阅读说明：本技术 一种微孔载体检测抑制物的测定方法 (Determination method for detecting inhibitor by microporous carrier ) 是由 张君成 王忠文 张正淳 于 2020-07-07 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种微孔载体检测抑制物的测定方法,在微孔板的微孔内注入40μl的琼脂培养基制成微孔载体,在微孔载体上载入药物样品以及病原菌孢子,检测药物对孢子萌发的抑制作用,测定方法的步骤如下：1)用微孔板制备合格的微孔载体；2)将待测样品载入微孔载体；3)将病原菌孢子载入微孔载体；4)孢子萌发培养；5)结果观测。本发明的优点：1)一块常规微孔板可以制备96个微孔载体,可以实现测试体系微型化；2)一个测试单元只消耗样品液10μl,实现检测样本微量化。(The invention discloses a method for measuring a micropore carrier detection inhibitor, which comprises the following steps of injecting 40 mul of agar culture medium into micropores of a micropore plate to prepare a micropore carrier, loading a medicine sample and pathogenic bacteria spores on the micropore carrier, and detecting the inhibition effect of the medicine on spore germination: 1) preparing a qualified microporous carrier by using a microporous plate; 2) loading a sample to be detected into a microporous carrier; 3) loading pathogenic spores into a microporous carrier; 4) spore germination and culture; 5) and (5) observing the result. The invention has the advantages that: 1) 96 micropore carriers can be prepared by one conventional micropore plate, and the miniaturization of a test system can be realized; 2) one test unit only consumes 10 mul of sample liquid, and the micro-quantification of the detection sample is realized.)

一种微孔载体检测抑制物的测定方法

技术领域

本发明涉及植物病理学技术，具体是一种微孔载体检测抑制物的测定方法。

技术背景

当前及今后相当长时期内，农药防治仍是植物病害防治的主要手段。探索和挖掘生物源农药是农药防治的重要方向，而生物源农药的早期探索挖掘往往要从自然界中采集或收集对植物病原菌具有抑制作用的物质，或者从生物体或生物产品中分离具有抑制作用的活性成分。显然，高效可行的抑制物识别检测手段将有利于提高生物源农药探索挖掘的成效和效率。当前识别抑制物对病原菌作用的常用方法包括利用琼脂培养基平板的测定方法，该测定方法的主要技术思想是，利用普通平皿制备含药培养平板，再接种入病原菌，然后培养观察药物对病原菌的抑制作用。该测定技术方案要求待测样本的样品量比较大，样品量过少时往往无法检测，容易错过或遗漏含量少的抑制活性物。

本发明的目的是提供一种利用微孔载体技术检测有关物质对孢子萌发的抑制作用的测定方法。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：

一种微孔载体检测抑制物的测定方法，主要技术是在微孔板的微孔内注入40μl的琼脂培养基制成微孔载体，在微孔载体上载入药物样品以及病原菌孢子，检测药物对孢子萌发的抑制作用，测定方法的步骤如下：

1.用微孔板制备合格的微孔载体

1)微孔板的卡稳：准备一个能将微孔板卡稳及平置的、表面洁净的卡稳工具，转入无菌工作台，将洁净的微孔板卡于卡稳工具上。

2)琼脂培养基的熔化：取病原菌孢子萌发适用的用三角瓶盛装的琼脂培养基加热熔化。

3)培养基的80℃处置：预先将普通水浴锅加热恒温到80℃，将操作2)熔化的培养基放入该水浴锅中，平衡至80℃。

4)移液枪无泡移液的处置：把操作3)平衡至80℃的培养基转入无菌工作台，把移液枪取液量调到40μl，将枪头伸入80℃的培养基中反复吸排培养基，直至排液操作不出现气泡现象。

5)微孔载体的制备：操作4)无气泡现象后，过量按下移液枪吸取培养基，提起枪头并靠贴在三角瓶瓶口壁上脱除枪头外部粘附的培养基，再转移到微孔板的微孔内，注入40μl培养基到微孔底部，并将枪头留在培养基液内作环转移动，引导培养基均匀分布于微孔底面，冷却后形成一个琼脂培养基的微小平板，作为测试工作用的微孔载体。在注完一个微孔后，母指按住移液枪，返回移到80℃三角瓶培养基中，同样的吸液操作注制下一个微孔载体，连续操作直到注制的微孔载体数量达到测试需要的数量。

6)合格微孔载体的标识：将操作5)注制完毕的微孔板从卡稳工具中取出，在微孔板下方放置一个直线工具，反转微孔板，把板的底面朝向操作者，透过注制成的微孔载体观察直线，观察到直线弯曲或弯折的微孔载体是有气泡、或者没有平展的琼脂块，属于不合格的微孔载体，用记号笔在该微孔底部标注，未标注的微孔载体是合格微孔载体。

2.将待测样品载入微孔载体

将已配备的待检测的药物样品液及测试对照处理样品液，转至无菌工作台，用移液枪吸取样品液10μl，在枪头不触及微孔载体面的情况下点放于步骤1制备的合格微孔载体表面的中部，让其自动在微孔载体面上扩展分散，静置在无菌工作台让药物样品液干化，成为载药微孔载体。

3.将孢子载入微孔载体

无菌条件下，将已备好的病原菌孢子液充分悬浮均匀，用移液枪吸取孢子液1μl，在枪头不触及微孔载体面的情况下点放于步骤2配成的载药微孔载体的中部，让孢子液自然分散。

4.孢子萌发培养

将步骤3操作完毕后的微孔板平置于洁净的保湿器具内，转移到培养箱中恒温培养，直至空白对照处理的孢子充分萌发。

5.结果观测

从培养箱中取出步骤4的培养材料，打开保湿器具的盖子，将载着微孔载体的微孔板倒置放于显微镜的载物台上，将物镜镜头对正微孔底面，调整镜头焦点对到微孔载体面的孢子，观察和记录各个微孔载体上孢子的萌发情况；根据对照处理的数据，计算所测定药物对孢子萌发的抑制作用。

本发明的优点：

1)测试体系微型化：常规平板测定技术的基本测试单元是一套平皿，通常设置3个以上重复，则一个样品需要3套以上平皿，占用较多的培养器具、耗材及培养空间；本发明技术的基本测试单元是一个微孔载体，一块常规微孔板可以制备96个微孔载体，可以实现测试体系微型化。

2)检测样本微量化：常规平板测定技术的一个测试单元往往需要消耗样品液10000μl以上，而本发明技术的一个测试单元只消耗样品液10μl，用量微少。

具体实施方案

下面结合实施例对本发明作进一步描述。

本发明是利用常规微孔板的微孔制备出体积为40μl的琼脂培养基微小平板，并在该微小平板上承载药物样品及病原菌孢子进行抑制作用测试，因而把该微小平板称为“微孔载体”。

测试使用的微孔载体必需要体积大小一致，且体积越小越好，在微孔底面上分布均匀、表面平整、内部无气泡。发明人最初的试制实践发现，要制备合格的微孔载体，还有技术问题需要解决，如一个微孔应加注多少培养基？加注的培养基应取多高的温度？怎样检查微孔载体是否合格？发明人试用移液枪移转技术进行制备，也存在一些技术障碍：①常规的移液操作，移转热熔状态的琼脂培养基时，容易在微孔载体上形成气泡；②枪头排出的培养基容易粘附在微孔的一侧，不平展；③在温度偏低时，吸取在枪头中的琼脂培养基容易凝固而排不出来，或者排出来后，很快凝固而来不及充分扩展；④在温度偏高时操作，更容易在排出的琼脂培养基中形成气泡；⑤是吸取操作时，枪头外壁粘附着较多的培养基液，并跟着枪头转移及释放，影响移液量的准确性。怎样解决这些技术问题，至今未见公开有相关技术方案，因而制备合格的微孔载体成了本发明的技术关键。

经反复摸索，发现采用如下技术方法能解决上述技术问题：用移液枪吸取80℃的琼脂培养基40μl，注入微孔底部，并直接用枪头引导培养基平展；用直线观察对比方法核查微孔载体是否合格。具体操作方法如下：

准备一个能卡稳微孔板的工具，目的是在制备过程中防止和限制微孔板移动，因为当用移液枪的枪头引导注入微孔底部的培养基平展时，整个微孔板会跟着移动。在无菌工作台面上，把微孔板平稳地放于卡稳工具内备下一步操作；将三角瓶装盛的琼脂培养基加热熔化并转到预先准备的80℃水浴锅，将培养基平衡至80℃。再将80℃的培养基转入无菌工作台，取出适当的移液枪并将移液量调到40μl，将枪头伸入80℃的培养基中，轻轻反复吸取/排放操作，并观察培养基液面的气泡冒出情况，反复吸/排操作直至不出现气泡现象，通常吸/排20次左右能达到平衡，此时，过量按下吸液量，轻轻移起枪头，靠贴在三角瓶瓶口壁上并稍作停留约1秒种，脱除枪头外部粘附的培养基，再转移到已卡稳的微孔板的微孔内，轻轻按枪排出40μl培养基注入微孔底部，注入的培养基通常堆在底部的一侧，此时母指保持移液枪按下状态，并将枪头留在培养基液内，先沿着微孔底面周边环线作环转动作，并逐步向心环转，引导培养基均匀分布于微孔底面，通常环转3-5圈能达到目的。培养基冷却后能形成一个表面平整、内部无气泡微小琼脂块，成为适合测试使用的合格微孔载体。在注制完一个微孔载体后，母指按住移液枪，返回到80℃的三角瓶培养基中，吸取和移液操作注制下一个微孔载体，连贯操作直到注制的微孔载体数量达到测试需要的数量，注意中途不能长时间停止操作，否则培养基在枪头凝固，一旦出现凝固，需要更换枪头，重新进行前面所述的排除气泡操作，再接着吸液注制下一个微孔载体。注制完毕后，把微孔板从卡稳工具中取出作下一步的质量检查操作。

由于微孔板和琼脂培养基都透明，微孔载体较薄且深处于微孔底部，直接从微孔开口很难观察判断微孔载体是否合格。不断探索观察中发现，正常直线透过有气泡的、或不平整的微孔载体进入观察者眼睛时，直线出现弯曲或弯折现象，一下子找到了微孔载体的合格性检验的便捷方法，具体操作方法是，将注制完毕的微孔板反转，微孔板底面朝向操作者并与操作者视线方向垂直，在微孔板正面一方放置一个直线工具(如直尺边线/或在白纸上用笔画一直线)，操作者透过已经注制成的微孔载体观察直线，观察到直线弯曲或弯折的微孔载体，是有气泡的琼脂块、或者没有均匀平展的琼脂块，属于不合格的微孔载体，用记号笔在该微孔底部标注，检查完毕，未标注的微孔上的载体，是合格的微孔载体。

准备好合格微孔载体后，就可以将药物载入微孔载体，具体方法是，将准备好的待检测药物样品及测试对照处理样品置入工作台，用移液枪吸取样品液10μl，轻轻点放于微孔载体表面中部，注意避免枪头碰触微孔载体面，实际操作技巧是，在枪头靠近微孔载体面时，轻轻按下移液枪，样品液排出成小滴悬挂在枪头上，轻轻将枪头的样品悬滴再靠近微孔载体面，触及微孔载体面时，样品悬滴自动落下并在微孔载体面上扩展，然后让微孔载体在工作台上静置一段时间(约1小时)，使药物样品液干化，成为载药微孔载体。

接着就可以在载药微孔载体上载入病原菌的孢子。具体方法是，取备好的病原菌孢子液，振荡孢子充分悬浮均匀，在无菌工作台上用移液枪吸取1μl孢子液，如同前面移液点放药物样品液一样，轻轻点放于载药微孔载体的中部，让孢子液自然分散。由于孢子液量少，分散范围通常不超过药物样品的分散范围。实际工作发现，每个微孔载体面分散100个孢子左右有利于后面的结果观察，这样预先配备孢子液的孢子浓度应调到1×10⁶个/ml。

上面步骤操作完毕后，将微孔板平稳放置于预先准备的保湿器具内，保持器具平稳状态，转移到培养箱中恒温培养，促使孢子萌发。由于不同病原菌孢子的萌发特性不同，因此不同病原菌的培养时间长短有差别，原则上是培养直至空白对照处理的孢子充分萌发。然后进行结果观测，将微孔板置于显微镜下，镜头对正微孔底面，调整载物台或镜头，使镜头焦点对到微孔载体面的孢子，观察和记录各个微孔载体上孢子的萌发情况；根据对照处理的数据，计算所测定药物对孢子萌发的抑制作用。

实施例1

应用本发明一种微孔载体检测抑制物的测定方法，测定药物25％苯甲咪鲜胺对香蕉枯萎病菌菌株Fo-4孢子萌发的抑制作用，按如下步骤实施操作：

1.用微孔板制备合格的微孔载体

1)微孔板的卡稳：准备一个能将微孔板卡稳及平置的、表面洁净的卡稳工具，转入无菌工作台，将洁净的微孔板卡于卡稳工具上。

2)琼脂培养基的熔化：取用三角瓶盛装的适合香蕉枯萎病菌孢子萌发的马铃薯琼脂培养基加热熔化。

3)培养基的80℃处置：预先将普通水浴锅加热恒温到80℃，将操作2)熔化的培养基放入该水浴锅中，平衡至80℃。

4)移液枪无泡移液的处置：把操作3)平衡至80℃的培养基转入无菌工作台，把移液枪取液量调到40μl，将枪头伸入80℃的培养基中反复吸排培养基，直至排液操作不出现气泡现象。

5)微孔载体的制备：操作4)无气泡现象后，过量按下移液枪吸取培养基，提起枪头并靠贴在三角瓶瓶口壁上脱除枪头外部粘附的培养基，再转移到微孔板的微孔内，注入40μl培养基到微孔底部，并将枪头留在培养基液内作环转移动，引导培养基均匀分布于微孔底面，冷却后形成一个琼脂培养基的微小平板，该微小平板内无气泡，表面平整，作为测试工作用的微孔载体。在注完一个微孔后，母指按住移液枪，返回移到80℃三角瓶培养基中，同样的吸液操作注制下一个微孔载体，连续操作直到注制的微孔载体数量达到测试需要的数量。

6)合格微孔载体的标识：将操作5)注制完毕的微孔板从卡稳工具中取出，在微孔板下方放置一个直线工具，反转微孔板，把板的底面朝向操作者，透过注制成的微孔载体观察直线，用记号笔将观察到直线弯曲或弯折的微孔载体标注出来，未标注的微孔载体是合格微孔载体。

2.将待测样品载入微孔载体

用无菌水将25％苯甲咪鲜胺稀释1000倍作为待检测的药物样品，以无菌水作对照处理样品。无菌条件下，用移液枪吸取样品液10μl点放于步骤1制备的合格微孔载体面的中部，让其自动在微孔载体面上扩展分散，待测样品和对照样品各重复点样3个微孔载体，工作台上静置1小时，成为载药微孔载体。

3.将孢子载入微孔载体

无菌条件下，将已备好的、浓度为10⁶个孢子/ml的香蕉枯萎病菌菌株Fo-4孢子液充分悬浮均匀，用移液枪吸取孢子液1μl点放于步骤2配成的载药微孔载体的中部，让孢子液自然分散。

4.孢子萌发培养

将步骤3操作完毕后的微孔板平置于洁净的保湿器具内，转移到培养箱中，28℃恒温培养18小时。

5.结果观测

从培养箱中取出步骤4的培养材料，打开保湿器具的盖子，将载着微孔载体的微孔板倒置放于显微镜的载物台上，观察各个微孔载体上的孢子萌发情况。

结果无菌水空白对照处理的孢子萌发的芽管长度为417μm；而苯甲咪鲜胺处理的孢子萌发的芽管长度为14μm；测试的苯甲咪鲜胺样品对香蕉枯萎病菌孢子萌发的抑制效果为96.64％。

实施例2

应用本发明一种微孔载体检测抑制物的测定方法，测定药物25％丙环唑对稻曲病菌菌株Uv-111孢子萌发的抑制作用，按实施例1的步骤1至步骤5操作实施，不同的是，步骤2载入的药物样品是25％丙环唑的500倍稀释液，步骤3载入的孢子是浓度为10⁶个孢子/ml的稻曲病菌菌株Uv-111孢子液，步骤4的培养时间是48小时。

结果无菌水空白对照处理的孢子萌发率为95.40％；而丙环唑处理的萌发率为0；测试的丙环唑样品对稻曲病菌孢子的抑制效果为100％。