一种β-半乳糖苷酶的制备方法及其应用
阅读说明：本技术 一种β-半乳糖苷酶的制备方法及其应用 (Preparation method and application of beta-galactosidase ) 是由 魏远安 曾宪维 谢志龙 杨新球 陈子健 浣金刚 于 2020-07-28 设计创作，主要内容包括：本发明属于生物化工技术领域,公开了一种β-半乳糖苷酶的制备方法,包括以下步骤：(1)将环状芽孢杆菌接种至LB培养基中培养活化,然后接种至种子罐中培养,得到种子培养液；(2)将种子培养液加入含有发酵培养基的发酵罐中发酵,得到环状芽孢杆菌发酵液；(3)将环状芽孢杆菌发酵液过滤或离心,去除菌体,得到β-半乳糖苷酶液；该发酵培养基含有乳糖、半乳糖、植物蛋白胨、玉米粉、酵母提取物、磷酸盐、碳酸盐和水。该方法的发酵时间短,缩短了生产周期,产生的酶液的比活力高。本发明还提供不使用交联剂制备β-半乳糖苷酶的固定化酶的方法,制得的固定化酶稳定性好,可连续使用264h以上,用该固定化酶制备半乳糖的成本大大降低。(The invention belongs to the technical field of biochemical engineering, and discloses a preparation method of beta-galactosidase, which comprises the following steps: (1) inoculating the bacillus circulans into an LB culture medium for culture activation, and then inoculating into a seeding tank for culture to obtain a seed culture solution; (2) adding the seed culture solution into a fermentation tank containing a fermentation medium for fermentation to obtain a bacillus circulans fermentation solution; (3) filtering or centrifuging the bacillus circulans fermentation liquor, and removing thalli to obtain beta-galactosidase liquor; the fermentation medium contains lactose, galactose, phytone, corn flour, yeast extract, phosphate, carbonate and water. The method has short fermentation time, shortened production period, and high specific activity of the enzyme solution. The invention also provides a method for preparing the immobilized enzyme of the beta-galactosidase without using a cross-linking agent, the prepared immobilized enzyme has good stability and can be continuously used for more than 264 hours, and the cost for preparing the galactose by using the immobilized enzyme is greatly reduced.)
技术领域
本发明属于生物化工技术领域，特别涉及一种β-半乳糖苷酶的制备方法及其应用。
背景技术
低聚半乳糖(galacto-oligosaccharide，GOS)是一类天然存的低聚糖，其分子结构一般是在半乳糖或葡萄糖分子上连接1-7个半乳糖基。在动物乳汁中微量存在，而在母乳中含量较高。低聚半乳糖具有较强的稳定性，即使在酸性条件下也是如此，它不被人体消化酶所消化，极少被人小肠消化吸收，具有较好的双歧杆菌增殖活性，抑制有害病原菌和腐败菌生长，促进钙、镁、钾的吸收的特性，而且由于其具有水溶性膳食纤维的属性，因此可达到润肠通便的效果。因此，低聚半乳糖在食品领域应用广泛，例如低聚半乳糖被当做营养强化剂添加到婴儿配方奶粉中。
低聚半乳糖是以乳糖(食品级乳糖、医药级乳糖、有机乳糖、乳清滤出粉、乳清液等)为原料经β-半乳糖苷酶(EC 3.2.1.23)催化制得。在自然界中，β-半乳糖苷酶广泛存在，例如苹果、杏等水果中含有，细菌、酵母、霉菌等微生物也能提供。由于从微生物中获得的β-半乳糖苷酶产量高，生产周期短，生产成本低，因此，常常通过微生物来做β-半乳糖苷酶的规模化生产。
低聚半乳糖通常采用的生产方法是使用游离细胞、酶液直接作用于乳糖或将乳糖与微生物共生发酵。但这些方法会引入游离细胞或蛋白质等杂质，甚至是次级代谢产物，需要较复杂的分离、提纯工艺，且酶的利用率不高，不利于清洁生产及成本控制。为了解决此问题，需对β-半乳糖苷酶的产酶性能和对β-半乳糖苷酶的使用方法进行优化。对酶进行固定化，使其能重复使用，已成为规模化生产低聚半乳糖的解决方向。但在对酶进行固定化的过程中常常需要使用戊二醛等作为固定化酶载体的交联剂，但交联剂的使用有时被限制，例如在营养强化剂低聚糖的生产过程中限制戊二醛的使用。另外，采用乳糖与微生物共生发酵方法也常被限制，特别是婴幼儿配方食品、有机食品等不能使用基因修饰菌种。除此之外，现有技术中，固定化β-半乳糖苷酶的使用批次仅为8批次，即只能循环使用的次数为8次(专利申请号为201480049114.3)，酶的利用率不高。现有技术中直接利用微生物发酵生产β-半乳糖苷酶的发酵周期较长，发酵工艺复杂。
因此，希望提供一种新的方法来制备β-半乳糖苷酶的固定化酶，且该方法制得的固定化酶的稳定性好，能多次循环使用，提高酶的利用率。另外，也需要提供一种新的β-半乳糖苷酶的制备方法，该方法可缩短发酵周期和简化发酵工艺，且该工艺所发酵生产的酶液制成的固定化酶有更好的使用性能。
发明内容
本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明目的之一在于提出一种β-半乳糖苷酶的制备方法，该方法是利用环状芽孢杆菌(Bacilluscirculans)生产β-半乳糖苷酶的方法，该方法能够简化发酵工艺，缩短发酵生产周期。
本发明另一目的在于提供一种β-半乳糖苷酶的固定化酶的制备方法，该方法无需使用交联剂，避免了交联剂残留对食品安全性带来的影响，且所制得的固定化酶具有好的稳定性，可循环使用的次数超过10次。
本发明另一目的为提供一种低聚半乳糖的制备方法，该方法的特点在于通过本发明制得的β-半乳糖苷酶的固定化酶催化乳糖反应，生产低聚半乳糖。
一种β-半乳糖苷酶的制备方法，包括以下步骤：
(1)将环状芽孢杆菌接种至LB培养基中培养活化，然后接种至种子罐中培养，得到种子培养液；
(2)将步骤(1)制得的种子培养液加入含有发酵培养基的发酵罐中发酵，得到环状芽孢杆菌发酵液；
(3)将步骤(2)得到的环状芽孢杆菌发酵液过滤或离心，去除菌体，得到β-半乳糖苷酶液；
所述发酵培养基含有乳糖、半乳糖、植物蛋白胨、玉米粉、酵母提取物、磷酸盐、碳酸盐和水。
优选的，步骤(1)中使用的环状芽孢杆菌为环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)购自美国菌种保藏中心(ATCC)，编号为31382；进一步优选的，步骤(1)中使用的环状芽孢杆菌为环状芽孢杆菌CCTCC NO：M 2015424，保存于中国典型培养物保藏中心。环状芽孢杆菌CCTCC NO：M 2015424由环状芽孢杆菌ATCC No.31382经紫外线及氯化锂诱导而来。
优选的，步骤(1)中所述LB培养基含有蛋白胨8-15g/L、酵母提取物2-8g/L和氯化钠2-8g/L。
进一步优选的，步骤(1)中所述LB培养基含有蛋白胨10-12g/L、酵母提取物4-6g/L和氯化钠4-6g/L。
最优选的，步骤(1)中所述LB培养基含有蛋白胨约10g/L、酵母提取物约5g/L和氯化钠约5g/L。
优选的，步骤(1)中的培养活化是在36-38℃下培养16-24小时。
优选的，步骤(1)中接种至种子罐中培养是在36-38℃下培养5-7小时。
优选的，步骤(1)中培养活化后，接种前，还包括以下步骤：将培养活化的环状芽孢杆菌加入至20-500mL的LB培养基中震荡培养5-8小时，然后接种。
优选的，所述玉米粉为玉米浆干粉。
优选的，步骤(2)中所述发酵培养基含有乳糖5-30g/L、半乳糖5-10g/L、植物蛋白胨10-30g/L、玉米浆干粉2-5g/L、酵母提取物2-4g/L、磷酸盐2-4g/L、碳酸盐1-2g/L、水余量。
优选的，所述发酵培养基还含有消泡剂，含量为0.5-2g/L。
优选的，所述发酵培养基中含有的乳糖的量为8-15g/L。
优选的，步骤(2)中发酵罐中发酵的条件为在pH为5.5-8.0下发酵，发酵的时间为24-35h。
优选的，步骤(2)中发酵罐中发酵的条件为发酵的温度为36-38℃，pH为6.0-7.6，通气(空气)量为80-160L/min，搅拌速度为120-220rpm。
进一步优选的，步骤(2)中发酵罐中发酵的条件为发酵的0-8h，pH值为6.5-7.0；8h后pH为7.2-7.6；更进一步优选的，8h后pH为为7.3-7.5。
优选的，步骤(3)中所述过滤为微滤或陶瓷膜过滤，经过微滤能去除发酵液中菌体的同时也能减少操作过程中带入杂菌，保证酶液干净卫生。
优选的，步骤(3)中所述过滤使用的是微滤膜，更优选的，所述微滤膜为0.2-0.8μm的微滤膜。
优选的，步骤(3)中所述离心采用碟片离心机进行离心处理。
优选的，步骤(3)得到β-半乳糖苷酶液后，还包括浓缩处理，具体的浓缩处理为将所得的β-半乳糖苷酶液用10-35％(质量分数)的硫酸铵或氯化钠进行盐析提纯，然后用10-100KD的膜进行浓缩。该处理可保证β-半乳糖苷酶液的电导为4-20ms/cm，酶活为80-120U/mL。
优选的，所述磷酸盐选自磷酸氢二铵、磷酸二氢铵、磷酸氢钙、磷酸钙、焦磷酸钙、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、酸式焦磷酸钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、磷酸钠或焦磷酸钠中的至少一种。
优选的，所述碳酸盐选择碳酸钠、碳酸钾、碳酸氢钠或碳酸氢钾中的至少一种。
优选的，所述植物蛋白胨为大豆蛋白胨。
优选的，所述消泡剂选自月桂酸、棕榈酸、脂肪酸甘油脂、、硬脂酸和棕榈酸的钙、铝、镁皂或脂肪醇中的至少一种。
本发明的另一个方面还涉及一种β-半乳糖苷酶的固定化酶的制备方法，包括以下步骤：
将离子交换树脂与β-半乳糖苷酶液混合进行反应，得到β-半乳糖苷酶的固定化酶。
优选的，所述离子交换树脂含有叔胺基。
优选的，所述离子交换树脂为苯乙烯系弱碱性阴离子交换树脂；进一步优选的，所述离子交换树脂为带有叔胺基官能团的大孔苯乙烯系弱碱性阴离子交换树脂。
优选的，所述离子交换树脂与β-半乳糖苷酶液的用量比为1g：(70-140)U。
优选的，所述反应的温度为6-35℃；进一步优选的，所述反应的温度为8-25℃；更进一步优选的，所述反应的温度为8-20℃。
优选的，所述反应的时间为16-24h。
优选的，所述离子交换树脂在使用前应先用水浸泡2-5h，既得活化后的树脂。此步骤是为了保持离子交换树脂湿润，避免离子交换树脂过于干燥出现离子交换树脂结构的改变。
优选的，所述水为去离子水。
优选的，所述反应是在电导4-20ms/cm的条件下进行(即将β-半乳糖苷酶液的电导调节为4-20ms/cm)。
最优选的，本发明提供一种β-半乳糖苷酶的固定化酶的制备方法，包括以下步骤：
将离子交换树脂在去离子水中浸泡2-5h，得活化的离子交换树脂，然后将离子交换树脂与β-半乳糖苷酶液按照用量比为1g：(70-140)U混合，在电导4-20ms/cm的条件下进行搅拌，反应16-24h，制得β-半乳糖苷酶的固定化酶。
本发明的另一个方面还涉及一种低聚半乳糖的制备方法，包括以下步骤：
将β-半乳糖苷酶的固定化酶与乳糖混合，搅拌反应，制得低聚半乳糖。
优选的，所述β-半乳糖苷酶的固定化酶与乳糖的用量比为，每千克乳糖中加入3000-25000U的β-半乳糖苷酶的固定化酶。
优选的，所述乳糖为乳糖溶液，所述乳糖溶液的质量浓度为35-55％。
优选的，所述反应的温度为45-60℃，反应的时间为6-35h。
优选的，所述乳糖选自食品级乳糖、医药级乳糖或乳清滤出粉中的至少一种(食品级乳糖、医药级乳糖或乳清滤出粉为常规市售产品)。
乳清滤出粉与食品级乳糖及医用级乳糖相比，盐分较高，也含有较多的B族维生素及蛋白等营养物质。
相对于现有技术，本发明的有益效果如下：
(1)本发明最大的优势是解决规模化制备低聚半乳糖的工艺及成本问题，由于本发明发酵培养基的使用，使得本发明发酵产生β-半乳糖苷酶的发酵时间短，缩短了生产周期，且发酵方式简单，无需进行补料诱导，虽然现有技术中常在发酵后期补料诱导有利于酶活的提高，但分批配料增加了人员负担及设备投入，且存有较大的染菌隐患。
(2)本发明发酵产生β-半乳糖苷酶所用菌种是非基因修饰菌种，安全可靠，且该菌种按本发明所述的发酵过程所生产的酶液具有较高的比活力，在进行固定化酶生产时能减少树脂的使用量，经过固定化之后能表现出更好的转化乳糖生成GOS的性能。
(3)本发明的β-半乳糖苷酶的固定化酶的制备过程中无需使用交联剂等化学试剂，避免了交联剂残留对食品安全性带来的影响，且所制得的固定化酶具有好的稳定性，可循环使用的次数超过10次或连续使用264h以上，对制备低聚半乳糖最直接的影响就是降低了用酶的成本。
附图说明
图1为实施例6中发酵罐A、发酵罐B、发酵罐C三种情况下发酵液的酶活与发酵时间的对比图。
具体实施方式
为了让本领域技术人员更加清楚明白本发明所述技术方案，现列举以下实施例进行说明。需要指出的是，以下实施例对本发明要求的保护范围不构成限制作用。
以下实施例中所用的原料、试剂或装置如无特殊说明，均可从常规商业途径得到，或者可以通过现有已知方法得到。
以下对描述本发明的几个概念进行说明。
β-半乳糖苷酶酶活的定义：在1mL含有浓度为4mg/mL的ONPG(即邻硝基苯β-D-半乳吡喃糖苷，ONPG可被β-半乳糖苷酶水解为半乳糖和黄色的邻-硝基苯酚，因此可以通过培养液颜色的变化测知β-半乳糖苷酶的活性)0.1M磷酸缓冲液(pH6.0)中加入1mLβ-半乳糖苷酶酶液，在50℃反应10min，加入2mL10％(质量分数)碳酸钠溶液终止反应，通过测定产物中邻硝基酚含量计算ONPG的水解量。在此条件下每分钟水解1μM ONPG所需的酶量定义为一个酶活单位(U)。
低聚半乳糖的含量测定标准：参照AOAC Official Method 2001.02《Determination of trans-Galacto-oligosaccharides(TGOS)in Selected FoodProducts》。
实施例1：β-半乳糖苷酶的制备
一种β-半乳糖苷酶的制备方法，包括以下步骤：
(1)将1接种环环状芽孢杆菌(购自美国菌种保藏中心(ATCC)，编号为31382)接种至50mL LB培养基中，在37℃下培养18小时，活化，将培养活化的环状芽孢杆菌加入至装有500mL的LB培养基的三角瓶中，于37℃、180rpm振荡培养6小时，然后接种至种子罐中培养，得到种子培养液；
(2)将步骤(1)制得的种子培养液加入含有120L发酵培养基的200L的发酵罐中发酵，用10％(质量分数)氢氧化钠溶液调节发酵罐中的pH为6.64，于37±0.5℃下，搅拌速度180rpm、通气量120L/min发酵8h，8h后用盐酸进行调节pH值至7.45±0.5，12h后间隔2h取样检测酶活，至发酵酶活不再上升，即发酵42h得到酶活为31.2U/mL的环状芽孢杆菌发酵液112L；
(3)将步骤(2)得到的环状芽孢杆菌发酵液在6℃下，经微滤膜进行酶液与菌体分离，然后采用50KD的膜进行酶液浓缩，得到酶活为101.7U/mL的β-半乳糖苷酶液31.8L；
步骤(2)中发酵培养基含有乳糖1200g、半乳糖960g、大豆蛋白胨1920g、玉米浆干粉486g、酵母提取物312g、磷酸氢二铵312g、碳酸钠156g、消泡剂100g和水。
实施例2：β-半乳糖苷酶的制备
实施例2与实施例1不同之处仅在于步骤(1)中用环状芽孢杆菌CCTCC NO：M2015424替代环状芽孢杆菌(购自美国菌种保藏中心(ATCC)，编号为31382)，发酵30h得到酶活为46.3U/mL的环状芽孢杆菌发酵液115L；经微滤去除菌体及50KD膜浓缩后得到酶活为107.6U/mL的酶液46.0L。
实施例3：β-半乳糖苷酶的固定化酶的制备
1.粗酶的精制
取实施例2浓缩获得的酶液46L，向其中缓慢添加硫酸铵6.9kg，待硫酸铵完全溶解后，于6℃静置1小时后，利用50KD的膜进行酶液的清洗，得到46.8L酶活为102.1U/mL，电导率为7.84ms/cm的精制的β-半乳糖苷酶液(即每1mLβ-半乳糖苷酶液中，β-半乳糖苷酶的酶活为102.1U)。
2.β-半乳糖苷酶的固定化酶的制备
一种β-半乳糖苷酶的固定化酶的制备方法，包括以下步骤：
将42Kg的大孔苯乙烯系弱碱性阴离子交换树脂A103s(该树脂由漂莱特(中国)有限公司提供，树脂孔径为30-50nm)在去离子水中浸泡4h，过滤，得活化的大孔苯乙烯系弱碱性阴离子交换树脂A103s，然后将大孔苯乙烯系弱碱性阴离子交换树脂A103s与46.8L酶活为102.1U/mL，电导率为7.84ms/cm的精制的β-半乳糖苷酶液混合，在12℃，搅拌速度为30rpm下，反应16h，用去离子水清洗后得到41.1kg酶活为111.6U/g(即每g固定化酶中，β-半乳糖苷酶的酶活为111.6U)的β-半乳糖苷酶的固定化酶。
实施例4：用β-半乳糖苷酶的固定化酶制备低聚半乳糖
一种低聚半乳糖的制备方法，包括以下步骤：
在1000L反应罐中加入质量浓度为50％的乳糖溶液800Kg(乳糖含量为400Kg)，加入实施例3制备的β-半乳糖苷酶的固定化酶25kg(即对应每g乳糖的酶活添加量为6.98U)，于50℃、80rpm条件下反应14小时后，采用100目的滤网分离反应产物，得到固定化酶与糖浆，糖浆经过滤、真空浓缩器浓缩得到低聚半乳糖质量含量为58.9％的Brix(白利度)为75.8的糖浆，固定化酶则可以再次投入反应罐进行反应。
实施例5：用β-半乳糖苷酶的固定化酶制备低聚半乳糖
一种低聚半乳糖的制备方法，包括以下步骤：
在1000L反应罐中加入质量浓度为50％的乳清滤出粉(按质量分数计，乳清滤出粉中，乳糖占干基的95.74％，蛋白质占1.26％，电导灰分占0.21％)溶液800Kg(乳清滤出粉含量为400Kg)，加入实施例3制备的β-半乳糖苷酶的固定化酶25kg(即对应每g乳糖的酶活添加量为4.40U)，于50℃、80rpm条件下反应15小时后，采用100目的滤网分离反应产物，得到固定化酶与糖浆，糖浆经过滤去除固定化酶、真空浓缩器浓缩得到低聚半乳糖质量含量为57.8％的Brix(白利度)为75.6的糖浆，固定化酶则可以再次投入反应罐进行反应。
实施例6：不同发酵条件对环状芽孢杆菌产β-半乳糖苷酶能力的影响
与实施例1相比，以下设置3个发酵情况，分别为发酵罐A、发酵罐B、发酵罐C，发酵罐的体积都为5L，发酵液(发酵液为种子培养液与发酵培养基混合后的称呼，包括发酵产物)的体积都为2500mL，与实施例1相比，3个发酵罐主要改变发酵培养基的组分，步骤(2)发酵罐中发酵的pH，发酵菌种，其余未提及的发酵条件与实施例1相同，具体如下：
发酵罐A：发酵培养基的组分为：乳糖25g、半乳糖20g、大豆蛋白胨40g、玉米浆干粉10g、酵母提取物6.5g、磷酸氢二铵6.5g、碳酸钠3.25g、消泡剂1.5g和水。菌种为购自美国菌种保藏中心(ATCC)，编号为31382的环状芽孢杆菌。步骤(2)中发酵罐中发酵的条件为在pH为7.4下发酵。
发酵罐B：发酵培养基的组分为：乳糖12.5g、半乳糖20g、大豆蛋白胨40g、玉米浆干粉10g、酵母提取物6.5g、磷酸氢二铵6.5g、碳酸钠3.25g、消泡剂1.5g和水。菌种为购自美国菌种保藏中心(ATCC)，编号为31382的环状芽孢杆菌。步骤(2)中发酵罐中发酵的条件为在pH为7.4下发酵。步骤(2)发酵过程中补料125g质量浓度为10％的乳糖溶液。
发酵罐C：发酵培养基的组分为：乳糖25g、半乳糖20g、大豆蛋白胨40g、玉米浆干粉10g、酵母提取物6.5g、磷酸氢二铵6.5g、碳酸钠3.25g、消泡剂1.5g和水。菌种为环状芽孢杆菌CCTCC NO：M 2015424；步骤(2)中发酵罐中发酵的条件为发酵的0-8h，pH值为6.75±0.05；8h后pH为7.4。
步骤(2)发酵罐中发酵12h后，每间隔2h取样检测酶活，结果如图1所示。图1为实施例6中发酵罐A、发酵罐B、发酵罐C三种情况下发酵液的酶活与发酵时间的对比图，其中，曲线A表示发酵罐A中发酵液的酶活与发酵时间的关系，曲线B表示发酵罐B中发酵液的酶活与发酵时间的关系，曲线C表示发酵罐C中发酵液的酶活与发酵时间的关系。
从图1可以看出，表示发酵罐C发酵情况的曲线C显示发酵罐C中发酵速度较快，前期酶活较高，26h发酵液中酶活已达到40U/mL，42h酶活达45.88U/mL；与发酵罐B中42h达到的酶活46.80U/mL接近。即发酵罐C中在不需要进行补料诱导等的操作条件下，在较短时间28-30h内即可达到较高的酶活水平，比发酵罐B节约生产时间8-12h，能有效缩短生产周期，减少发酵时的能耗，且不需要进行分批灭菌及补料，避免了补料可能引起的染菌隐患，简化了生产工艺。从曲线A和曲线C可以看出，发酵罐A的发酵缓慢，酶活较低，可见发酵菌种的选择以及发酵过程中pH的控制对发酵液中酶活也起到重要的影响。
实施例7：不同发酵条件对环状芽孢杆菌产β-半乳糖苷酶对酶固定化的影响
取实施例6中的发酵罐A、B、C的酶液经微滤分离后进行蛋白质含量的检测，计算酶的比活力(酶活力除以mg蛋白)，并按200U/g树脂(此时酶的添加量＞树脂的吸附量，即让树脂饱和吸附)的量添加用水活化的大孔苯乙烯系弱碱性阴离子交换树脂A103s，在12℃，搅拌速度为30rpm下，吸附反应20h，计算出单位树脂所吸附的酶活。然后按5U每g乳糖的量加入50％的乳糖溶液，按实施例4中的反应条件转化24h，检测GOS含量，结果如下表1所示：
表1
酶的比活力能直接体现酶的纯度，从表1的结果可以看出不同的菌种、发酵条件(包括发酵时间)都会对酶的纯度产生影响。酶的纯度越高，在酶的固定化时所需的载体(树脂)用量越少，节约生产成本；且酶在固定化后能显示出更好的转化乳糖生成GOS的性能。
实施例8：β-半乳糖苷酶的固定化酶的制备条件对β-半乳糖苷酶使用性能的影响
1.交联剂对β-半乳糖苷酶的固定化酶的影响
两个250mL三角瓶(编号为三角瓶A和三角瓶B)中分别加入3.3g用去离子水清洗的大孔苯乙烯系弱碱性阴离子交换树脂A103s，向三角瓶A中加入去离子水，添加30％质量浓度的戊二醛0.5mL，使三角瓶A内戊二醛的质量浓度约为0.15％，并置于25℃下反应12h；三角瓶B中添加0.5mL去离子水，然后分别向三角瓶A和三角瓶B中按110U/g树脂的加酶量加入实施例1制得的β-半乳糖苷酶液，在10℃下反应16h，制得β-半乳糖苷酶的固定化酶。
对三角瓶A和三角瓶B所制得的固定化酶按10U/g乳糖进行连续摇瓶转化8批次，即循环使用8次，每次转化时间24h，第8次的GOS转化率分别是三角瓶A制得的固定化酶对应51.96％；三角瓶B制得的固定化酶对应55.32％。可见不使用戊二醛作为交联剂制得的固定化酶表现出了更稳定的转化性能。
不添加交联剂制得的固定化酶第8次使用，GOS的含量仍可以达到55％(即相同的反应物用量及反应条件下，产物中GOS的含量为55％)以上，相比于第1批次的57％，下降幅度很小。专利申请号为201480049114.3经8次反应，GOS含量由69.00％下降到48.93％，用本发明方法生产的β-半乳糖苷酶的固定化酶的催化性能更加平稳，以24h转化时间计算，连续转化264h(即循环使用11次)后，GOS含量仍可达到54％以上。
2.电导条件对β-半乳糖苷酶的固定化酶的影响
取酶活为98.72U/mL，β-半乳糖苷酶液4mL分别加入两个50mL三角瓶C和三角瓶D中，三角瓶C中用1％(质量分数)硫酸铵溶液调节电导至10.06ms/cm；三角瓶D中不调节电导(检测电导为2.03ms/cm)，往三角瓶C和三角瓶D中均加入活化的大孔苯乙烯系弱碱性阴离子交换树脂A103s 3.3g，在10℃下摇床吸附反应，摇床轻微晃动使大孔苯乙烯系弱碱性阴离子交换树脂A103s能与β-半乳糖苷酶液均匀接触，反应16h制得固定化酶C和固定化酶D，并检测三角瓶中残液酶活，三角瓶C中的残液酶活为1.06U/mL、三角瓶D的残液酶活为0.45U/mL。
将所制得的固定化酶C、固定化酶D与乳糖反应，进行连续摇瓶转化验证，固定化酶C连续转化5次(120h)，第5次的产物GOS含量为55.84％；固定化酶D转化5次(120h)，第5次的产物GOS含量为46.28％。可见固定化酶生产时的电导环境对固定化酶的使用寿命有着较明显的影响。
实施例9
在三角瓶中分别加入下表2中用水活化的两种树脂3g，按130U/g树脂的添加量加入酶活为102.1U/mL的实施例3制得的精制的β-半乳糖苷酶液3.8mL，12℃，转速30rpm，反应16h得到固定化酶。将制得的固定化酶加入含100g(质量浓度50％)乳糖溶液的三角瓶中，50℃，80rpm，转化24h后检测溶液中GOS的含量。然后将溶液与固定化酶分离，重新加入100g浓度为50％的乳糖溶液，按上述条件进行转化反应并检测溶液GOS含量。通过多次转化反应，A103S经过11次得转化反应，其溶液GOS含量在53％以上，具体见下表2。
表2
从表2可以看出，使用A103s(大孔苯乙烯系弱碱性阴离子交换树脂A103s)制得的固定化酶用来制备GOS的效果更好。