以及满足人们日益增长的大健康需求具有重要意义。另外,本发明制得的欧李原花青素具有预防骨质疏松,维持骨骼结构,保护骨小梁微结构的完整,改善绝经所致的雌激素紊乱及调控机体肠道菌群代谢物等功效。(The invention is applicable to the technical field of medicines, and provides prunus humilis procyanidin, a preparation method, application and a medicine thereof, wherein the preparation method of prunus humilis procyanidin comprises the following steps: taking cerasus humilis, and performing denucleation treatment to obtain denucleated cerasus humilis; placing the denucleated cerasus humilis and an ethanol aqueous solution at the temperature of 30-50 ℃ for ultrasonic extraction to obtain an extracting solution; and carrying out suction filtration on the extracting solution, and then carrying out vacuum concentration and freeze-drying treatment to obtain the prunus humilis procyanidin. According to the invention, the active ingredients in the cerasus humilis are extracted and prepared into the lyophilized powder, so that the biological activity of the cerasus humilis can be maintained, and the cerasus humilis lyophilized powder is convenient to store and transport, and has important significance for the development of the cerasus humilis industry and the meeting of the ever-growing health requirements of people. In addition, the prunus humilis procyanidin prepared by the invention has the effects of preventing osteoporosis, maintaining the bone structure, protecting the integrity of the trabecular bone microstructure, improving estrogen disorder caused by menopause, regulating and controlling intestinal flora metabolites of organisms and the like.)

一种欧李原花青素、其制备方法、其应用和药物

技术领域

本发明属于医药技术领域，尤其涉及一种欧李原花青素、其制备方法、其应用和药物。

背景技术

骨质疏松症是最常见的骨骼疾病，是一种以骨量低，骨组织微结构损坏，导致骨脆性增加，易发生骨折为特征的全身性骨病，其早期无特异的临床症状，因而又被称为“寂静的疾病”。随着人口老龄化社会的到来，骨质疏松症发病率逐年增加，也越来越被重视。

目前，治疗骨质疏松症的主要方法还是以药物治疗为主。抗骨质疏松药物的主要基于两种思路：抑制骨吸收或诱导骨形成。常用的骨吸收抑制剂主要有双磷酸盐类、降钙素、***和选择性***受体调节剂，其主要通过抑制破骨细胞功能或活性，从而抑制骨吸收。机制较为明确的促骨形成药物主要有甲状旁腺激素类似物。

但是，这些药物导致的胃肠不耐受、患者依从性差，及其在长期治疗中的安全问题等而备受争议。因此，从食药同源或者天然药物角度，找到能够预防甚至治疗骨质疏松症的安全、有效的方法，是解决当前问题的关键。

发明内容

本发明实施例的目的在于提供一种欧李原花青素的制备方法，旨在解决背景技术中提出的问题。

本发明实施例是这样实现的，一种欧李原花青素的制备方法，其包括以下步骤：

取欧李，并进行去核处理，得到去核欧李；

将去核欧李与乙醇水溶液置于30~50℃的温度下进行超声波提取，得到提取液；

将提取液进行抽滤后，再进行真空浓缩和冻干处理，得到所述欧李原花青素。

作为本发明实施例的一个优选方案，所述乙醇水溶液的体积浓度为60%~80%。

作为本发明实施例的另一个优选方案，所述去核欧李与乙醇水溶液的质量体积比以g/mL计为1:(3~7)。

作为本发明实施例的另一个优选方案，所述步骤中，超声波提取的超声功率为400~800W，超声频率为30~50KHz。

作为本发明实施例的另一个优选方案，所述步骤，真空浓缩的温度为35~55℃。

作为本发明实施例的另一个优选方案，所述将提取液进行抽滤的步骤，具体包括：

将提取液用400~600目尼龙滤布进行抽滤。

本发明实施例的另一目的在于提供一种上述制备方法制得的欧李原花青素。

本发明实施例的另一目的在于提供一种上述的欧李原花青素在制备用于治疗和/或预防骨质疏松的药物中的应用。

本发明实施例的另一目的在于提供一种上述的欧李原花青素在制备用于改善***紊乱和/或调控机体肠道菌群代谢物的药物中的应用。

本发明实施例的另一目的在于提供一种药物，用于治疗和/或预防骨质疏松，其包括药物载体和上述的欧李原花青素。

本发明实施例提供的一种欧李原花青素的制备方法，通过将欧李中的活性成分提取制备成冻干粉，可以实现在维持其生物活性的同时，还便于储存运输，其对于欧李产业的发展以及满足人们日益增长的大健康需求具有重要意义。另外，本发明实施例制得的欧李原花青素对骨质疏松有明显的预防效果。其中，欧李是一种药食两用的植物，经提取制备后获得欧李原花青素提取物冻干粉，具有预防骨质疏松，维持骨骼结构，保护骨小梁微结构的完整，改善绝经所致的***紊乱及调控机体肠道菌群代谢物（短链脂肪酸）等功效；同时，该欧李原花青素的食料安全，无明显毒副作用，解决了目前因大多采用西药进行治疗骨质疏松症而存在毒副作用的问题。

附图说明

图1为不同组的小鼠股骨干骺端micro-CT三维扫描图；

图2为不同组的小鼠股骨干骺端H&E染色图；

图3为不同组的小鼠股骨干骺端TRAP染色图；

图4为不同组的小鼠机体的***分泌水平对比图；

图5为不同组的小鼠机体的PINP水平对比图；

图6为不同组的小鼠机体的OPG/sRANKL水平对比图；

图7为不同组的小鼠粪便中的乙酸含量对比图；

图8为不同组的小鼠粪便中的丙酸含量对比图；

图9为不同组的小鼠粪便中的异丁酸含量对比图；

图10为不同组的小鼠粪便中的正丁酸含量对比图；

图11为不同组的小鼠粪便中的异戊酸含量对比图；

图12为不同组的小鼠粪便中的正戊酸含量对比图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1

该实施例提供了一种欧李原花青素的制备方法，其包括以下步骤：

S1、取新鲜欧李，并进行去核、切块处理，得到去核欧李。

S2、将10g上述的去核欧李和30mL的体积浓度为60%的乙醇水溶液进行混合后，再置于30℃的温度下进行超声波提取3次，合并得到提取液。其中，超声波提取的超声功率为400W，超声频率为30KHz，每次提取的时间为20min。

S3、将上述提取液用400目的尼龙滤布进行抽滤，取滤液，并置于35℃的温度下进行真空浓缩后，再进行冻干处理，即可得到欧李原花青素（冻干粉）。

该实施例还提供了一种用于治疗和/或预防骨质疏松药物，其包括药物载体和上述制得的欧李原花青素。其中，药物载体可以采用现有常见的微囊、微球、纳米粒或脂质体，但不限于此。另外，药物还可包括其他具有治疗和/或预防骨质疏松的活性成分，也可以包括用于防腐、掩味或者矫味等的添加剂。需要说明的是，欧李原花青素在药物中的含量可根据实际需求进行设计，在此就不作赘述。

实施例2

该实施例提供了一种欧李原花青素的制备方法，其包括以下步骤：

S1、取新鲜欧李，并进行去核、切块处理，得到去核欧李。

S2、将10g上述的去核欧李和70mL的体积浓度为80%的乙醇水溶液进行混合后，再置于50℃的温度下进行超声波提取3次，合并得到提取液。其中，超声波提取的超声功率为800W，超声频率为50KHz，每次提取的时间为40min。

S3、将上述提取液用600目的尼龙滤布进行抽滤，取滤液，并置于35~55℃的温度下进行真空浓缩后，再进行冻干处理，即可得到欧李原花青素（冻干粉）。

实施例3

该实施例提供了一种欧李原花青素的制备方法，其包括以下步骤：

S1、取新鲜欧李，并进行去核、切块处理，得到去核欧李。

S2、将10g上述的去核欧李和40mL的体积浓度为65%的乙醇水溶液进行混合后，再置于35℃的温度下进行超声波提取3次，合并得到提取液。其中，超声波提取的超声功率为500W，超声频率为35KHz，每次提取的时间为35min。

S3、将上述提取液用450目的尼龙滤布进行抽滤，取滤液，并置于40℃的温度下进行真空浓缩后，再进行冻干处理，即可得到欧李原花青素（冻干粉）。

实施例4

该实施例提供了一种欧李原花青素的制备方法，其包括以下步骤：

S1、取新鲜欧李，并进行去核、切块处理，得到去核欧李。

S2、将10g上述的去核欧李和60mL的体积浓度为75%的乙醇水溶液进行混合后，再置于45℃的温度下进行超声波提取3次，合并得到提取液。其中，超声波提取的超声功率为700W，超声频率为45KHz，每次提取的时间为35min。

S3、将上述提取液用550目的尼龙滤布进行抽滤，取滤液，并置于50℃的温度下进行真空浓缩后，再进行冻干处理，即可得到欧李原花青素（冻干粉）。

实施例5

该实施例提供了一种欧李原花青素的制备方法，其包括以下步骤：

S1、取新鲜欧李，并进行去核、切块处理，得到去核欧李。

S2、将10g上述的去核欧李和50mL的体积浓度为70%的乙醇水溶液进行混合后，再置于40℃的温度下进行超声波提取3次，合并得到提取液。其中，超声波提取的超声功率为600W，超声频率为40KHz，每次提取的时间为30min。

S3、将上述提取液用500目的尼龙滤布进行抽滤，取滤液，并置于45℃的温度下进行真空浓缩后，再进行冻干处理，即可得到欧李原花青素（冻干粉）。

试验例：

一、欧李原花青素抗骨质疏松症及调节肠道菌群代谢物的检测方法，具体的，以上述实施例5制得的欧李原花青素（冻干粉）按照1.5g/kg BW（体重）的用量进行以下药效实验：

1、绝经后骨质疏松小鼠模型的建立

以C57/BL6N雌性小鼠作为动物实验材料（C57/BL6N雌性小鼠为11周龄，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供），C57/BL6N雌性小鼠适应性培养3 d后，进行双侧卵巢切除术。使用戊巴比妥钠（1%，50 mg/kg，腹腔注射）麻醉成功后，俯卧位固定小鼠，背部备皮，切口区域使用75%酒精擦拭消毒。于肋下1 cm作一长约1 cm的纵行切口，切开筋膜，钝性分离肌肉及腹膜，在肠系膜脂肪中找到呈红色的、大小约3-4 mm的卵巢，在子宫角上用丝线结扎输卵管，完整摘除卵巢。使用同样的方法切除对侧卵巢及输卵管。逐层缝合肌肉及皮肤。

待小鼠创口恢复3 d后，随机分为6小组（n=8），分别为假手术组、模型组、阳性药组（戊酸***，商品名“补佳乐”，由拜耳公司提供）、欧李原花青素组。对应的，假手术组合模型组灌胃生理盐水，阳性药物组灌胃补佳乐混悬液（浓度 0.15 mg/kg BW），欧李原花青素冻干粉复溶于水。灌胃周期为8周，期间正常进食。

2、骨密度及骨组织形态学检测

小鼠饲喂8周，禁食12 h，处死，取出双侧股骨，剔除周围软组织，置于10%中性***中固定24 h后。

2.1、Micro-CT扫描

仪器型号：Skyscan1174 X-Ray Microtomograph (Micro CT)：比利时Bruker公司。检测条件：采用Skyscan1174型Micro CT的Scaner软件对各样本进行扫描。扫描参数：电压50kV，电流800 μA，以12μm 扫描分辨率、1304×1024视野大小对小鼠股骨进行扫描。将股骨膝关节侧的生长板最底端定为扫描参考线，将此平面下的51张连续切片，即厚度约为0.6mm的区域设定为三维重建兴趣区域 (ROI)，用N-Recon软件进行三维图像重建，用CT-AN软件进行三维分析。

2.2、H&E染色

2.2.1、组织石蜡包埋切片实验步骤

取材：新鲜组织固定于4%多聚甲醛24 h以上。将组织从固定液取出在通风橱内用手术刀将目的部位组织修平整，将修切好的组织和对应的标签放于脱水盒内。

脱水：将脱水盒放进吊篮里于脱水机内依次梯度酒精进行脱水。75%酒精4 h-85%酒精2 h-90%酒精2 h-95%酒精1 h-无水乙醇I 30 min-无水乙醇II 30 min-醇苯5-10min-二甲苯I 5-10 min-二甲苯II 5-10 min-蜡I 1 h-蜡II 1 h-蜡III 1 h。

包埋：将浸好蜡的组织于包埋机内进行包埋。先将融化的蜡放入包埋框，待蜡凝固之前将组织从脱水盒内取出按照包埋面的要求放入包埋框并贴上对应的标签。于-20℃冻台冷却，蜡凝固后将蜡块从包埋框中取出并修整蜡块。

切片：将修整好的蜡块置于石蜡切片机上切片，片厚4 μm。切片漂浮于摊片机40℃温水上将组织展平，用载玻片将组织捞起，并放进60℃ 烘箱内烤片。待水烤干蜡烤化后取出常温保存备用。

2.2.2、HE染色实验步骤

石蜡切片脱蜡至水：依次将切片放入二甲苯Ⅰ 20 min-二甲苯Ⅱ 20 min-无水乙醇Ⅰ10 min-无水乙醇Ⅱ 10 min-95%酒精5 min-90%酒精5 min-80%酒精5 min-70%酒精5 min-蒸馏水洗。

苏木素染细胞核：切片入Harris苏木素染3-8 min，自来水洗，1%的盐酸酒精分化数秒，自来水冲洗，0.6%氨水返蓝，流水冲洗。

伊红染细胞质：切片入伊红染液中染色1-3 min。

脱水封片：将切片依次放入95%酒精I 5 min -95%酒精II 5 min-无水乙醇Ⅰ 5min -无水乙醇Ⅱ 5 min -二甲苯Ⅰ 5 min -二甲苯Ⅱ 5 min中脱水透明，将切片从二甲苯拿出来稍晾干，中性树胶封片。显微镜镜检，图像采集分析。

2.2.3、TRAP染色

石蜡切片脱蜡至水：依次将切片放入二甲苯Ⅰ 20 min-二甲苯Ⅱ 20 min-无水乙醇Ⅰ 5min-无水乙醇Ⅱ 5 min-75%酒精5 min，自来水洗，蒸馏水洗三遍。

工作液配制：亚硝酸钠与副品红溶液各取500 μL混合均匀，加入醋酸钠缓冲溶液18 mL混匀，再加入萘酚AS-BI磷酸酯液1 mL，称取酒石酸钾钠0.282 g最后加入，充分溶解即为工作液。

孵育染色：滴加工作液于组织切片上，置于37℃孵育1-2 h，蒸馏水洗3遍。

苏木素染色：切片入苏木素染液染3-5 min，自来水洗，分化液分化，自来水洗，返蓝液返蓝，流水冲洗。

脱水封片：切片依次放入无水乙醇I 5 min -无水乙醇II 5 min-无水乙醇Ⅲ 5min -二甲苯Ⅰ 5 min-二甲苯Ⅱ 5 min透明，中性树胶封片。显微镜镜检，图像采集分析。

3、***及血清骨转换标志物ELISA法检测

眼球取血后获得血清，按照ELISA试剂盒（上海酶联）说明，检测刺激素指标：***（E2）；骨转换标志物指标：小鼠I型前胶原氨基端前肽（PINP），小鼠骨保护素(OPG)，小鼠核因子κB受体活化因子配基(RANKL)。

4、欧李原花青素对肠道菌群代谢物的调控

采用气相色谱方法检测粪便中肠道菌群的代谢物，短链脂肪酸。

气相色谱条件：Aglient 7890A GC，FID火焰离子化检测器，DB-WAX高效毛细管色谱柱（Aglient，30 mⅹ250 mⅹ0.25 m）；进样口温度230℃，检测器温度230℃；柱温为程序升温方式，程序升温条件为：初始温度100℃，保持1 min，以3℃/min升温至130℃，保持1min，再以20℃/min升温至200℃，保持1 min；分流进样，分流比50：1；载气为氮气，纯度99.999%；流速1 mL/min；氢气:空气:氮气=1:10:1；进样量5 μL。

标准曲线的制备：分别取乙酸、丙酸、正丁酸、异丁酸、正戊酸、异戊酸、环己酮各对照品贮备液加一定量水制备对照品与内标环己酮贮备液，分别稀释至一定浓度梯度，并加入一定量内标水制样，进样测定。分别取一定量各标准品贮备液混合，加入内标水，制备混合对照品溶液，进样测定。制备对照品浓度-对照品峰面积/内标峰面积标准曲线。

样品前处理：小鼠摘眼球取血后颈椎脱臼处死，摘取结肠部分，将肠道内容物挤出于锡箔纸上。将采集的结肠内容物冻干冻存至-80℃冰箱待测。采用气相色谱法测定结肠内容物中乙酸、丙酸、异丁酸、正丁酸、异戊酸、正戊酸的含量，环己酮为内标。精密取冻干结肠内容物150.00 mg，加入0.75 mL含内标水溶液，用色谱甲酸调pH至2-3，涡旋震荡2 min，静置15 min，涡旋1 min，离心15000 rpm，20 min。取上清液过0.22 μm滤膜，进样测定。

二、试验结果：

1、欧李原花青素对骨质疏松小鼠的骨组织结构的影响的试验结果如附图1和附图2所示。

其中，图1为不同组的小鼠股骨干骺端micro-CT三维扫描图。从图1中可以清楚看到模型组中的骨量由于卵巢去势术，造成了骨小梁微结构的破坏，其骨量明显减少。而阳性药和欧李原花青素组的骨量较模型组明显增加。

另外，图2为不同组的小鼠股骨干骺端H&E染色图。从图2中可以清晰的看出卵巢去势术导致模型组的骨质流失，骨小梁结构明显被破坏，骨组织中出现大量空洞。阳性药组及欧李原花青素组能够保护骨小梁微结构，防止骨质流失，抵抗卵巢去势术诱导的骨质疏松；

2、欧李原花青素对破骨细胞的影响的试验结果如附图3所示。

其中，图3为不同组的小鼠股骨干骺端TRAP染色图。TRAP染色反应通过标记破骨细胞的特异性标志酶，使其呈现红色。由图3可得，模型组中破骨细胞数量较假手术组增多，同时，骨组织中的空洞明显增多，骨小梁间的空隙也明显增大。而欧李原花青素组被TRAP标记成红色的破骨细胞数量较模型组降低，骨组织结构紧密，骨骼中的空洞明显减少。这一结果进一步说明了欧李原花青素具有抑制破骨细胞形成，保护骨小梁微结构，抵抗骨质疏松的生物活性。

3、欧李原花青素对机体***及血清骨转换标志物的影响的试验结果如附图4~6所示。

其中，图4为不同组的小鼠机体的***（E2）分泌水平对比图。从图4可以看出，卵巢去势术导致模型组小鼠机体***（E2）分泌较假手术组显著降低（p＜0.0001），补充阳性药，即戊酸***能显著升高***水平（p＜0.01），而欧李原花青素同样也能显著提高机体***水平（p＜0.0001），使其恢复至近正常小鼠的激素水平。这一结果说明，欧李原花青素能够调节机体***分泌，对绝经后激素紊乱导致的骨质疏松症具有调控作用。

另外，图5~6分别为不同组的小鼠机体的PINP水平和OPG/sRANKL水平对比图。从图5~6可以看出，模型组的PINP水平较假手术组显著下降，差异具有显著性（p＜0.0001）。阳性药组中，PINP水平较模型组略有升高，而欧李原花青素可显著提高PINP水平（p＜0.01），表明欧李原花青素可促进骨形成。同时，欧李原花青素组中，骨重建代谢轴OPG/sRANKL的比值较模型组显著升高（p＜0.01），进一步说明欧李原花青素可使骨代谢往成骨方向移动，促进骨形成。

4、欧李原花青素对肠道菌群代谢物的影响的试验结果如附图7~12所示。

其中，短链脂肪酸是肠道菌群发酵膳食纤维的终产物，不仅可为肠道菌群提供能量和养分，也能维持大肠的正常功能和结肠上皮细胞的形态和功能，也可吸收入血，调节机体代谢。其中丁酸是最重要的一种短链脂肪酸，是人类结肠盲肠上皮细胞重要的能量来源。

另外，图7~12分别为不同组的小鼠粪便中的乙酸、丙酸、异丁酸、正丁酸、异戊酸和正戊酸的含量对比图（各短链脂肪酸的含量均用气相色谱法进行测量）。从图7~12中可以看出，欧李原花青素组较模型组显著提高了正丁酸（p＜0.0001）、异丁酸（p＜0.01）、正戊酸（p＜0.001）、异戊酸（p＜0.001）的水平，其表明欧李原花青素经小鼠胃肠道分解代谢，可参与调控肠道菌群的代谢，以促进短链脂肪酸的形成。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。