具体实施方式

在已经公开的那些益处和改进中，本发明的其他目的和优点将从以下结合附图的描述中变得明显。本文公开了本发明的详细实施方式；然而，应当理解，所公开的实施方式仅仅是可以以各种形式体现的公开内容的说明。此外，关于本发明的各种实施方式给出的每个示例旨在说明而非限制。

在整个说明书和权利要求中，除非上下文另有明确规定，否则以下术语采用与本文明确相关的含义。此处使用的短语“在一个实施方式中”、“在实施方式中”和“在一些实施方式中”不一定指代相同的实施方式，尽管它可能指代同一实施方式。此外，这里使用的短语“在另一个实施方案中”和“在一些其他实施方案中”不一定指不同的实施方案，尽管它可能指代同一实施方案。本发明的所有实施方式在不脱离本公开的范围或精神的情况下是可组合的。

如本文所用，除非上下文另有明确规定，术语“基于”不是排他性的，并且允许基于未描述的附加因素。此外，在整个说明书中，各个项目和“此”的含义包括复数引用。“之中”的含义包括“之中”和“之上”。

本文中引用的所有在先专利、出版物和测试方法均通过引用整体并入。

角膜是无血管器官，其通过扩散从角膜缘的脉管系统获得营养。因此，鉴于其生理上孤立的情况，它很容易受到营养缺乏的影响。此外，由于角膜是一种半刚性结构，包含紧密粘附的细胞以形成相对不可渗透的组织，因此它是药理干预的一个具有挑战性的障碍。事实上，角膜是一道屏障，其难以扩散(diffuse)并且更难以穿过(traverse)。亲脂性药物分子向角膜的递送尤其受到角膜上皮环境的极性的影响。结果，亲脂性分子抵达眼前节上皮细胞的能力受损，因此更不可能在这些细胞中发挥药理作用。其他药理学挑战来自亲脂性药物通过眼前节的吸收不良，这降低了在眼后节实现亲脂性药物最小活性浓度的机会。上述将亲脂性药物递送至眼部的挑战的综合影响使得在眼后节实现药理作用的可能性微乎其微。

乳液是在多种药物制剂中使用的药物载体。乳液的主要药理学优势是它们能够将油相与水/水介质结合，其中油和水之间的表面张力由表面活性剂维持。近年来，已经开发出新技术来生产纳米乳液，其中油滴的尺寸小于300纳米。与常规乳液相比，纳米乳液的粒径提供了更稳定的热力学条件。在药理学上，纳米乳液技术提供了配制药物分子的外用(topical)乳液的机会，其使用先前公开的技术配制时稳定性较差。作为一种实用的载体，纳米乳液现在用于各种局部应用的制剂中。

本发明人已经发现，本文所述的特定纳米乳液制剂可以令人惊奇地用作药物递送系统，用于将亲脂性药物和营养物(例如，维生素D)递送至眼部。这些纳米乳液出人意料的特性赋予了将亲脂性药物和营养物质有效地递送到角膜屏障中并穿过角膜屏障的能力。用于眼部的局部制剂必须考虑眼部的物理特性和与之相关的挑战。例如，角膜表面非常光滑，不断被泪水冲洗，被眼睑扫过。这些特征最大限度地减少了角膜上皮吸收治疗剂或营养物的停留时间。此外，角膜上皮层之间的紧密连接使角膜相对不可渗透，使药物分子几乎不可能扩散到角膜中。角膜的疏脂结构带来了额外的挑战。角膜的上述物理特性使得通过角膜到达眼后节的渗透更加困难。

本文呈现的结果表明，本文描述的纳米乳液的令人惊奇的特性可以被调整以最大限度地将特定的亲脂性试剂(例如药物分子和营养物)递送至眼部，甚至是已知对眼部有刺激性并通常无法被患者耐受(特别持续较长时间)的亲脂性试剂。对于本文描述的纳米乳液制剂，针对优化的示例性亲脂剂是维生素D。

本文描述的纳米乳液的独特和令人惊奇的特性促进了更长的角膜停留时间、增强了亲脂剂和角膜之间的稳定接触，以及增强了角膜渗透。关于更长的角膜停留时间，本文所述的纳米乳液制剂模仿天然泪膜的脂质部分的行为，从而保持制剂中的亲脂剂与角膜之间的接触持续长达几分钟。这与包含药物分子的标准滴眼剂制剂(通常其仅与角膜接触几秒钟)形成鲜明对比。事实上，本发明的纳米乳液制剂已被设计为表现出与角膜接触的停留时间延长，比得上角膜与泪膜脂质相的10分钟。因此，本文所述的纳米乳液制剂提供了持续时间延长的治疗，该持续时间足以改善亲脂性试剂至角膜上皮层和眼后节的扩散。这些特性使包含本文所述亲脂性试剂的纳米乳液制剂的治疗功效最大化。

对于在亲脂性试剂和角膜之间提供增强的稳定接触，本文所述的纳米乳液制剂在施用于眼部时形成三层的动态结构。参见图1。纳米乳液制剂的最上层(离角膜最远)包含油相；中间层包含磷脂；与角膜接触的下层主要包括水。因此，水相(aqueous)/水(water)层与角膜直接接触并充当角膜上皮细胞在其中浸没的储库。因此，药物分子必须以足够的浓度存在于水相/水层中，以达到产生治疗效果所必需的吸收水平。由于亲脂性分子在热力学上倾向于粘附在上层油性环境中，因此它们通常被排除在水相/水层之外，从而削弱了它们向角膜上皮细胞的传递。本文所述的纳米乳液制剂通过产生动态结构克服了这种递送障碍，其中被磷脂包围的亲脂性试剂(例如药物分子或营养物)球体连续循环进入水/水层并紧邻上皮细胞递送在其中的亲脂性分子。本文所述的纳米乳液制剂的这种结构/功能特征产生了动态平衡，其促进了亲脂性分子向角膜上皮细胞的有效递送并由此被吸收。

关于提供增强的角膜渗透，本文所述的纳米乳液制剂专门设计用于渗透巩膜和角膜。由于角膜细胞之间存在专门的紧密连接，巩膜几乎是不可渗透的，并且角膜对扩散具有很强的抵抗力。当以合适的浓度和比例使用时，本发明的纳米乳液制剂的磷脂组分令人惊讶地充当促进亲脂性分子扩散进入和穿过角膜的渗透促进剂，从而提供使亲脂性分子更好的吸收和由此产生的改善的治疗功效。

更长的角膜停留时间、亲脂性试剂和角膜之间增强的稳定接触，以及增强的角膜渗透性的组合效应使得本文所述的纳米乳液制剂可以明显更多地将亲脂性分子吸收到眼前节和眼后节中。因此，这些纳米乳液制剂为亲脂性药物和亲脂性营养素提供了有效的眼部药物递送系统。除上述之外，还提供了用于治疗眼前节和眼后节疾病的药物组合物，其包含至少一种亲脂剂(例如，亲脂药物或亲脂营养素)、磷脂和眼部(ophthalmologically)可接受的载体。

术语“治疗”是指减轻各种眼疾的一些不希望的症状，和/或治愈眼疾。纳米乳液制剂和/或组合物也可用于维持眼部的正常健康。

术语“眼前节”是指角膜和结膜上皮并包括上皮细胞以及存在于上皮中的腺体。

术语“眼前节疾病”是指引起或由角膜或结膜上皮中的至少一个的物理损伤、包括角膜或结膜上皮的细胞的再生率降低和结膜上皮中腺体分泌物的减少导致的疾病。为了治疗眼前节疾病，活性药物成分(API)必须至少达到在眼前节具有药理作用的最小浓度。

眼部眼前节的典型病症由以下引起：角膜机械磨损导致的物理或化学损伤、佩戴隐形眼镜造成的角膜上皮缺损、上皮自发剥离造成的角膜上皮缺损、光反应角膜切除术后的角膜损伤、化学物质引起的损伤、紫外线照射引起的损伤、损害角膜上皮和结膜的全身性疾病(例如Sjorgren综合征、Steven-Johnson综合征、瘢痕性类天疱疮综合征)、角膜慢性水肿伴上皮细胞反复糜烂等。

由细胞再生率降低引起的眼前段的典型病症包括：由于年老或抗增殖治疗引起的眼部退化。本发明的药物组合物可以施用于患有以下疾病的人：导致角膜或结膜上皮损伤的疾病、或经过已知会导致这种损伤的治疗，例如激光或放射状角膜切除术或各种全身性或局部药物的给药。

术语“磷脂”是指一类脂质，其包含连接有一个或多个脂肪酸的甘油或鞘氨醇平台和连接有醇的磷酸基团。天然存在的磷脂包括例如磷脂酰胆碱、磷脂酰丝氨酸和磷脂酰肌醇。

在一个特定的实施方式中，油相包含中链甘油三酯和/或植物油，包括但不限于大豆油。在更具体的实施方式中，油相由中链甘油三酯和大豆油组成。

本文所述的药物制剂或组合物包含0.1-20％，更特别地0.2-10％范围内的油相。磷脂的浓度应在每体积0.01-10％重量的范围内。在一个特定的实施方式中，磷脂占油相的12％。活性药物成分的浓度可以低至每体积0.0001％重量。可基于添加到制剂/组合物中的特定活性药物成分来调节油相和磷脂含量的具体比例。

本文描述的药物制剂/组合物中所用的磷脂包括但不限于可从商业供应商例如Lipoid AG获得的磷脂。示例性的磷脂包括E80和S-75，它们可以从Lipoid AG购买。

维生素D纳米乳液作为滴眼剂形式的紫外线防护剂

阳光直射对人类皮肤的破坏作用是众所周知的并且存在记录。皮肤红斑、色素沉着和皮肤癌都与过度暴露在阳光直射下有关。然而，高能光和强光也会对人眼产生大量的伤害。日光性视网膜病变、光性角膜炎、点状角膜炎和辐射性白内障只是由阳光引起的医疗状况的几个例子。主要损害由紫外线辐射(100-400nm)引起，紫外线辐射吸收后会将其能量转移到角膜、晶状体和视网膜上。

眼组织的损伤已被一再证明，更常见于专业人员和在户外花费大量时间的人，例如暴露于直接太阳光的军事人员、基础设施工人、水上运动员、冰雪运动员和所有户外运动员。与紫外线相关的眼部发病率也在上升，引起了医生和医疗保健系统的极大关注。根据2008年美国陆军伤害预防报告，超过10％的眼外伤是由光性角膜炎和点状角膜炎引起的，两者都受到阳光直射的影响。此外，研究表明紫外线光性角膜炎可能在阳光下仅30分钟后出现，这使普通人每天暴露在阈值剂量下。太阳镜确实很好地保护了眼部，但它们对视力分辨率的产生限制性影响，并且它们的使用环境并不总是适用。

如本文所述，维生素D纳米乳液技术减少了穿过类似于眼部上的天然泪膜的薄层的UV辐射。滴眼剂纳米乳液制剂可减少到达眼部组织的辐射量。该制剂在UV-B范围内有效，该范围对眼部的伤害最大(280-320nm)。本文所述的维生素D纳米乳液将完全暴露于阳光直射下的有效辐射强度降低多达75％。除了直接的紫外线防护外，本文所述的维生素D纳米乳液使角膜表面保持在水合和润滑状态，从而使眼部表面不易受到恶劣环境条件的影响。

蓝光和直接眼部效应

众所周知，临睡前使用便携式发光装置具有生物学效应，其可能导致长期睡眠不足并打乱昼夜节律，这两者都可能对表现、健康和安全产生不利影响。

伴随着计算机使用的增加，数字眼疲劳同时增加，大约50％的计算机用户遭受分为两大类的症状：与调节性或双眼视觉压力有关的症状、以及与干眼症相关的那些有关的外部症状。

科学文献表明，蓝光的影响不仅限于眼部疲劳，而且蓝光对眼部也有直接影响。创造了“蓝光危害”一词来描述这种光对眼部内的关键结构造成的危险，并且专注于预防蓝光的公司正在开发保护眼部免受这种危害的技术。高能蓝光可以通过角膜和晶状体一直到达视网膜，导致干眼症、白内障和老年性黄斑变性等疾病，以及抑制褪黑素分泌，增强肾上腺皮质激素的产生等不利影响。研究人员建议用户在使用蓝光相关产品时应采取适当的保护措施，尤其是在夜间。

看到的影响包括在眼部表面的那些影响。研究人员表明，短时间使用视觉显示终端可降低志愿者泪膜的稳定性，夜晚模式可能比正常模式对眼表造成的伤害更小。研究人员得出结论，来自视觉显示终端的高能蓝光可能是眼表损伤的危险因素。然而，这种损害是可以逆转的。

已经进行了很多研究来确定蓝光诱导的眼部损伤的机制。人角膜上皮细胞研究中的体外蓝光研究表明，蓝光会增加活性氧(ROS)的产生和相关损伤。对干眼病的研究表明，泪膜高渗透压与通过ROS诱导的信号通路引起的炎症严重程度之间存在关联。还研究了可见光对人角膜上皮细胞的影响以及天然抗氧化剂对过度暴露于光产生的氧化应激的影响。

其他研究人员已经研究了过度暴露于具有各种波长的发光二极管(LED)衍生光对小鼠眼表的影响。他们得出结论，过度暴露于短波长的蓝光会导致角膜氧化损伤和细胞凋亡，这可能表现为眼表炎症增加和由此产生的干眼症。高渗压力也被证明会影响光毒性，进一步表明干眼病患者可能对蓝光眼部毒性更敏感。事实上，之前已经证明干眼症患者在佩戴具有50％蓝光阻隔镜片的眼镜时平均功能性视敏度和视力维持率有显著改善，这种效果在健康对照中是看不到的。

蓝光的影响不限于眼部表面。蓝光对视网膜的损伤得到了急性和慢性暴露研究的支持。视网膜对较短波长的光最为敏感(显示最大敏感度在441nm处)。较短可见光波长(至多500nm)下的视网膜损伤主要是光化学性质的(与纯热效应相比)。此外，已经在体外和体内证明了蓝光引起的视网膜光化学损伤。人类视网膜细胞的体外研究已经确定了导致氧化损伤的细胞信号通路，氧化损伤会增加视网膜光损伤的风险，并有助于与年龄相关的黄斑病变的发展。即使是显示设备中使用的低强度的蓝光，该蓝光也可以诱导视网膜细胞中的ROS产生和细胞凋亡。使用LED蓝光暴露的体内研究表明，这种暴露会导致清醒、以任务为导向的杆显性动物(task-oriented rod-dominant animals)的视网膜损伤。这种损伤可以由商用发光二极管(LED)诱导，产生特征为使光感受器严重损伤和诱导坏死的光毒性。进一步的体内研究(大鼠模型)表明，白光LED的蓝色成分在家庭职业照度下可能会引起视网膜毒性，而不仅仅是在极端实验条件下。当前针对(光)暴露的法规和标准是在急性光暴露的基础上建立的，没有考虑重复暴露的影响。

有趣的是，白光的蓝色成分也已显示导致视网膜色素上皮的血视网膜屏障功能障碍。研究人员建议，当使用手术显微镜时，应在人类眼科手术中使用蓝光阻挡滤光片。

过滤器可用于减少蓝光的影响。在干眼症患者中，蓝光过滤器(环绕护目镜)已被用于改善计算机视觉综合症。研究人员表示，所有过滤水平下的眼部投诉评分均有所降低。其他研究表明，严重的闪烁融合频率(flicker–fusion frequency)和眼部周围/内部的疼痛发生减少，并且在任务后眼部发痒的感觉也减少了。滤蓝光眼镜片可以部分过滤高能短波光，而不会显著降低视觉性能和睡眠质量。这些镜片可作为保护视网膜免受潜在蓝光危害的补充选择。

蓝光过滤器已在体外使用。其中一项研究着眼于对角膜表面来源的原代人类细胞进行蓝光照射。根据施加蓝光后24小时的活性评估得出结论，蓝光会伤害眼表细胞。遮盖可保护细胞免受损害。研究人员建议使用蓝光保护来维持眼部健康，尤其是干眼症患者、隐形眼镜使用者、营养不良者和老年人等高危人群。事实上，自1980年代以来，已经在白内障患者中使用了模仿自然人晶状体的蓝光过滤人工晶状体植入术。对这些眼内过滤器的现有临床研究的回顾表明，它们应被视为一种安全且相对便宜的预防措施，以降低人工晶状体眼中视网膜光毒性的潜在风险及其相关的年龄相关性黄斑变性(AMD)的潜在风险。

停留时间的延长

如上文所述，眼部表面是一种独特的组织，它创造了一个以治疗有效量递送治疗分子的具有挑战性的环境。表面的光滑度、眼泪的持续流动和眼睑的定期清洁减少了治疗分子可被角膜上皮吸收的时间。这对于亲水性分子来说是一个挑战，而对于亲脂性分子来说则更具挑战性，因为它们必须克服眼部表面极性环境对它们的物理-化学排斥。鉴于维生素D是一种油性/亲脂性分子，当局部给药时，它在眼部表面的停留时间非常短。这种现象是由于眼部表面的自然水性环境以及角膜上皮的极性，并结合泪流和眼睑扫动效应。由此导致维生素D从眼部表面快速去除，使得将有效量的外用维生素D施用于眼部以提供治疗或营养变得非常困难。令人惊讶的发现，当局部应用于眼部时，维生素D在含磷脂的纳米乳液中的特定组合在眼表上的停留时间更长，从而促进角膜上皮对维生素D的吸收，这一发现解决了如何将治疗有效量和/或营养有效量的维生素D局部用于眼部而不引起刺激的给药问题。这些发现导致了局部、眼部的包含维生素D的含磷脂纳米乳液制剂及其使用方法。

浓度和比例

综上所述，设想了维生素D在磷脂纳米乳液中的具体制剂，其中乳化颗粒的粒径范围为直径100-300纳米；维生素D的浓度在0.02％至2％重量/重量范围内；磷脂在特定的比例范围内，通常与制剂中的维生素D含量的比例为3:1。包含在本文所述制剂中的维生素D可以是非活性、部分活性或活性形式。

在一个具体实施方式中，包含维生素D的含磷脂纳米乳液如下：

-惰性纳米乳液(不含API)，其包含0.3％w/v的磷脂；

-磷脂包括卵磷脂和大豆磷脂中的至少一种；

-磷脂的浓度为0.1％至10％w/v；

-维生素D的浓度范围为0.001至1％w/v。在一个特定实施方式中，维生素D的浓度为0.01％w/v；

-包含维生素D的含磷脂纳米乳液是逐滴给药的，其中每滴约0.05ml。

在一个特定的实施方式中，本文所述的包含维生素D的磷脂纳米乳液的制剂/组合物不包含液化或压缩气体推进剂。换言之，如本文所述的包含维生素D的磷脂纳米乳液的制剂/组合物包含0％的液化或压缩气体推进剂。因此，本公开的包含维生素D的磷脂纳米乳液的制剂/组合物不是泡沫气雾剂。

本文所述的制剂是透明的并且不包含用于泡沫气雾剂的强表面活性剂。这种强表面活性剂是禁忌的，至少是因为它们会刺激眼部。

如本领域所理解的和例如在美国药典中所定义的，推进剂在气雾剂系统内提供必要的压力以将材料从容器中排出，并且与其他组分组合以将其中的材料转化为所需的物理形式。推进剂被广泛地归类为蒸气压通常超过大气压的液化或压缩气体。

如本领域所理解的和例如在美国药典中定义的，泡沫气雾剂是包含一种或多种活性成分、表面活性剂、水性或非水性液体和推进剂的乳液。

粒径

如本文所述，磷脂纳米乳液中的乳化颗粒的粒径范围为直径100-300纳米。在具体的实施方式中，磷脂纳米乳液中的乳化颗粒的粒径范围为直径100-150、100-200、100-250、100-300、150-200、150-250、150-300、200-250、200-300或250-300纳米(nm)。在一个特定的实施方式中，磷脂纳米乳液中的乳化颗粒的粒径为直径约200nm。在一个特定的实施方式中，磷脂纳米乳液中的乳化颗粒包含平均粒径为直径约200nm的乳化颗粒群组(population)。在进一步的具体实施方式中，磷脂纳米乳液中的乳化颗粒包括乳化颗粒群组，其中群组的50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％以上具有直径约200nm的平均粒径。

维生素D

维生素D在人体中起重要作用，并且在维持多种器官系统的正常功能方面很重要。我们对维生素D缺乏症影响的了解呈指数级增长，健康专业人士正在通过定期补充维生素D来满足新发现的需求。维生素D缺乏症对器官系统及其功能的不利影响包括但不限于：骨矿化、肌肉无力、免疫系统和心血管系统。

科学家和医学从业者最近将他们的注意力集中在维生素D对眼系统的重要性上。维生素D已被证明对眼部的活力和健康有巨大贡献，对眼前节(前部)和眼后节(后部)都有重要影响。

例如，角膜细胞可以将维生素D转化为其活性代谢物1,25D3(维生素D3)，其方式类似于发生在皮肤中的转化过程。此外，当暴露于UVB时，角膜上皮细胞也被证明可以从头产生维生素D。这些基本能力揭示了维生素D在眼系统中的生物学意义，并证实了涉及维生素D和眼系统及其功能的基础科学和临床研究的数量。维生素D与眼部系统之间存在联系的进一步证据是在所检查的大量人类对象中发现近视与血清维生素D水平之间存在正相关关系。其他研究证实了这些发现，并确认接受检查的近视参与者的维生素D水平较低。用于测量疾病前病理变化的光学相干断层扫描(CT)还表明，维生素D不足与黄斑厚度减少有关。其他研究表明，患有视网膜下纤维化的年龄相关性黄斑变性(AMD)患者的血清维生素D水平显著低于没有纤维化的患者。

维生素D抑制新血管形成的能力已促使研究人员检查其在糖尿病视网膜病变发展中的作用。流行病学研究报道，血清维生素D浓度与糖尿病患者视网膜病变的严重程度呈负相关。维生素D代谢的遗传变异也与葡萄膜炎有关，葡萄膜炎是一种称为葡萄膜的眼球中间层的炎症。

其他研究提供的证据表明，补充维生素D不仅在活动性炎症期间有益，而且通过维持正常的眼部健康和功能来预防此类疾病。

在一个特定的实施方式中，本文所述的药物组合物以滴眼剂或眼药膏的形式给药。在更具体的实施方式中，本文所述的药物组合物以进一步包含眼科可接受载体的滴眼剂或眼药膏的形式给药。如本文所述，组合物为纳米乳液形式。

对于一些适应症，本文所述的药物组合物是低渗组合物。在其特定实施方式中，使用低渗药物制剂，其中眼部疾病与眼表上的高浓度盐有关。在另一个实施方式中，对特定药物制剂的物理-化学限制要求低渗制剂。然而，通常施用于眼部的制剂是等渗的眼用制剂，以尽量减少对它们所施用的眼部的刺激。然而，本文所述的磷脂纳米乳液制剂的独特组合物提供了不刺激眼部的低渗眼部制剂。本文描述的纳米乳液制剂的这一特征为有需要的患者提供了治疗干预的新选择，这在本发现之前是不可能的或非常不方便的。

对于一些适应症，本文所述的药物组合物是高渗组合物。在其特定的实施方式中，使用低渗药物制剂，其中待治疗的眼部疾病与眼部的液体清除降低和由此导致的水停留有关，这最终导致眼膜破裂。在这种情况下，本文所述的组合物以高渗制剂存在，其用于从眼中吸取过量液体。此类高渗制剂可以例如通过向组合物中添加盐(例如，NaCl)来形成。

此外，药物活性成分的一些物理-化学特性要求在眼部制剂中使用高渗制剂。然而，此类眼用药物的高渗透压对眼部有刺激性，因此限制了可有效治疗眼病的药物的使用。本文所述的药物制剂减少了高渗制剂的刺激作用，如此为开发包含原本由于高渗性而不能配置为眼部治疗物的治疗剂的眼部药物提供了新的机会。本文所述的药物制剂还可提供重新配制现有高渗制剂以产生较少刺激的眼部治疗物的机会。

又一方面，设想了一种用于储存和维持分离的角膜(例如，在眼库中)的制剂或组合物。为了维持上皮细胞以及暴露的眼部内皮细胞的活力，有必要使亲脂性营养物质能够渗透到角膜细胞中。本文所述的纳米乳液制剂可用作分离角膜的储存介质，以优化保存组织的保质期和质量。

维生素D纳米乳液的透明度

本发明人已经证明，在可见光波长(400-700nm)下，包含维生素D的含磷脂纳米乳液不散射光，因此在使用该纳米乳液治疗时不会妨碍对象(例如，人类患者或动物对象)的视力。这些发现在例如图4中给出。如图4所示，在可见光光谱范围内(白光灯)，可以通过纳米乳液层看到高分辨率图像。该薄层模仿角膜上泪层的实际厚度。这些发现说明了本文所述的包含维生素D的含磷脂纳米乳液的显著特性。

维生素D纳米乳液的其他物理/结构特性

本发明人通过分析纳米乳液中乳化颗粒的尺寸和任何气泡的直径，进一步表征了本文所述的包含维生素D的含磷脂纳米乳液。他们的分析表明，在本纳米乳液中发现的气泡非常少。如图2所示的显微镜载玻片的照片，其中在该载玻片上放置了包含维生素D的含磷脂纳米乳液，在纳米乳液制剂的3x5m²区域中仅发现5个气泡。气泡的直径约为90微米。本发明人还确定了包含维生素的含磷脂纳米乳液中乳化颗粒的尺寸为约200纳米。

在另一个实验中，本发明人用显微镜检查了包含维生素D的含磷脂纳米乳液，并确定在7X5mm²的载玻片区域中没有检测到气泡，其中纳米乳液均匀分布在两个玻璃片之间。参见图3。

本发明人还检查了包含维生素D的含磷脂纳米乳液的透明度，并发现通过纳米乳液的薄层很好地保持了分辨率。参见图5。该测定是相对于60纳米宽的20条线的参考分辨率在1200纳米线上做出的，使用40X放大倍数观察。参见图4。

例如，图2至图5中呈现的结果表明本文所述的包含维生素D的含磷脂纳米乳液是透明的并且不损害分辨率。因此，本文所述的包含维生素D的含磷脂纳米乳液具有会保持向眼部局部施用纳米乳液的对象的视力的特性。本文呈现的结果还证明本发明的纳米乳液不是泡沫。

维生素D的细胞渗透性的比较研究

可以使用人角膜缘上皮细胞系作为角膜上皮细胞吸收的模型系统来测定维生素D吸收。在一个具体实施方式中，可以将来自包含维生素D的含磷脂纳米乳液的维生素D吸收与来自包含维生素D的油性制剂的吸收进行比较。

简而言之，将细胞在油性培养基/制剂或含磷脂的纳米乳液培养基中温育24小时，其中每种培养基包含10μM 7-脱氢胆固醇。然后将细胞暴露于UV-B(302nm)。在UV-B暴露之前立即用新鲜培养基补充细胞。在初次暴露于UV-B后，培养基不改变，以允许合成的维生素D代谢物的积累。细胞每天暴露于UV-B两次，总剂量为10或20mJ/cm²/天，分次并间隔6小时给药，持续三天。在最后一次UV-B暴露后1小时收集培养基并储存在-80℃，直到进行质谱分析以分析生成的维生素D代谢物。

替代地或补充地，细胞可以在油性培养基/制剂或含磷脂的纳米乳液培养基中培养24小时，其中每种培养基包含10μM 7-脱氢胆固醇。然后可以用新鲜培养基补充培养基，并且可以使用维生素D的质谱分析比较两种不同处理的细胞培养物的维生素D含量。

维生素D纳米乳液赋予的保护作用

分光光度测试，即扫描光波长(能量)和评估在每个特定能量下的吸光度，以评估本文所述的维生素D纳米乳液的保护作用。当施用于眼部时，本文所述的维生素D纳米乳液在无需戴上眼镜的情况下提供“太阳镜”的效果。通常人们在暴露于日光下时会使用太阳镜来阻挡暴露于各种频率的光。然而，当从屏幕上阅读或在人造光环境中工作时，人们通常不会使用防护眼镜。本文所述的维生素D纳米乳液在整个光谱范围内提供增强的UV保护[UVC：100-280nm，UV B：280-315nm，UV A：315-400nm，蓝光：400-495nm]。蓝光范围内的保护对于防止来自屏幕和人造光环境的光发射特别重要。因此，可施用本文所述的维生素D纳米乳液来提供在完整的紫外线+蓝光范围(100-495nm)(包括以下各个光谱范围：UV A、UV B、UVC以及蓝光范围)内的保护。

图6至图12显示如所指定稀释的纳米乳液(Lipimix基质)和维生素D纳米乳液[装载有维生素D(维生素D制剂)的Lipimix]的结果。因此，颗粒(球体)大小和比例(PL：维生素D)保持不变，只有维生素D浓度(wt/wt)发生变化。

测试每个指定制剂在宽能量范围(波长)上的吸收(在同一工具上，连续运行)，覆盖UV A、UV B、UV C和蓝光光谱。例如，图11示出了令人惊讶和意想不到的效果，它揭示了将维生素D掺入球体中会极大地改变基质的吸收特性。观察到的吸收增加远远超过效应的简单累积(如将水中的维生素D+Lipimix基质吸收值相加)。例如，图10示出了令人惊讶和意想不到的效果，它表明反复稀释维生素D纳米乳液不会导致吸收持续下降。这一发现令人惊讶，至少是因为人们预计降低球体密度会导致吸收的平行减少。这在维生素D制剂的第2次和第3次稀释之间观察到的Lipimix吸收中尤为明显。

除上述之外，防晒系数(SPF)通常通过分光光度法测量。这是一种广为接受的方法，在文献中常用来评估紫外线对皮肤的伤害等。

Lipitear和Lipicare SPF滴眼剂的UVB测量

本文描述的另一种测定为使用在整个UVB范围内积分的装置(数字UV计)以观察有多少能量到达检测器，检测器相当于眼部表面。简而言之：可以在2个透明聚合物条纹之间形成一层薄的纳米乳液，模仿眼部上层的厚度。白天(1000和1430小时)：

·“以mW/cm²为单位的UVB能量基线”：本发明人使用暴露的检测器测量了UVB光谱范围的总能量。这表示在此特定光谱范围内可以到达眼部的潜在危险辐射量。

·“聚合物基线”：本发明人用2个空白聚合物框架重复该测试以观察它们对测试的影响(中间没有液体)。

·“以mW/cm²为单位的UVB能量-惰性纳米乳液”：本发明人添加了一种具有相似物理特性但不含维生素D的纳米乳液(单独的空基质)，并证明到达眼部的辐射总量并未减少。

·“以mW/cm²为单位的UVB能量-维生素D纳米乳液”：本发明人用含有维生素D的纳米乳液替换了空基质(负载基质)，并证明到达眼部的UVB光量减少了50-70％。

以色列冬季时间

海拔0-50m OSL

方法：在两层透明聚丙烯45微米薄片(2x3cm²)之间加入0.3毫升液体

因此，含有维生素D的纳米乳液在该测定中赋予了吸收特性，从而证实了本文呈现的其他结果。

LIPITEAR^TM的兔子眼部安全性研究

目的

本研究的目的是测试三个测试项目与在LIPITEAR^TM中配制的两个比较物相比，在局部施用到兔眼中后的安全性。

在给药后的第一个24小时内进行3次临床观察，在前4小时内特别注意，此后每天两次，共三天。观察皮肤和毛皮的变化，特别是眼部和粘膜周围。

眼科评估(通过Draize量表，双眼)；使用灯，针对所有研究组，基线、给药后1小时和在首次给药后24小时、48小时、72小时、96小时和120小时(最后一次评估两眼)。

发病率和死亡率-每天两次(周末每天一次)。

体重测量-研究开始前。

选择测试系统的理由

使用NZW兔品系。使用这种常用实验室品系的健康成年动物(研究开始时为2.2-2.7kg)。兔子是该研究的选定物种，历史上一直用于安全性眼部研究。

测试组规模的基本原理

总共使用15只兔子并分成五组，每组三只兔子：一个维生素D滴眼剂组(维生素D-Lipitear制剂；测试项目1)；替代化合物A滴眼剂组(化合物A-Lipitear制剂；测试项目2)；一个参考组：Lipitear(现有产品)组；替代化合物B滴眼剂组(化合物B-Lipitear制剂；测试项目3)和一个参考组：对照产品组。维生素D-Lipitear制剂中维生素D的浓度为每100毫升最终乳液中100毫克维生素D。组数和动物总数是足以获得指示性/重要信息的每组最小动物数。

实验模型

动物

物种/品种

兔子/新西兰(NZW)

性别/数量/年龄

雄性/15/在研究开始时2.2-2.7kg

来源

Envigo RMS(以色列)有限公司

体重

研究开始时动物的平均(±SD)体重为2.4±0.2kg。动物的最小和最大体重在该组平均体重的±20％范围内。

适应期：

动物适应7天。动物在Pharmaseed处停留直到研究开始，再额外停留20天直到它们达到所需的体重。

鉴别：

动物由饲养员通过染料耳号确定。这个数字也出现在笼卡上，在每个笼子的正面都可以看到。笼卡还包含研究编号和治疗组的相关细节。

动物管理

安置

根据美国国立卫生研究院(NIH)和实验动物护理评估和认证协会(AAALAC)的指导方针进行动物处理。兔子被单独关在装有电池的塑料笼子里。笼子尺寸为60(L)x60(W)x40(H)cm。笼子的底部托盘上装有穿孔塑料地板。提供楼梯和PVC转筒用于娱乐活动。

饮食

提供商业兔子饮食(Teklad Doe Rabbit Diet cat#：7078S)，动物可以自由获取食物以及根据Pharmaseed的SOP第214号“水系统”从市政供应和处理的酸化饮用水(pH值介于2.5和3.5之间)。

污染物

来自供应商(Envigo)的饲料带有分析证书。水根据上述处理。

环境条件

将动物圈养在标准实验室条件下，空调和过滤(HEPA F6/6)，新鲜空气供应充足(最少换气15次/小时)。动物被保存在气候受控的环境中。温度范围为18-24℃，相对湿度范围为30-70％，具有12小时光照和12小时黑暗循环(上午6点/下午6点)。

随机化

根据它们的体重将兔子分成五组。

实验设计和条件

减轻疼痛的方法

该程序在研究期间没有给动物造成疼痛并且在研究期间没有动物表现出严重的临床症状。因此，不需要镇痛剂。

人道终点

在该研究期间，在人道的基础上，没有来自任何治疗组的动物被安乐死。

实验时间

将第一个给药日作为是第1天，大多数动物的终止日是第6天。由于一只动物(#8168)观察到的反应体征，其在第8天进行了额外的检查，并仍然观察到轻微的发红。由于这是一只用对照产品治疗的动物，并且其他测试项目在第5天和第6天都没有表现出任何眼部反应，因此没有进行进一步检查，研究在第8天终止。

研究规划

根据表1和表2，在一个循环中进行研究。

测试项目的给药

在轻轻地将下眼睑拉离眼球后，将测试物质置于每只动物一只眼部的结膜囊中。然后将眼睑轻轻地保持在一起约一秒钟以防止材料损失。另一只保持未治疗的眼用作对照。根据表1，将每个测试和参考项目施用于每组三只动物。研究时间线根据表2。给药方案根据表3。

表1：组分配

表2：研究时间线

*-基线、首次给药后1小时、2小时、4小时、6小时

#-由于在一只动物(8168)中观察到反应体征，在第8天检查该动物，该反应体征已消除。

表3：给药方案*

*给药方案是放大的，但与预期的临床使用有关

测试和评估

发病率和死亡率观察

发病率和死亡率检查每天进行两次(周末每天一次)

体重

根据Pharmaseed的SOP第010号“称重实验动物”，在动物到达时和研究开始前记录体重。

临床观察

在最初的24小时内定期进行临床观察，在最初的4小时内特别注意，然后每天两次，总共三天。观察皮肤和毛皮、眼部和粘膜、呼吸系统、循环系统、自主神经和中枢神经系统、躯体运动活动和行为模式的变化，如震颤、抽搐、流涎、腹泻、嗜睡、睡眠和昏迷。特别注意眼部。观察结果记录在专门设计的表格中。

眼科检查

眼部反应的分级在测试项目给药之前进行(基线)，并在第一个测试项目给药之后约(1±0.1)h、(2±0.1)h、(4±0.1)h、(6±0.1)h、(24±0.2)h、(48±0.2)h、(72±2)h、(96±2)h和(120±2)h进行(根据表4，其符合ISO 10993 10:2010B.2.7节)。在第2天和第3天，在第一次给药之后约(1±0.1)h、(2±0.1)h、(4±0.1)h、(6±0.1)h进行额外的检查。

对一只动物需要延长观察到168小时，以确定病变的逆转。

表4：眼部刺激评分-Draize评分

根据ISO指南，如果测试组中超过一半的动物在观察的任何阶段表现出阳性结果(表4中给出的脚注等级)，则测试材料被认为是眼部刺激物。

研究终止

根据眼部损伤结果，在第一次测试项目施用120小时或168小时(动物#8168)后，研究结束。在研究终止时，根据Pharmaseed的SOP第043号“释放兔子和豚鼠进行康复”，将动物送去康复。

结果

发病率和死亡率观察

在研究期间，没有来自任何组的动物死亡或观察到有发病体征。

体重(BW)测量

所有动物在研究开始时都在体重所需范围内。收到动物和研究开始时的体重列于表5。

表5：动物体重(kg)

临床体征

在研究期间，未在任何动物中观察到异常临床症状。表6中呈现了个体临床体征观察结果。

表6：个体临床体征观察

NAD——未检测到异常

使用Draize测试进行眼部检查

仅观察到可能与测试项目或对照产品相关的眼部反应或异常的轻微体征。轻微的结膜发红是观察到的眼部反应的唯一体征。在本研究中观察到的结膜发红的最大数值分级为“1”。根据ISO指南，结膜发红的数字分级“0”或“1”不被视为阳性等级。没有动物表现出指示不利影响的阳性结果，因此本研究中施用的任何测试项目均不应被视为对眼部有刺激性。

在第6天，在第3组(Lipitear)的第8168号动物中观察到这种轻微发红。在第8天进行额外检查，仍然观察到轻微发红。由于Lipitear是对照产品，并且其他测试项目在第5天和第6天均未显示任何眼部反应，因此未进行进一步检查并在第8天终止研究。

讨论和结论

在研究期间，没有来自任何组的动物死亡或观察到有发病体征。在研究期间，在任何动物中均未观察到异常临床体征。没有观察到可能与测试项目或对照组相关的眼部刺激或异常的长期体征。没有一只动物在眼科检查中表现出不良反应，所有观察到的轻微瞬时反应和异常都被认为与给药有关，在研究组和对照组中都观察到，在这种程序中被认为是可以接受的。

基于上述发现并在本研究的条件下，得出的结论是，与商购对照产品治疗相比，包括将测试项目重复施用到兔眼的三天方案具有良好的耐受性，并且不会引起任何显著的不良临床影响。本研究中使用的任何测试项目均不应被视为对眼部有刺激性。

对上述本发明的实施例的变化、修改和变更对于本领域技术人员来说将是显而易见的。所有这些变化、修改、变更等旨在落入本发明的精神和范围内，仅由所附权利要求限定。

虽然已经描述了本发明的若干实施方式，但是应当理解，这些实施方式仅是说明性的，而不是限制性的，并且许多修改对于本领域普通技术人员来说是显而易见的。例如，此处讨论的所有尺寸仅作为示例提供，并且旨在说明而非限制。

在本说明书中阳性标识的任何特征或元素也可特别地从如权利要求中限定的本发明的实施方式的特征或元素中排除。

本文描述的发明可以在不存在本文未具体公开的任何要素、限制或限制的情况下实施。因此，例如，在本文的每个实例中，术语“包括”、“基本上由……组成”和“由……组成”中的任何一个都可以被其他两个术语中的任一个替换。已使用的术语和表达被用作描述而非限制，并且在使用此类术语和表达时无意排除所示和描述的特征或其部分的任何等效物，但应认识到在本公开的范围内可以进行各种修改。

LIPITEAR^TM吸收测试总结

选择示例性纳米乳液即Lipimix纳米乳液(LIPITEAR^TM)来评估活性成分至眼表面的递送机制。但是，此实施例中显示的结果不仅限于使用LIPITEAR^TM。

包含维生素D的磷脂纳米乳液产生令人惊讶的过滤各种波长的电磁辐射的物理能力。发现维生素D磷脂纳米乳液一旦涂在眼部上即可过滤蓝光和紫外线辐射。这种特性不仅在质量上而且在数量上都令人惊讶，因为眼部表面的维生素D纳米乳液的厚度与泪膜的厚度相对应，而维生素D纳米乳液过滤电磁辐射的能力非常显著。

紫外线辐射和眼部

角膜与皮肤一样，高度暴露于紫外线辐射(UVR)。流行病学数据表明，UVR是多种角膜疾病的促成因素，包括翼状胬肉、光性角膜炎、气候性液滴角膜病变和眼表鳞状瘤(OSSN)。UVR是一种众所周知的基因毒性剂，其作用已在皮肤等器官中得到充分表征。确定了UVR对角膜的几种影响，例如通过测序确定的UVR特征C→T和CC→TT颠换，以及响应UVR暴露而增加的增殖和脱落率。角膜的单次低剂量UVR暴露足以引起遗传、分子和细胞变化，支持了对角膜采取保护措施的考量。

本文所述的维生素D纳米乳液可过滤UVR和蓝光，达到可对眼部提供保护作用的程度。

评估了包含不同浓度维生素D(维生素-D)的组合物对眼部的活性。下面描述了对包含配制成LIPITEAR^TM的包含维生素D的组合物进行的吸光度测试。该组合物旨在用作滴眼剂并且在目标制剂中包含在每100ml纳米乳液中的100mg维生素D或包含纳米乳液的4％的脂质部分。评估了维生素D浓度与吸光度的关系并总结如下。另见图7-13。考虑到组合物在施用于眼部时被泪液稀释，还评估了水性稀释的效果(参见下表8和图10)。

实验

Denovix DS-11 FX分光光度计单元用于所有测试。在单次阶段中一个接一个地评估所有制剂。捕获了220-520nm的波长范围，具体覆盖了蓝光范围(400-495nm)和UV尾部(<400nm)。

测试了两组制剂：

1.制备了一组6份纳米乳液，从LIPITEAR^TM和维生素D纳米乳液的两种源制剂开始，并将后者在纳米乳液中连续稀释5倍，如下所示：

表7：测量的一组制剂。

2.以1:4的比例稀释的一组类似制剂，名为维生素D纳米乳液0.2、维生素D纳米乳液0.2A等。

表8：测量的一组制剂。

该制剂仅通过稀释单一的维生素D纳米乳液制剂制成。

表9：本文描述的药物组合物的实施方式。

结果

图10和11显示了2个制剂组的吸光度特性。

图10示出了在220-520nm范围内测试的组合物中维生素D的惊人特性。维生素D纳米乳液(如表7所示包含维生素D的组合物)的优越吸收特性在超过230nm的波长下得到了很好的证明。

图11示出了维生素D纳米乳液(如表8所示的包含维生素D的组合物)在220-520nm范围内的惊人特性，当用水稀释五倍时，该特性得以保留和增强。选择五倍稀释来模拟当如本文所述的组合物施用于眼部并被眼部表面的泪液稀释时的预期稀释。

例如，238nm处的吸收光谱根据维生素D浓度而稳定，并且吸收线一直保持它们的相对排列直至测量范围的末端，线的交叉最小或没有交叉。参见图9。可以看到水稀释制剂组在整个光谱范围内的最佳对齐图像。参见图11。

如图9所示，维生素D组合物的吸收特性可分为3个功效组，从238nm开始，维生素D纳米乳液优于所有的组，吸收相当组(Lipimix和纳米乳液A、B&C)和低吸收组(纳米乳液D&E)。

如图10所示，维生素D组合物在稀释五倍(表8浓度)时的吸收特性大体与表7的维生素D组合物的吸收特性一致。更特别地，维生素D纳米乳液0.2优于所有，其次是维生素D纳米乳液0.2B、Lipimix、维生素D纳米乳液0.2A、维生素D纳米乳液0.2C、维生素D纳米乳液0.2E和维生素D纳米乳液0.2D。维生素D纳米乳液0.2D和维生素D纳米乳液0.2E的吸光度可以忽略不计。

作为参考，与Lipimix和维生素D纳米乳液相比，维生素D在蒸馏水溶液中的单独吸收光谱被记录并呈现在图11中。图11示出了Lipimix、维生素D水溶液和维生素D纳米乳液的吸收光谱的比较，证明了维生素D纳米乳液在230-520nm光谱范围内出乎意料的优异吸收特性。

吸收测试揭示了维生素D在纳米乳液中令人惊讶的协同效应，其跨越220-540nm的宽光谱范围并且在240nm及以上的波长处尤其显著。该光谱范围涵盖了很宽的紫外线范围和整个蓝光光谱范围。

如图11所示，与维生素D纳米乳液的吸收特性相比，维生素D在水溶液中近乎可忽略的吸光度(整体，更特别是300纳米以上)与之产生了鲜明区别。图11还揭示了与Lipimix相比，维生素D纳米乳液具有明显更高的吸收率。维生素D纳米乳液在测量光谱的240nm以上波长保持优势。

将维生素D添加至Lipimix纳米乳液的效果通过连续组的维生素D纳米乳液表征，其通过每次将每种维生素D纳米乳液稀释一半来制备(参见表7)。如图10所示，在12.5-100mg维生素D/ml Lipimix的宽范围内观察到维生素D对吸光度的影响。维生素D依赖性吸收效应在100mg/ml的维生素D浓度下特别明显，这在几乎整个光谱范围(240-520nm)中都很明显。此外，即使将制剂通过加水稀释至80％水的稀释溶液也可观察到这些结果。

本文呈现的结果证明了将维生素D添加到Lipimix制剂中的意外效果。向纳米乳液中添加>10mg/ml的维生素D(例如，12.5mg/ml)不仅不会使吸收光谱降低，而且在维生素D浓度(>50mg/ml)下令人惊讶地以协同方式增强了对UV至蓝光的阻挡效应。

动物模型和实验程序

角膜上皮和结膜上皮损伤的动物模型

在检查急性和慢性暴露的研究中已经表明蓝光对视网膜的损害。发现视网膜对较短波长的光最敏感(最大灵敏度显示在441nm)。蓝光引起的视网膜光化学损伤已在体外和体内得到证实。人类视网膜细胞的体外研究已经确定了导致氧化损伤的细胞信号通路，氧化损伤会增加视网膜光损伤的风险，并有助于与年龄相关的黄斑病变的发展。即使在显示设备(例如计算机显示器和电视屏幕)中使用的低强度下，蓝光也可以诱导视网膜细胞中活性氧(ROS)的产生和细胞凋亡。这种损伤可由商用发光二极管(LED)引起。有趣的是，白光的蓝色成分也已被证明会导致视网膜色素上皮细胞的血视网膜屏障功能障碍。

用于角膜结膜炎的兔模型(新西兰白兔)是本领域已知的并且例如由Gilbard等(1987,J.Inv.Ophthal.Vis.Sci.,28:225-228)描述。对Gilbard等(1987，如上)的模型稍作修改方案在美国专利号(USPN)7,723,287中描述；其全部内容以引用方式并入本文。简而言之，可以使用手术显微镜(Inami，日本)对麻醉的兔子进行手术，该手术显微镜要求切除眼部上方的皱襞、闭塞泪管以及剥除睑结膜和球结膜。这种手术可以在20只平均年龄为3个月且任意性别的兔子的一只眼上进行。手术和所有后续治疗均按照研究中动物护理的ARVO规则进行。泪膜渗透压在术后第1天升高。角膜上皮糖原水平逐渐下降，结膜杯状细胞密度降低。这些病理导致在术后第五天覆盖整个角膜表面的角膜上皮损伤。在一个实施方式中，受损眼部的治疗可在术后第五天开始。

兔角膜的评价

荧光素染色的角膜中的病变可以通过生物显微镜使用带有钴滤光片的裂隙灯(Haag Streit，瑞士)进行临床评价。荧光素染色的照片可以用安装在裂隙灯上的相机(Topcon，日本)拍摄。在每次实验结束时，杀死兔子，切除它们的角膜，固定在多聚甲醛中，并检查上皮病变。

组织学检查

在治疗结束时，通过静脉注射致死剂量的戊巴比妥杀死兔子。他们的眼部被摘除，角膜固定在4％多聚甲醛中。角膜被包埋在石蜡块中，切片，并用苏木精-伊红染色，用于光学显微镜检查。