阅读说明：本技术 冰冻植物组织Hi-C建库的方法 (Method for building frozen plant tissue Hi-C library ) 是由 李彪 郭松 仉旭 沈世超 于 2020-08-14 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种冰冻植物组织Hi-C建库的方法。该方法包括以下步骤：S1,冰冻植物组织液氮研磨；S2,加入甲醛进行固定,加入甘氨酸进行终止固定；S3,过细胞筛网；S4,将固定化的细胞进行细胞裂解,然后进行限制性内切酶消化；S5,进行标记物标记,并平末端化；S6,重新连接；S7,解除固定化,进行DNA片段的提取,回收DNA片段；S8,去除带有标记物标记但未连接的DNA片段；S9,DNA打断；S10,钓取含有标记物标记的DNA片段；S11,末端修复加接头；S12,PCR扩增,获得Hi-C文库。应用本发明的建库的方法,利用冰冻植物组织进行Hi-C建库,可以达到与新鲜叶片Hi-C建库同等的有效数据率。(The invention discloses a method for establishing a bank of frozen plant tissues Hi-C. The method comprises the following steps: s1, grinding the frozen plant tissues by liquid nitrogen; s2, adding formaldehyde for fixation, and adding glycine for termination of fixation; s3, passing through a cell screen; s4, performing cell lysis on the immobilized cells, and then performing restriction enzyme digestion; s5, marking a marker, and flattening and terminating; s6, reconnection; s7, removing immobilization, extracting DNA fragments, and recovering the DNA fragments; s8, removing the DNA fragment which is marked by the marker and is not connected; s9, breaking DNA; s10, fishing out a DNA fragment containing the marker; s11, repairing the tail end and adding a joint; s12, PCR amplification, obtaining Hi-C library. By applying the method for establishing the banks, Hi-C bank establishment is carried out by using frozen plant tissues, and the effective data rate which is the same as that of Hi-C bank establishment of fresh leaves can be achieved.)

冰冻植物组织Hi-C建库的方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及一种冰冻植物组织Hi-C建库的方法。

背景技术

DNA是细胞遗传信息的载体，在生物体内以染色质的形式存在于每个细胞中，并控制着整个生命活动的进程。目前绝大多数对于DNA信息的研究是以研究DNA分子内碱基的序列(DNA的一维信息)来进行，通过分析碱基排列信息来探究生命活动的规律。

真实状态中的细胞核是一个狭小的三维立体空间，直链分子结构的DNA会以复杂的卷曲方式位于细胞核内，原一维DNA序列被赋予三维空间构象，并导致了大量复杂的基因调控作用方式。对此，简单的一维DNA序列信息由于不能提供真实DNA空间分布相关的信息，因此也无法解释由于空间构象导致的一系列基因调控现象。为解决这一问题，目前已有一系列的检测方法。如3c(染色体结构捕获)方法及衍生的4c、5c方法。这些方法均以测序为基本检测手段，利用细胞核内蛋白形成DNA结构固定因子，之后通过对DNA的片段重联等构建带有空间结构信息的DNA序列，最后使用测序技术来检测染色质DNA信息，并计算其在空间中分布和相互作用。尽管此类方法在一定程度上能够提供部分染色质相互作用信息。但由于其方法与技术限制，这一类的方法仅能检测定点或部分的DNA相互作用位点，无法探究全细胞核水平上的立体互作信息。因此不可避免地大量信息将会遗漏。在对于未知相互作用信息的发现上，这一点尤为重要。

近年来随着高通量测序技术的出现，大规模基因组信息的获得变得更加容易。Hi-C技术便是结合高通量测序的方法，对整个细胞核内染色质的信息进行检测的技术。Hi-C技术是染色体构象捕获(Chromosome conformation capture，简称为3C)的一种衍生技术，是指基于高通量进行染色体构象的捕获，它能够在全基因组范围内捕捉不同基因座位之间的空间交互，研究三维空间中调控基因的DNA元件。

比如Genome-wide analysis of local chromatin packing in Arabidopsisthaliana(2015)报道了一种拟南芥新鲜幼苗的Hi-C建库方法，该方法利用甲醛固定染色质结构，然后通过限制性内切酶打断原基因组序列，并进行生物素标记后，再重新连接形成带有结构信息的新DNA分子。在这一过程中，如果两个不同基因组位置的DNA分子片段连接形成一个杂合分子，这将被认为是这两个DNA分子在空间上相互临近的证据。然后对DNA进行纯化并打碎，再针对标记的生物素分子进行钓取，富集获得所需的空间上相互作用的DNA杂合分子。最后构建高通量测序的文库及双端测序检测，获得全染色质在空间上的相互作用信息。

但是，采用该文献报道的方法构建的冰冻植物叶片Hi-C，最终建库失败。另外，现有的新鲜植物叶片固定步骤，对于冰冻植物叶片不适用，固定效果差，样品易降解，最终导致建库失败。

发明内容

本发明旨在提供一种冰冻植物组织Hi-C建库的方法，以解决现有技术中冰冻植物叶片Hi-C建库失败的技术问题。

为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种冰冻植物组织Hi-C建库的方法。该方法包括以下步骤：S1，将冰冻植物组织进行液氮研磨；S2，研磨后的植物组织加入甲醛进行固定，然后加入甘氨酸进行终止固定，得到固定后产物；S3，将固定后产物过细胞筛网，离心获得固定化的细胞；S4，将固定化的细胞进行细胞裂解，然后进行限制性内切酶消化，得到被固定化的染色体片段；S5，对被固定化的染色质片段的末端进行标记物标记，并平末端化，得到平末端化的被固定化的染色质片段；S6，对平末端化的被固定化的染色质片段进行重新连接，得到重新连接的被固定化的染色质片段；S7，对重新连接的被固定化的染色质片段解除固定化，进行DNA片段的提取，回收DNA片段；S8，将S7中回收的DNA片段，去除带有标记物标记但未连接的DNA片段，获得纯化的DNA片段；S9，将S8得到的纯化的DNA片段，进行DNA打断；S10，利用能够与标记物亲和的磁珠钓取含有标记物标记的DNA片段；S11，S10中获得的标记物标记的DNA片段，进行末端修复加接头；S12，对S11获得的产物进行PCR扩增，获得Hi-C文库。

进一步地，S2中甲醛的体积浓度为5％～10％，固定的温度为室温，固定的时间为30～60min。

进一步地，S2中甘氨酸的浓度为1.5～3M；优选为2.5M。4.1的方法，S1中研磨后的植物组织加入磷酸盐缓冲液。

进一步地，标记物为生物素；能够与标记物亲和的磁珠为链霉亲和素化磁珠。

进一步地，S4中，采用0.1％-1％的SDS进行细胞裂解，温度为37℃，时间为10min；然后加入终浓度为1％-3％的Triton X-100，温度为37℃，时间为30min，中和SDS。

进一步地，S4中，限制性内切酶为DnpII。

进一步地，冰冻植物组织为冰冻植物叶片。

进一步地，S9中，打断后的片段大小为350～500bp。

进一步地，方法具体包括以下步骤：称取1～3g冰冻植物叶片，放入预冷的研钵中，进行液氮研磨；液氮研磨后的叶片，转入50ml的离心管中，加入30ml的磷酸盐缓冲液，然后加入终浓度为5％～10％的甲醛，室温固定60min；加入2.04mL 2.5M甘氨酸，室温5min，终止固定；固定后的产物，过细胞筛网，收集滤液，进行离心，获得固定化的细胞；固定化的细胞，加入终浓度为0.1％～1％的SDS进行细胞裂解，37℃10min；然后加入终浓度为1％～3％的Triton X-100，37℃30min，中和SDS，得到中和产物；在中和产物中，加入200U的DnpII进行酶切，酶切条件37℃过夜，获得被固定化的染色体片段；被固定化的染色质片段的末端进行生物素标记，并平末端化，得到平末端化的被固定化的染色质片段；生物素标记的是dATP，使用的末端修复酶是Klenow Fragment，反应温度为37℃，反应时间为45min；平末端化的被固定化的染色质片段进行重新连接，得到重新连接的被固定化的染色质片段；使用的连接酶为T4 DNA ligase，反应温度为20℃，反应时间为30min；加入蛋白酶K和SDS，消化蛋白质，解除固定化，反应条件65℃90min；蛋白质消化后，加入磁珠进行DNA片段的提取，回收DNA片段；

回收的DNA片段，去除带有生物素标记但未连接的DNA片段，获得纯化的DNA片段，使用的酶是T4 DNA polymerase，反应条件为12℃2h；

纯化的DNA，使用超声打断的物理方法进行打断，打断后的片段大小为350～500bp；

利用链霉亲和素化磁珠钓取含有生物素标记的DNA片段，反应条件为20℃20min；

获得的生物素标记的DNA片段，进行末端修复加接头；

进行PCR扩增，获得Hi-C文库。

应用本发明的建库的方法，利用冰冻植物组织进行Hi-C建库，可以达到与新鲜叶片Hi-C建库同等的有效数据率；本发明已经经过了实验验证，冰冻的玉米、小麦、拟南芥、黄瓜、棉花、油菜叶片均已建库成功，有效数据率＞25％，达到新鲜叶片Hi-C建库的水平。

具体实施方式

需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将结合实施例来详细说明本发明。

目前植物样品Hi-C建库的方法，必须使用新鲜的植物叶片进行建库，如果使用冰冻植物叶片进行建库，叶片不易固定，并且固定过程中容易降解，最终建库失败。但是在实际应用过程中，部分林木/药材/野生植物样本无法采用新鲜样本，而且有许多保存时间较久(1个月至半年)的冰冻植物样品建库的需求。为了解决该技术问题，本发明提供了下列技术方案。

根据本发明一种典型的实施方式，提供一种冰冻植物组织Hi-C建库的方法。该方法包括以下步骤：S1，将冰冻植物组织进行液氮研磨；S2，研磨后的植物组织加入甲醛进行固定，然后加入甘氨酸进行终止固定，得到固定后产物；S3，将固定后产物过细胞筛网，离心获得固定化的细胞；S4，将固定化的细胞进行细胞裂解，然后进行限制性内切酶消化，得到被固定化的染色体片段；S5，对被固定化的染色质片段的末端进行标记物标记，并平末端化，得到平末端化的被固定化的染色质片段；S6，对平末端化的被固定化的染色质片段进行重新连接，得到重新连接的被固定化的染色质片段；S7，对重新连接的被固定化的染色质片段解除固定化，进行DNA片段的提取，回收DNA片段；S8，将S7中回收的DNA片段，去除带有标记物标记但未连接的DNA片段，获得纯化的DNA片段；S9，将S8得到的纯化的DNA片段，进行DNA打断；S10，利用能够与标记物亲和的磁珠钓取含有标记物标记的DNA片段；S11，S10中获得的标记物标记的DNA片段，进行末端修复加接头；S12，对S11获得的产物进行PCR扩增，获得Hi-C文库。

应用本发明的建库的方法，利用冰冻植物组织进行Hi-C建库，可以达到与新鲜叶片Hi-C建库同等的有效数据率

优选的，S2中甲醛的体积浓度为5％～10％，固定的温度为室温，固定的时间为30～60min，此固定能够保持细胞核的完整性，避免样品降解减少后期建库的随机连接，降低噪音。优选的，S2中甘氨酸的浓度为1.5～3M，更有选为2.5M。

在本发明一种典型的实施方式中，S1中研磨后的植物组织加入磷酸盐缓冲液。

本发明中标记物是为了后续DNA的分离，例如标记物可以为生物素，能够与标记物亲和的磁珠为链霉亲和素化磁珠。优选的，细胞裂解中，采用0.1％-1％的SDS进行细胞裂解，温度为37℃，时间为10min；然后加入终浓度为1％-3％的Triton X-100，温度为37℃，时间为30min，中和SDS。在本发明中，限制性内切酶可以为HindIII、MboI、AatII、ClaI和DnpII等，优选为DnpII。

典型的，冰冻植物组织为冰冻植物叶片。S9中，打断后的片段大小为350～500bp，便于后续的测序和分析，提高测序的质量；因为片段太长，会降低测序的质量，片段太短会影响mapping率。

在本发明一优选的实施方式中，该方法具体包括以下步骤：

称取1～3g冰冻植物叶片，放入预冷的研钵中，进行液氮研磨；

液氮研磨后的叶片，转入50ml的离心管中，加入30ml的磷酸盐缓冲液，然后加入终浓度为5％～10％的甲醛，室温固定60min；

加入2.04mL 2.5M甘氨酸，室温5min，终止固定；

固定后的产物，过细胞筛网，收集滤液，进行离心，获得固定化的细胞；

固定化的细胞，加入终浓度为0.1％～1％的SDS进行细胞裂解，37℃10min；然后加入终浓度为1％～3％的Triton X-100，37℃30min，中和SDS，得到中和产物；

在中和产物中，加入200U的DnpII进行酶切，酶切条件37℃过夜，获得被固定化的染色体片段；

被固定化的染色质片段的末端进行生物素标记，并平末端化，得到平末端化的被固定化的染色质片段；生物素标记的是dATP，使用的末端修复酶是Klenow Fragment，反应温度为37℃，反应时间为45min；

平末端化的被固定化的染色质片段进行重新连接，得到重新连接的被固定化的染色质片段；使用的连接酶为T4 DNA ligase，反应温度为20℃，反应时间为30min；

加入蛋白酶K和SDS，消化蛋白质，解除固定化，反应条件65℃90min；蛋白质消化后，加入磁珠进行DNA片段的提取，回收DNA片段；

回收的DNA片段，去除带有生物素标记但未连接的DNA片段，获得纯化的DNA片段，使用的酶是T4 DNA polymerase，反应条件为12℃2h；

纯化的DNA，使用超声打断的物理方法进行打断，打断后的片段大小为350～500bp；

利用链霉亲和素化磁珠钓取含有生物素标记的DNA片段，反应条件为20℃20min；

获得的生物素标记的DNA片段，进行末端修复加接头；

进行PCR扩增，获得Hi-C文库。

下面将结合实施例进一步说明本发明的有益效果。

实施例1

试剂：

37％甲醛

2.5M甘氨酸

20×PBS：细胞缓冲液；

250mM蔗糖：起到保护核酸的作用；

1mM MgCl₂：维持离子强度；

5mM KCl：维持离子强度；

40％(v/v)甘油：维持一定渗透压；

0.25％(v/v)Triton X-100：表面活性剂(非离子型去垢剂)；

0.1mM PMSF(苯甲基磺酰氟)：蛋白酶抑制剂；

0.1％(v/v)β-巯基乙醇：破坏蛋白质三级或四级结构。

操作步骤：

1.按照表1配制细胞核分离缓冲液(Nuclei Isolation Buffer，NIBuffer)：

表1

配好后冰上放置。

2.称取1g冰冻的植物叶片组织，然后放入预冷的研钵中，加入适量液氮，研磨至粉状(研磨过程中，需要保持一直有液氮，尽量研磨充分)，装入50mL离心管中(装入之前，离心管中先加入少量液氮预冷)。

3.用30mL预冷的NIBuffer重悬组织，加入11.11mL 37％甲醛(终浓度为10％)，室温状态下在交联60min。

4.加入2.04mL 2.5M甘氨酸(终浓度0.118M)，混匀后在真空中放置5min，终止交联。

5.在冰上温和晃动15分钟。

6.先用70μm的细胞筛网过滤，收集滤液。(过滤过程中，如果杂质太多，可以使用2个细胞筛网。注：过滤过程中不要吹打。如果2个细胞筛网不够，可以将使用过的细胞筛网用超纯水冲洗后，重复使用，但不同的样品间不能混用)。

7.再用40μm的细胞筛网过滤，收集滤液。(过滤过程中，如果杂质太多，可以使用2个细胞筛网。注：过滤过程中不要吹打。如果2个细胞筛网不够，可以将使用过的细胞筛网用超纯水冲洗后，重复使用，但不同的样品间不能混用)

8.1800g，4℃离心15min，弃掉上清。

9.用10mL NIBuffer重悬沉淀，轻轻晃动混匀，尽量避免用枪吹打(晃动混不匀，可以用枪轻轻吹打)，1800g，4℃离心5min，弃掉上清，

10.重复步骤9，再洗一遍；(如果上清比较颜色比较深，可以再多洗一遍)

11.根据1g叶片细胞核沉淀的量，确定下步细胞核酶切建库的取样量(一般是0.05～0.25g，)，进行分装。

分装步骤：在上步沉淀中加入500μl的1×PBS，轻轻吹打混匀，测量体积，计算0.05g～0.25g的体积，进行分装。

分装之后保存在-80℃。

细胞核酶切

1.从-80℃取除分装的植物样品，用500ul 1×NEBuffer 2(B7002S，NEB)重悬沉淀，1800g，4℃离心5min，弃掉上清；重复洗一遍。

2.用400μl 1×NEBuffer2重悬沉淀，继续加适量1×NEBuffer 2至500μl，加入55.6μl 1％SDS(终浓度0.1％)，混匀后65℃金属浴中孵育10min(每隔2min轻轻颠倒混匀)。

3.结束后立刻放在冰上。(每管取出10μL作为酶切前DNA完整性的验证。电泳检测前需做如下处理：加入25μL1×NEBuffer 2和7.5μL蛋白酶K，65℃孵育30min，此步骤可以在第二天与酶切后及连接后的产物一起做。)

4.加入61.7μl 10％Triton X-100(终浓度1％)中和SDS，37℃金属浴孵育15min(每隔2min轻轻颠倒混匀)。

5.加入200U(酶活单位)DpnII(DpnII 4μl)，37℃酶切1h(金属浴中进行)。

生物素标记DNA末端，稀释和连接

1.取10μL作为酶切后的验证。电泳检测前需做如下处理：加入25μL1×NEBuffer 2和7.5μL蛋白酶K，65℃孵育30min。

2.65℃20min灭活内切酶。

3.25℃5min平衡至室温。

4.每管配制补平末端体系见表2：

表2

将该体系加入到酶切后的体系中，37℃金属浴中孵育45min(每5min颠倒混匀一次)。

5.75℃，20min，灭活酶。

6.25℃，5min平衡至室温。

7.准备相应数量的1.5ml离心管，加入表3中所示试剂。

2×Rapid Ligation Buffer(T4 DNA连接酶的缓冲液，购自enzymatics，货号：L603-HC-L)，体积是上步反应液体积+6μl，上步反应后，离心量体积，在确定加入量X。

表3

	体积(μL)
		2xRapid Ligation Buffer	Xμl
T4 DNA连接酶(L603-HC-L)	6
		总计

8.连接之后，5000rpm(2500g)离心5min，去上清，用20ul的10X T4 DNA ligasebuffer，90ul NF水重悬。

9.加入50ul 20mg/ml的蛋白酶K，20ul 10％的SDS，55℃30min。

10.加入20ul 5M NaCl。孵育温度如下：65℃90分钟，25℃5分钟。

注意：DNA纯化磁珠在使用前要恢复至室温并彻底混匀

反应结束后，5000rpm室温离心5min，丢弃沉淀，取上清进行xp(AMPure XP Beads，A63882，Beckman)纯化。加入160μl_XP(0.8倍)磁珠纯化，彻底混匀，室温孵育5min。

注意：样品在磁珠纯化后应呈现半透明状态。

11.将样品管放置在磁力架上，孵育直到液体澄清。

12.弃掉上清。样品管仍在磁力架上，加入200μl 80％乙醇，室温孵育30s。

13.弃掉上清。样品管仍在磁力架上，加入200μl 80％乙醇，室温孵育30s。

14.弃掉上清。样品管仍在磁力架上，室温孵育磁珠3-5min。

15.取下磁力架上的样品管，用70μl Elution Buffer(购自QIAGEN，货号：19086)重悬磁珠，室温孵育5min。

16.将样品管放置在磁力架上，孵育直到液体澄清，将上清液转移到新管中。

17.Qubit定量。

18.取出20ng DNA用于QC分析，储存在-20℃中。

酶切效率的验证

DNA完整性、酶切后、DNA抽纯后的中间产物三个平行样品可以一起进行检验，使用1％的琼脂糖凝胶电泳，分别取4μL两个留样和50ng中间产物(稀释至10μL)进行验证。

除去末端标记但未连接的DNA

1.取Hi-C中间产物2μg(不足2μg的则全取)，配成表4中的体系：

表4

PCR程序如下：12℃2h。

反应结束后，Qubit定量。

DNA打断

Covaris打断仪器需提前1h开启。

1.加入30μL NF Water将体积补至130μL，加入covaris管中，打断至350-500bp。

Covaris参数：peak power 450；duty factor 30；cycles burst200；time 100s。

2.将片段化的DNA产物转移(用中枪头插小枪头吸取covaris管中的液体)至新的1.5ml离心管中，补水至130μl(磁珠需提前半小时拿至室温)。

目标区域捕获(磁珠需提前半小时拿至室温)

1.震荡重悬M280磁珠，吸取20μL至1.5mL离心管中，将离心管放置在磁力架上等待约1min，待液体澄清后，小心吸取上清弃置。

2.用50μL Binding Buffer(结合缓冲液，具体配置见表5)洗涤磁珠，小心的重悬沉淀，磁力架分离1min，吸去上清。重复洗涤一次。最后用130μL Binding Buffer重悬磁珠。

3.将130μl重悬的磁珠与打断后的130μl样品小心混匀，在金属浴上反应20℃20min。

末端修复加A

4.将PCR管中的溶液放入新的1.5ml离心管中，放置在磁力架上，放置2min，待澄清后取上清留存。

5.用200μL Washing Buffer I(洗脱缓冲液，具体配置见表6)洗涤2次，用200μLEB洗涤2次。

(洗的时候需要用枪吹打混匀，然后直接放在磁力架上，去上清后，再洗第二次)

6.配制表7的末端修复加A反应体系：

表5

试剂	体积
		1M Tris-Hcl(PH 7.5)	500μl
0.5M EDTA	100μl
		5M Nacl	20ml
无核酸酶水	29.4ml

表6

试剂	体积
		Binding buffer	10ml
NF水(无核酸酶水)	10ml
		Tween 20	10μl

表7

将体系加入磁珠中，转移至PCR小管，PCR程序如下：37℃30min；72℃30min。

加接头

体系见表8。

表8

PCR程序如下：20℃30min。

文库PCR

1.将以上反应体系放入新的1.5ml离心管中，用200μL Washing Buffer I(表6)洗涤2次，用200μL Washing Buffer II(0.1M NaOH)洗涤1次(尽量快)，用200μL EB洗涤2次。洗的时候需要用枪吹打混匀，然后直接放在磁力架上，去上清后，再洗第二次。

2.配制PCR反应体系见表9：

表9

3.将体系加入磁珠中，转移至PCR小管，PCR程序如下表10：

表10

PCR结束后，取上清测Qubit，

样品Qubit值，需＞15ng/μl，总量大于750ng，若不够则酌情加2～3循环数。

文库片段选择

1.加入NF Water使样品体积达到100μl。

2.加入60μl XP磁珠，充分混匀，室温孵育5min。

3.将样品放置在磁力架上，孵育直到液体澄清。

4.转移上清液到一个新管中，丢弃带有磁珠的管。12000rpm离心3min，放回磁力架上，吸取上清到新管中(避免吸到磁珠)。

5.再次转移上清到一个新的管中，丢弃原来的管。

6.加入20μl XP磁珠，充分混匀，室温孵育5min。

7.将样品放置在磁力架上，孵育直到液体澄清。

8.弃掉上清。管仍在磁力架上，加入200μl 80％的乙醇，室温孵育30s。

9.弃掉上清。管仍在磁力架上，加入200μl 80％的乙醇，室温孵育30s。

10.弃掉上清。管仍在磁力架上，室温开盖孵育3～5min，晾干乙醇。

11.用52μl EB将DNA从磁珠上洗脱下来，混匀，放置3min后再放回磁力架上。

12.再次转移上清到一个新的管中，丢弃原来的管。

13.加入40μl XP磁珠，充分混匀，室温孵育5min。

14.将样品放置在磁力架上，孵育直到液体澄清。

15.弃掉上清。管仍在磁力架上，加入200μl 80％的乙醇，室温孵育30s。

16.弃掉上清。管仍在磁力架上，加入200μl 80％的乙醇，室温孵育30s。

17.弃掉上清。管仍在磁力架上，室温开盖孵育3-5min，晾干乙醇。

18.用22μl EB将DNA从磁珠上洗脱下来，混匀，放置3min后再放回磁力架上，吸取上清至新的1.5ml离心管中，测Qubit，稀释到适合浓度并制备稀释液(2ng/μL，稀释液体积不少于30μl)，出库。

通过上述步骤分别进行冰冻的玉米、小麦、拟南芥、黄瓜、棉花、油菜叶片建库，建库均成功，其中，玉米有效数据率28％；小麦有效数据率25％；拟南芥有效数据率32％；黄瓜有效数据率43％；棉花有效数据率38％；油菜有效数据率35％；有效数据率均＞25％，达到新鲜叶片Hi-C建库的水平。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。