阅读说明：本技术 一种微平板检测抑制物的测定方法 (Method for determining micro-plate detection inhibitor ) 是由 张君成 王忠文 张正淳 于 2020-07-07 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种微平板检测抑制物的测定方法,采用自制刀具切制琼脂培养基微平板,在微平板上载入药物样品以及病原菌孢子,检测药物对孢子萌发的抑制作用,测定方法的步骤如下：1)制备合格的微平板；2)准备工作态微平板；3)载入待测样品；4)载入病原菌孢子；5)培养；6)结果观测。本发明的优点：1)可在一片载玻片上测试多个样品,实现测试体系微型化；2)一个测试单元只消耗样品液5μl,实现检测样本微量化。(The invention discloses a method for determining a micro-plate detection inhibitor, which adopts a self-made cutter to cut an agar culture medium micro-plate, a medicament sample and pathogenic bacteria spores are loaded on the micro-plate, and the inhibition effect of the medicament on the spore germination is detected, and the determination method comprises the following steps: 1) preparing a qualified microplate; 2) preparing a working-state micro-flat plate; 3) loading a sample to be tested; 4) loading pathogenic bacteria spores; 5) culturing; 6) and (5) observing the result. The invention has the advantages that: 1) a plurality of samples can be tested on one glass slide, so that the test system is miniaturized; 2) one test unit only consumes 5 mul of sample liquid, and the micro-quantification of the detection sample is realized.)

一种微平板检测抑制物的测定方法

技术领域

本发明涉及植物病理学技术，具体是一种微平板检测抑制物的测定方法。

技术背景

当前及今后相当长时期内，农药防治仍是植物病害防治的主要手段。探索和挖掘生物源农药是农药防治的重要方向，而生物源农药的早期探索挖掘往往要从自然界中采集或收集对植物病原菌具有抑制作用的物质，或者从生物体或生物产品中分离具有抑制作用的活性成分。显然，高效可行的抑制物识别检测手段将有利于提高生物源农药探索挖掘的成效和效率。当前识别抑制物对病原菌作用的常用方法包括利用琼脂培养基平板的测定方法，该测定方法的主要技术思想是，利用普通平皿制备含药培养平板，再接种入病原菌，然后培养观察药物对病原菌的抑制作用。该测定技术方案往往要求待测样本的样品量比较大，样品量过少时往往无法检测，容易错过或遗漏含量少的抑制活性物。

本发明的目的是提供一种利用微平板技术检测有关物质对孢子萌发的抑制作用的测定方法。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：

一种微平板检测抑制物的测定方法，主要技术是，在无菌条件下，用自制刀具切制琼脂培养基微平板，在微平板上载入药物样品以及病原菌孢子，检测药物对孢子萌发的抑制作用，测定方法的步骤如下：

1.切制合格的微平板

1)制备切割刀具：用等厚度材料将锋利的23号手术刀片间隔排列，形成刀锋间隔为4mm的等距离刀片组，作为切制微平板的切割刀具。

2)倒制培养基平板：取病原菌孢子萌发适用的琼脂培养基加热熔化，无菌条件下倒入平皿制成培养基平板。

3)绘画切割用的对准线图纸：在洁净的一张白纸上绘画出两组相互垂直交叉的直线图，备作切割微平板的对准线图纸。

4)切制微平板：无菌条件下，将操作3)绘画的对准线图纸垫在操作2)倒制成的平板平皿下面，打开皿盖，取一把灭菌的直尺架于平皿边缘，直尺边线与对准线图的一组直线对齐；在酒精灯火上将切割刀具的刀锋灭菌，冷却后将刀锋靠近直尺边线轻轻***平皿琼脂平板，并沿着直尺边线拉动切割刀，切割琼脂平板；然后转动平皿底下的对准线图纸以及平皿90度，移动直尺与刚切割的直线方向垂直的另一组直线对齐，并同样切割琼脂培养基平板，切制成4×4mm²的正方形微平板，微平板的大小等同、整齐一致、切面平整，就是合格的微平板。

2.准备工作态微平板

用普通载玻片承载准备工作态微平板；预先准备无菌状态的、可以摆放载玻片的保湿器具。无菌条件下，打开保湿器具的盖子，将已灭菌的载玻片平放于保湿材料面上，用刀片将步骤1切制成的合格微平板挑起转移到该灭菌载玻片上，逐块分开摆放，成为测试用的工作态微平板；。

3.载入待测样品

将已配备的待检测的药物样品液及测试对照处理样品液，转至无菌工作台，用移液枪吸取样品液5μl，在枪头不触及微平板面的情况下点放于步骤2准备的工作态微平板面的中部，让其自动在微平板面上扩展分散，静置至观察不到药物样品液即成为载药微平板。

4.载入病原菌孢子

无菌条件下，将已备好的病原菌孢子液充分悬浮均匀，用移液枪吸取孢子液1μl，在枪头不触及微平板面的情况下点放于步骤3配成的载药微平板的中部，让孢子液自然分散。

5.培养

步骤4操作完毕后，盖上保湿器具的盖子，保持器具平稳状态，转移到培养箱中恒温培养，直至空白对照处理的孢子充分萌发。

6.结果观测

从培养箱中取出步骤5的培养材料，打开保湿器具的盖子，将载着微平板的载玻片置于显微镜下，观察和记录各个微平板上的孢子萌发情况。根据对照处理的数据，计算所测定药物对孢子萌发的抑制作用。

本发明的优点：

1)测试体系微型化

常规平板测定技术的基本测试单元是一套平皿，通常设置3以上重复，则一个样品需要3套以上平皿，占用较多的培养器具、耗材及培养空间；本发明技术的基本测试单元是一块微平板，可在一片载玻片上测试多个样品，可以实现测试体系微型化。

2)检测样本微量化

常规平板测定技术的一个测试单元往往需要消耗样品液10000μl以上，而本发明技术的一个测试单元只消耗样品液5μl，用量微少。

具体实施方案

下面结合实施例对本发明作进一步描述。

本发明通过自制刀具，切割琼脂培养基平板，制备出平板面积只有4×4mm²的微平板，在微平板上载入药物样品以及病原菌孢子，检测药物对孢子萌发的抑制作用。

本发明用的微平板的技术要求：1)微平板的大小等同一样，且体积越小越好。原因是药物样品液很容易渗透扩散到微平板内部而存在样品液的稀释效应。2)微平板表面平整无变形和损伤。原因是需要保证测试结果能在显微镜下正常观察。3)切割平板的切边和切面平整光滑。原因是样品液在粗糙不平的琼脂切割边缘和切割面上容易渗流扩展。

发明人最初的试制实践发现，要制备合格的微平板，还有技术问题需要解决，如怎样切制体积微小且体积等同的微平板？怎样保证微平板的切边和切面平整光滑？试行用刀片直接切割发现，切制的微平板无法达到体积等同的技术要求。试行用普通打孔器打孔发现，打孔器打孔属于挤压及压碎式切割，切割边缘及切割面粗糙不平，而且小口径打孔器打出的琼脂块容易卡在打孔器内。怎样解决这些技术问题，至今未见公开有相关技术方案，因而如何制备合格的微平板成了本发明的技术关键。

经反复摸索，发现采用如下技术方法能解决上述技术问题：自制一套等距离排列的锋利刀片作刀具，对琼脂平板作拉动式切割和垂直切割，能切出合格的微平板，具体操作方法如下：

准备规格为23号的普通手术刀片5片；取厚度为3.6mm的等厚胶板裁切出大小与刀片相近的4片小胶片，将这4片小胶片与这5片手术刀片相间排列，露出刀锋约1cm，用长尾夹将它们紧紧夹住，夹紧操作时需要保持5片刀锋尖头排列在一条直线上，形成一组刀锋间距为4mm的等距间隔刀片组，作为切割琼脂平板用的刀具。用75％酒精将刀具表面消毒后，存放于洁净的小容器内备用。

切割用的琼脂培养基平板的倒制按常规操作制备。在超净工作台无菌条件下，将加热熔化的琼脂培养基倒入较大的平底平皿(最好规格为12cm以上)，形成厚度约为1mm的培养基平板。

在切割微平板之前，先用打印机(或手工画)在洁净的白纸上绘画2组相互垂直交叉的直线图，备作切割微平板的对准直线图纸。将该图纸垫在倒制好的平皿平板下面，透过平皿平板能看清对准直线。取一把已灭菌的钢制小直尺架于已开盖的平皿边缘，直尺边线与对准线图纸上的一组直线对齐，取出已备好的切割刀具，在酒精灯火上把5片刀锋灭菌，稍冷却后，将刀锋靠近直尺边线轻轻***平皿琼脂平板，然后靠沿着直尺边线拉动和切割琼脂平板，切出一组4条等宽的琼脂条，重复同样操作可切多组琼脂条。由于刀锋锋利，切开两边的平整琼脂切面整齐平滑，能自然重合，因而在刀锋过后形成的切割痕迹不容易被看到，也就是不容易识别平皿平板上的、已切割操作的切割线痕迹及其方向。此时，勿相对移动平皿与其底下的对准线图纸，只是轻轻转动平皿底下的对准线图纸90度，并带动平皿及直尺转90度，再轻轻将直尺回转90度，对准与刚才切割方向垂直的另一组直线，再用刀具作同样的切割操作，就能准确地作出垂直切割操作，切制成多组16块(4块×4块)、大小等同的、每块大小为4×4mm²的正方形微平板，成为合格的微平板。

切制出的微平板需要转到载玻片上摆置成为测试使用的工作态微平板。预先准备无菌状态的、内部放置湿润的保湿材料(如吸水纸或纱布)的普通保湿器具(如培养皿或保鲜盒)。在超净工作台上打开保湿器具的盖子，将已灭菌的载玻片平放于保湿材料面上，然后打开已切成微平板的平皿盖，用刀片轻轻将微平板外的琼脂片挑开，露出整齐的4块×4块的微平板，再用刀片轻轻将微平板逐块挑起转移到灭菌载玻片上整齐摆放，彼此分开，可以每3块一列，一载玻片可以摆放7列以上，摆好之后就成为可以测试使用的工作态微平板。

准备好工作态微平板之后，就可以将药物载入微平板，具体方法是，将准备好的待检测药物样品及测试对照处理样品置入工作台，用移液枪吸取样品液5μl，轻轻点放于微平板面中部，注意避免枪头碰触微平板面，实际操作技巧是，在枪头靠近微平板面时，轻轻按下移液枪，样品液排出成小液滴悬挂在枪头上，将该小液滴再轻轻靠近微平板面，触及微平板面时，样品小液滴自动落下并在微平板面上扩展，然后让微平板在工作台上静置一段时间(约20分钟)，至观察不到液状样品为止。加样后的微平板成为载药微平板。

接着就可以在载药微平板上载入病原菌的孢子。具体方法是，取备好的病原菌孢子液，振荡孢子充分悬浮均匀，在超净工作台上用移液枪吸取1μl孢子液，如同点放药物样品液一样，轻轻点放于载药微平板的中部，让孢子液自然分散。由于孢子液量少，分散范围通常不超过药物样品的分散范围。实际工作发现，每个微平板面分散100～200个孢子左右有利于后面的结果观察，这样预先配备孢子液的孢子浓度应调到1×10⁶～2×10⁶个/ml。

上面步骤操作完毕后，盖上保湿器具的盖子，保持器具平稳状态，转移到培养箱中恒温培养。由于不同病原菌孢子的萌发特性不同，因此不同病原菌的培养时间长短有差别，原则上是培养直至空白对照处理的孢子充分萌发。然后进行结果观测，将载着微平板的载玻片置于显微镜下，观察记录各个微平板上的孢子萌发情况。根据对照处理的结果，计算所测定药物对孢子萌发的抑制作用。

实施例1

应用本发明一种微平板检测抑制物的测定方法，测定药物25％苯甲咪鲜胺对香蕉枯萎病菌菌株Fo-4孢子萌发的抑制作用，按如下步骤实施操作：

1.切制合格的微平板

1)制备切割刀具：用等厚度材料将锋利的23号手术刀片间隔排列，形成刀锋间隔为4mm的等距离刀片组，作为切制微平板的切割刀具。

2)倒制培养基平板：取适合香蕉枯萎病菌孢子萌发的马铃薯琼脂培养基加热熔化，无菌条件下倒入12cm平皿制成培养基平板。

3)绘画切割用的对准线图纸：在洁净的一张白纸上绘画出两组相互垂直交叉的直线图，备作切割微平板的对准线图纸。

4)切制微平板：无菌条件下，将操作3)绘画的对准线图纸垫在操作2)倒制好的平皿平板下面，打开皿盖，取一把灭菌的钢制直尺架于平皿边缘，直尺边线与对准线图的一组直线对齐；在酒精灯火上将切割刀具的刀锋灭菌，冷却后将刀锋靠近直尺边线轻轻***平皿琼脂平板，并沿着直尺边线拉动切割刀，切割琼脂平板；一个12cm的平板可以平行切割3次，然后转动平皿底下的对准线图纸90度，移动直尺与刚切割的直线方向垂直的另一组直线对齐，并同样切割操作，切制成微平板9组，每组有4块×4块＝16块，每块大小为4×4mm²的正方形微平板，所有微平板的大小等同、整齐一致、切面平整。

2.准备工作态微平板：

用普通载玻片承载准备工作态微平板；预先准备无菌状态的、可以摆放载玻片的保湿塑料盒。无菌条件下，打开保湿塑料盒的盖子，将已灭菌的载玻片平放于保湿材料面上，用刀片将步骤1切制成的合格微平板挑起转移到该灭菌载玻片上，逐块分开摆放，每3块微平板一列，摆2列，成为测试用的工作态微平板；。

3.载入待测样品

用无菌水将25％苯甲咪鲜胺稀释1000倍作为待检测的药物样品，以无菌水作对照处理样品。无菌条件下，用移液枪吸取样品液5μl，在枪头不触及微平板面的情况下点放于步骤2准备的工作态微平板面的中部，让其自动在微平板面上扩展分散，待测样品和对照样品各重复点样3块微平板(一列)，静置至观察不到药物样品液，即成为载药微平板。

4.载入病原菌孢子

无菌条件下，将已备好的、浓度为10⁶个孢子/ml的香蕉枯萎病菌菌株Fo-4孢子液充分悬浮均匀，用移液枪吸取孢子液1μl，在枪头不触及微平板面的情况下点放于步骤3配成的载药微平板的中部，让孢子液自然分散。

5.培养

步骤4操作完毕后，盖上保湿器具的盖子，保持器具平稳状态，转移到培养箱中，28℃恒温培养12小时。

6.结果观测

从培养箱中取出步骤5的培养材料，打开保湿器具的盖子，将载着微平板的载玻片置于显微镜下观察各个微平板上的孢子萌发情况。

结果无菌水空白对照处理的孢子萌发率为97.37％；而25％苯甲咪鲜胺处理的萌发率为3.33％；测试的苯甲咪鲜胺样品对香蕉枯萎病菌孢子萌发的抑制效果为96.58％。

实施例2

应用本发明一种微平板检测抑制物的测定方法，测定药物25％丙环唑对稻曲病菌菌株Uv-111孢子萌发的抑制作用，按实施例1的步骤1至步骤5操作实施，不同的是，步骤2载入的药物样品是25％丙环唑的500倍稀释液，步骤3载入的孢子是浓度为10⁶个孢子/ml的稻曲病菌菌株Uv-111孢子液，步骤4的培养时间是48小时。

结果无菌水空白对照处理的孢子萌发率为95.09％；而25％丙环唑处理的萌发率为0；测试的丙环唑样品对稻曲病菌孢子萌发的抑制效果为100％。