阅读说明：本技术 一种新型β-半乳糖苷酶GalA及其应用 (Novel β -galactosidase GalA and application thereof ) 是由 陈豪 董娟 陈鹏 狄国虎 吴祥根 于 2020-04-22 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种新型β-半乳糖苷酶GalA及其应用。所述β-半乳糖苷酶GalA氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明提供一种所述β-半乳糖苷酶GalA的重组表达及纯化制备方法,发酵液酶活力可达3795.6U/mL,一步纯化纯度>97％,回收率为79.5％。本发明所述β-半乳糖苷酶GalA具有良好的热稳定性和储存稳定性,最适反应温度为50℃,在50℃下持续孵育24h仍保留89.7％的酶活力,室温下(30℃)储存30天,仍然能保留81.5％的酶活力。本发明所述β-半乳糖苷酶GalA活力高、稳定性好,降解乳糖能力强,具有良好的应用潜质。(The invention relates to a novel β -galactosidase GalA and application thereof, wherein an amino acid sequence of the β -galactosidase GalA is shown as SEQ ID No. 1. the invention provides a recombinant expression and purification preparation method of the β -galactosidase GalA, wherein the enzyme activity of a fermentation broth can reach 3795.6U/m L, the one-step purification purity is more than 97%, and the recovery rate is 79.5%.)

一种新型β-半乳糖苷酶GalA及其应用

技术领域

本发明涉及一种新型β-半乳糖苷酶GalA及其应用，属于生物技术领域。

背景技术

β-半乳糖苷酶(EC 3.2.1.23)是一种糖苷水解酶，可催化乳糖水解和转半乳糖基化反应。作为一种常用的医用酶，β-半乳糖苷酶已广泛用于乳制品行业中将乳糖分解为半乳糖和葡萄糖。此外，β-半乳糖苷酶还可以在乳糖或其他与结构相关的半乳糖苷水解过程中通过转糖基化作用产生半乳糖寡糖。β-半乳糖苷酶可广泛用于营养和食品加工。

β-半乳糖苷酶的水解活性已经在食品工业中使用了数十年，以帮助吸收未消化的乳糖。全世界，特别是在东亚，许多儿童和成人正面临乳糖消化不良和乳糖酶缺乏引起的不耐受的问题。这些疾病背后的原因是小肠中β-半乳糖苷酶活性降低或合成降低。患有乳糖不耐症的人只能食用不含或很少乳糖的乳制品。为了克服乳糖不耐症带来的局限性，可以通过降解牛奶中的乳糖来使牛奶中的乳糖降解。此外，人们在食用奶制品之前服用含有β-半乳糖苷酶的药物，这也可以有效降低乳糖浓度。在食品工业中，β-半乳糖苷酶的水解活性还被用于减少冰淇淋和炼乳中的结晶。

尽管β-半乳糖苷酶已从多种生物中纯化和鉴定，例如细菌，真菌，酵母，植物和哺乳动物等。由于产量，稳定性，降解效率等问题，能够用于商品化应用的β-半乳糖苷酶仍然很少。而且，目前市场上销售的β-半乳糖苷酶价格昂贵、品种单一，无法满足特定条件下的应用，因此急需开发新的β-半乳糖苷酶。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供了一种新型β-半乳糖苷酶GalA及其制备方法。本发明提供一种所述β-半乳糖苷酶GalA的重组表达及纯化制备方法，发酵液酶活力可达3795.6U/mL，一步纯化纯度>97％，回收率为79.5％。本发明所述β-半乳糖苷酶GalA具有良好的热稳定性和储存稳定性，最适反应温度为50℃，在50℃下持续孵育24h仍保留89.7％的酶活力，常温(30℃)下储存30天，仍然能保留81.5％的酶活力。本发明所述β-半乳糖苷酶GalA活力高、稳定性好，降解乳糖能力强，具有良好的应用潜质。

一方面，本发明提供一种新型β-半乳糖苷酶GalA，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

SEQ ID NO.1：

MINEKLPKIWRFEDDGLKPDDEVWDEIRMFKLDGIDVDTLNVFSWDLNQPDEETYDFTWLDEQIDRLYENGIYTCLDTSTDDHPDWMDKKYPDVLRVDYQGRKRDFGGRHNSCPNSTRSYKYDERMDDRLGERYKDHPGVLIWHVSNMYGGYCYCDNCDDSFRKWLQQKYGTLQNVNKDWNTRFWGHTFYDWDEIVPPNVLSEEWEGDSTNFQGISLDYRIFQSDSLLECFKLERDDLKKHTPNLPETTNLMGTYKELDYFKWGKEMHVVSWDNYPDYDTPVSFTDMDHDLMTALKSGQPFMLMEQTPSQQNWQPYNSLKRPGVMRLWSYQDVDRGDETVMFFQLRRSVGDCEKYHGDVIEHVGHENTRVFRETDDLGKELGNLSDDLLDDRVQDKVDIVFDWENRWDTELSSGPSKDLDYVKEVHNYYDDLFDENIPVDMIGVDEDLSKYEIVIDPVLYMVKSGYDDRVKEFVQNGGTFVTTFFSGIVNEHDLVTLGGYPGELRDLLGIWVEEIDDLPPEVKNQIVITNDTGRLTGTYECRLLFDIIHSEGDDVLDEYGSAFYFGTPVITRHTYGKGKTYYVGTCPDQDFLTRFMKTVCAEKEIDPLLNVPKGVEVTERRKRGESYFFIMNHNDSTVELEIGEGTHLLTGKELTGDTSLEDYRGEGTA

另一方面，本发明还提供一种所述β-半乳糖苷酶GalA对应的核酸序列，如SEQ IDNO.2所示。

SEQ ID NO.2：

ATGATCAACGAAAAACTGCCGAAAATCTGGCGTTTCGAAGACGACGGTCTGAAACCGGACGACGAAGTTTGGGACGAAATCCGTATGTTCAAACTGGACGGTATCGACGTTGACACCCTGAACGTTTTCTCTTGGGACCTGAACCAGCCGGACGAAGAAACCTACGACTTCACCTGGCTGGACGAACAGATCGACCGTCTGTACGAAAACGGTATCTACACCTGCCTGGACACCTCTACCGACGACCACCCGGACTGGATGGACAAAAAATACCCGGACGTTCTGCGTGTTGACTACCAGGGTCGTAAACGTGACTTCGGTGGTCGTCACAACTCTTGCCCGAACTCTACCCGTTCTTACAAATACGACGAACGTATGGACGACCGTCTGGGTGAACGTTACAAAGACCACCCGGGTGTTCTGATCTGGCACGTTTCTAACATGTACGGTGGTTACTGCTACTGCGACAACTGCGACGACTCTTTCCGTAAATGGCTGCAGCAGAAATACGGTACCCTGCAGAACGTTAACAAAGACTGGAACACCCGTTTCTGGGGTCACACCTTCTACGACTGGGACGAAATCGTTCCGCCGAACGTTCTGTCTGAAGAATGGGAAGGTGACTCTACCAACTTCCAGGGTATCTCTCTGGACTACCGTATCTTCCAGTCTGACTCTCTGCTGGAATGCTTCAAACTGGAACGTGACGACCTGAAAAAACACACCCCGAACCTGCCGGAAACCACCAACCTGATGGGTACCTACAAAGAACTGGACTACTTCAAATGGGGTAAAGAAATGCACGTTGTTTCTTGGGACAACTACCCGGACTACGACACCCCGGTTTCTTTCACCGACATGGACCACGACCTGATGACCGCTCTGAAATCTGGTCAGCCGTTCATGCTGATGGAACAGACCCCGTCTCAGCAGAACTGGCAGCCGTACAACTCTCTGAAACGTCCGGGTGTTATGCGTCTGTGGTCTTACCAGGACGTTGACCGTGGTGACGAAACCGTTATGTTCTTCCAGCTGCGTCGTTCTGTTGGTGACTGCGAAAAATACCACGGTGACGTTATCGAACACGTTGGTCACGAAAACACCCGTGTTTTCCGTGAAACCGACGACCTGGGTAAAGAACTGGGTAACCTGTCTGACGACCTGCTGGACGACCGTGTTCAGGACAAAGTTGACATCGTTTTCGACTGGGAAAACCGTTGGGACACCGAACTGTCTTCTGGTCCGTCTAAAGACCTGGACTACGTTAAAGAAGTTCACAACTACTACGACGACCTGTTCGACGAAAACATCCCGGTTGACATGATCGGTGTTGACGAAGACCTGTCTAAATACGAAATCGTTATCGACCCGGTTCTGTACATGGTTAAATCTGGTTACGACGACCGTGTTAAAGAATTCGTTCAGAACGGTGGTACCTTCGTTACCACCTTCTTCTCTGGTATCGTTAACGAACACGACCTGGTTACCCTGGGTGGTTACCCGGGTGAACTGCGTGACCTGCTGGGTATCTGGGTTGAAGAAATCGACGACCTGCCGCCGGAAGTTAAAAACCAGATCGTTATCACCAACGACACCGGTCGTCTGACCGGTACCTACGAATGCCGTCTGCTGTTCGACATCATCCACTCTGAAGGTGACGACGTTCTGGACGAATACGGTTCTGCTTTCTACTTCGGTACCCCGGTTATCACCCGTCACACCTACGGTAAAGGTAAAACCTACTACGTTGGTACCTGCCCGGACCAGGACTTCCTGACCCGTTTCATGAAAACCGTTTGCGCTGAAAAAGAAATCGACCCGCTGCTGAACGTTCCGAAAGGTGTTGAAGTTACCGAACGTCGTAAACGTGGTGAATCTTACTTCTTCATCATGAACCACAACGACTCTACCGTTGAACTGGAAATCGGTGAAGGTACCCACCTGCTGACCGGTAAAGAACTGACCGGTGACACCTCTCTGGAAGACTACCGTGGTGAAGGTACCGCT

另一方面，本发明还提供一种所述β-半乳糖苷酶GalA的制备与纯化方法。

另一方面，本发明还提供了所述β-半乳糖苷酶GalA在降解乳糖中的应用。

另一方面，一种降解牛奶中乳糖的方法，所选用的β-半乳糖苷酶为GalA。

优选：所述降解条件中反应温度为0～70℃。最适反应温度为50℃。

有益效果：

1.本发明的β-半乳糖苷酶GalA为新颖的β-半乳糖苷酶，在《Genbank》数据库中与本发明所述β-半乳糖苷酶最高氨基酸序列相似度仅为88.87％，说明本发明的β-半乳糖苷酶为序列和结构新颖的β-半乳糖苷酶。

2.本发明提供了一种制备β-半乳糖苷酶的方法，即利用基因工程的技术方法，将β-半乳糖苷酶GalA的基因序列异源重组表达到大肠杆菌，经发酵后，发酵液酶活力达到3795.6U/mL。该酶纯化方法简单，利用镍柱对其进行一步亲和纯化，回收率高达79.5％，蛋白质纯度>97％。

3.本发明所述β-半乳糖苷酶GalA具有良好的热稳定性和储存稳定性，在50℃下持续孵育24h仍保留高的酶活力，适合大规模持续降解，常温下储存30天，仍然能保留80％以上的酶活力，保存方便，具有良好的应用潜质。

综上所述，本发明所述β-半乳糖苷酶GalA序列新颖、产量高、制备简单、性质稳定，具有良好的工业化应用潜质。

附图说明

图1为本发明β-半乳糖苷酶GalA的蛋白质分离纯化图(M，蛋白质标准品；1，纯化所得β-半乳糖苷酶GalA)；

图2为本发明β-半乳糖苷酶GalA在50℃孵育的热稳定性图；

图3为本发明β-半乳糖苷酶GalA在常温30℃下的储藏稳定性图；

图4为薄层层析(TLC)法检测本发明β-半乳糖苷酶GalA在牛奶中乳糖降解产物图(1，葡萄糖标准品；2，半乳糖标准品；3，乳糖底物；4，多聚寡糖标准品；5，乳糖降解10min样品，6，乳糖降解20min样品；7，乳糖降解40min样品；8，乳糖降解60min样品)。

具体实施方式

实施例1β-半乳糖苷酶GalA的序列分析

本发明所述β-半乳糖苷酶GalA的产酶基因galA为人工合成序列。前期研究中，发明人发现深海细菌Q15具有较高的乳糖降解活性，对其进行全基因测序时，发现其含有一个预测的β-半乳糖苷酶序列，将其命名为galA。在氨基酸序列不变的情况下，发明人将该基因序列根据宿主(大肠杆菌的)的密码子偏好性，进行了碱基序列优化，利于其在大肠杆菌中进行高效表达。本发明所述β-半乳糖苷酶包含有2007个碱基序列，编码669个氨基酸序列。

多重序列比对Basic Local Alignment Search Tool(Blast)发现，在《Genbank》数据库中，与本发明所述的β-半乳糖苷酶氨基酸序列相似度最高的为Bacillus属的蛋白(WP_053430202，WP_134230305和WP_010899827)，这三个蛋白均含有672个氨基酸序列。其中《WP_053430202》与本发明所述β-半乳糖苷酶GalA的氨基酸序列相似度为88.87％；《WP_134230305》与本发明所述β-半乳糖苷酶GalA的氨基酸序列相似度为88.72％；《WP_010899827》与本发明所述β-半乳糖苷酶GalA的氨基酸序列相似度为88.42％。发明人深入分析发现《Genbank》中β-半乳糖苷酶(WP_053430202，WP_134230305和WP_010899827)为预测蛋白，并未有现有技术报道其生物学功能。

将β-半乳糖苷酶GalA的碱基序列以限制性内切酶Nco I和Xho I为酶切位点，设计重组引物如下(下划线为限制性内切酶位点，斜体为限制性内切酶保护碱基)：

正向引物：PGalA-F：

5’-CATGCCATGGATGATCAACGAAAAACTGCC-3’(Nco I)

反向引物：PGalA-R：

5’-CCGCTCGAGAGCGGTACCTTCACCACGGT-3’(Xho I)

PCR扩增条件为：94℃预变性3min；94℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸1min，共30个循环；72℃延伸2min；4℃稳定15min。PCR反应所用DNA聚合酶为Primerstar HS购自大连宝生物公司。

PCR产物用限制性内切酶Nco I和Xho I进行双酶切，通过琼脂糖凝胶电泳回收酶切后的PCR产物。pET22b(+)质粒DNA(美国Invitrogen公司)，同样用限制性内切酶Nco I和Xho I进行双酶切，进行琼脂糖凝胶电泳并回收酶切后的产物片段。酶切所用酶和底物反应体系(温度、时间、DNA用量等)均参照大连宝生物提供的产品说明操作。

双酶切处理的PCR产物和pET-22b(+)质粒载体参照DNA连接酶(大连宝生物公司)说明书进行连接反应；连接产物转化至大肠杆菌DH5α菌株(美国Invitrogen公司)，涂布在Luria-Bertani(LB)培养基固体平板上(含有50μg/mL氨苄青霉素的)，37℃温箱中培养12-16小时后，挑取单克隆；将单克隆转接至LB液体培养基中(含有50μg/mL氨苄青霉素)，转速为180rpm的37℃摇床中培养过夜。将单克隆进行序列测定，选择阳性克隆，并将其命名为pET22b-GalA。重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)(购自大连宝生物公司)，将重组大肠菌株命名为BL21(DE3)/pET22b-GalA，保存在-80℃备用。

实施例2β-半乳糖苷酶GalA的制备及纯化方法

将重组菌株BL21(DE3)/pET22b-GalA在100mL的LB液体培养基中(50μg/mL氨苄青霉素)，在37℃摇床中180rpm震荡培养至OD₆₀₀＝0.6，加入终浓度为0.1mM的诱导剂异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，在20℃诱导20h。底物4-Nitrophenyl-β-d-glucopyranoside，ONPG(购置于Sigma Alddrich,USA)用于β-半乳糖苷酶活性测定。β-半乳糖苷酶GalA的酶活标准测定方法为：100μL酶液加入900μL 0.3％ONPG底物(20mM Tris-HCl缓冲液，pH 7.0)，在50℃下反应10min，加入1M的Na₂CO₃试剂终止反应，根据ONP标准曲线在OD₄₂₀nm处确定活性。β-半乳糖苷酶的单位(U)定义为在分析条件下每分钟释放1μmol ONP所需的酶量。

发酵停止后，12000rpm离心10min，弃菌体，收集上清液；发酵上清液上样于10mL镍离子亲和层析柱，上样流速为5mL/min，利用10mM咪唑洗脱，去除杂蛋白，再利用150mM的咪唑洗脱，收集洗脱组分。将活性成分透析去除咪唑，分装储存在-20℃备用。通过镍离子一步亲和纯化，蛋白回收率达到79.5％。纯化所得β-半乳糖苷酶GalA进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，如图1所示，β-半乳糖苷酶GalA的分子量为80kDa左右，与序列分析中预测的蛋白大小一致(78.4kDa)。通过凝胶分析发现，纯化所得β-半乳糖苷酶GalA的蛋白纯度达到97％以上。

实施例3β-半乳糖苷酶GalA的稳定性

将实施例2中纯化所得β-半乳糖苷酶GalA在不同条件下进行酶活力测定，检测不同温度和pH对酶活力的影响。在不同温度(0-70℃)下反应10min，检测不同反应温度对酶活力的影响，以最高酶活力为100％，计算不同温度下β-半乳糖苷酶GalA的相对酶活力，β-半乳糖苷酶GalA的最适反应温度为50℃。将β-半乳糖苷酶GalA在50℃孵育不同时间(6，12，18，24，30，36h)，在最适反应温度(50℃)下检测剩余酶活力，以孵育前的酶活力作为100％。如图2所示，β-半乳糖苷酶GalA具有良好的热稳定性，在50℃下持续孵育24h仍保留89.7％的酶活力，表明本发明所述β-半乳糖苷酶GalA能够在最适反应温度下能够持续发挥作用。

将实施例2中纯化所得β-半乳糖苷酶GalA在常温(30℃)下孵育不同时间(10，20，30，40，50，60天)，取出后，在其最适反应温度(50℃)下检测其酶活力，以孵育前的活力作为100％，如图3所示，β-半乳糖苷酶GalA在30℃下储存30天，仍然能保留81.5％的酶活力，表明本发明所述β-半乳糖苷酶GalA具有良好的储存稳定性。

因此，本发明所述β-半乳糖苷酶GalA具有良好的热稳定性和储存稳定性，利于其后续开发利用。

实施例4β-半乳糖苷酶GalA酶解产物薄层层析分析

将实施例2中纯化所得β-半乳糖苷酶GalA与牛奶(采购自蒙牛)在50℃下分别孵育0，10，20，40，60min，然后在高效薄层层析板(HPTLC)检测。具体为：将HPTLC层析板裁剪成7cm宽合适大小的样本，将孵育前后样品点样在原点处，置于有展开剂(正丁醇/甲酸/水＝5:3:2)的展缸中30min，吹干层析板，浸入显色剂(90％乙醇和10％，v/v)中2s，取出吹干，80℃烘烤，至样品出现。如图4所示，本发明所述β-半乳糖苷酶GalA可迅速的将牛奶中乳糖降解为单糖(葡萄糖和半乳糖)。

序列表

<110> 青岛大学

山东青岛中西医结合医院（青岛市第五人民医院）（青岛市中西医结合研究所）

<120> 一种新型β-半乳糖苷酶GalA及其应用

<141> 2020-04-22

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 669

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Ile Asn Glu Lys Leu Pro Lys Ile Trp Arg Phe Glu Asp Asp Gly

1 5 10 15

Leu Lys Pro Asp Asp Glu Val Trp Asp Glu Ile Arg Met Phe Lys Leu

20 25 30

Asp Gly Ile Asp Val Asp Thr Leu Asn Val Phe Ser Trp Asp Leu Asn

35 40 45

Gln Pro Asp Glu Glu Thr Tyr Asp Phe Thr Trp Leu Asp Glu Gln Ile

50 55 60

Asp Arg Leu Tyr Glu Asn Gly Ile Tyr Thr Cys Leu Asp Thr Ser Thr

65 70 75 80

Asp Asp His Pro Asp Trp Met Asp Lys Lys Tyr Pro Asp Val Leu Arg

85 90 95

Val Asp Tyr Gln Gly Arg Lys Arg Asp Phe Gly Gly Arg His Asn Ser

100 105 110

Cys Pro Asn Ser Thr Arg Ser Tyr Lys Tyr Asp Glu Arg Met Asp Asp

115 120 125

Arg Leu Gly Glu Arg Tyr Lys Asp His Pro Gly Val Leu Ile Trp His

130 135 140

Val Ser Asn Met Tyr Gly Gly Tyr Cys Tyr Cys Asp Asn Cys Asp Asp

145 150 155 160

Ser Phe Arg Lys Trp Leu Gln Gln Lys Tyr Gly Thr Leu Gln Asn Val

165 170 175

Asn Lys Asp Trp Asn Thr Arg Phe Trp Gly His Thr Phe Tyr Asp Trp

180 185 190

Asp Glu Ile Val Pro Pro Asn Val Leu Ser Glu Glu Trp Glu Gly Asp

195 200 205

Ser Thr Asn Phe Gln Gly Ile Ser Leu Asp Tyr Arg Ile Phe Gln Ser

210 215 220

Asp Ser Leu Leu Glu Cys Phe Lys Leu Glu Arg Asp Asp Leu Lys Lys

225 230 235 240

His Thr Pro Asn Leu Pro Glu Thr Thr Asn Leu Met Gly Thr Tyr Lys

245 250 255

Glu Leu Asp Tyr Phe Lys Trp Gly Lys Glu Met His Val Val Ser Trp

260 265 270

Asp Asn Tyr Pro Asp Tyr Asp Thr Pro Val Ser Phe Thr Asp Met Asp

275 280 285

His Asp Leu Met Thr Ala Leu Lys Ser Gly Gln Pro Phe Met Leu Met

290 295 300

Glu Gln Thr Pro Ser Gln Gln Asn Trp Gln Pro Tyr Asn Ser Leu Lys

305 310 315 320

Arg Pro Gly Val Met Arg Leu Trp Ser Tyr Gln Asp Val Asp Arg Gly

325 330 335

Asp Glu Thr Val Met Phe Phe Gln Leu Arg Arg Ser Val Gly Asp Cys

340 345 350

Glu Lys Tyr His Gly Asp Val Ile Glu His Val Gly His Glu Asn Thr

355 360 365

Arg Val Phe Arg Glu Thr Asp Asp Leu Gly Lys Glu Leu Gly Asn Leu

370 375 380

Ser Asp Asp Leu Leu Asp Asp Arg Val Gln Asp Lys Val Asp Ile Val

385 390 395 400

Phe Asp Trp Glu Asn Arg Trp Asp Thr Glu Leu Ser Ser Gly Pro Ser

405 410 415

Lys Asp Leu Asp Tyr Val Lys Glu Val His Asn Tyr Tyr Asp Asp Leu

420 425 430

Phe Asp Glu Asn Ile Pro Val Asp Met Ile Gly Val Asp Glu Asp Leu

435 440 445

Ser Lys Tyr Glu Ile Val Ile Asp Pro Val Leu Tyr Met Val Lys Ser

450 455 460

Gly Tyr Asp Asp Arg Val Lys Glu Phe Val Gln Asn Gly Gly Thr Phe

465 470 475 480

Val Thr Thr Phe Phe Ser Gly Ile Val Asn Glu His Asp Leu Val Thr

485 490 495

Leu Gly Gly Tyr Pro Gly Glu Leu Arg Asp Leu Leu Gly Ile Trp Val

500 505 510

Glu Glu Ile Asp Asp Leu Pro Pro Glu Val Lys Asn Gln Ile Val Ile

515 520 525

Thr Asn Asp Thr Gly Arg Leu Thr Gly Thr Tyr Glu Cys Arg Leu Leu

530 535 540

Phe Asp Ile Ile His Ser Glu Gly Asp Asp Val Leu Asp Glu Tyr Gly

545 550 555 560

Ser Ala Phe Tyr Phe Gly Thr Pro Val Ile Thr Arg His Thr Tyr Gly

565 570 575

Lys Gly Lys Thr Tyr Tyr Val Gly Thr Cys Pro Asp Gln Asp Phe Leu

580 585 590

Thr Arg Phe Met Lys Thr Val Cys Ala Glu Lys Glu Ile Asp Pro Leu

595 600 605

Leu Asn Val Pro Lys Gly Val Glu Val Thr Glu Arg Arg Lys Arg Gly

610 615 620

Glu Ser Tyr Phe Phe Ile Met Asn His Asn Asp Ser Thr Val Glu Leu

625 630 635 640

Glu Ile Gly Glu Gly Thr His Leu Leu Thr Gly Lys Glu Leu Thr Gly

645 650 655

Asp Thr Ser Leu Glu Asp Tyr Arg Gly Glu Gly Thr Ala

660 665

<210> 2

<211> 2007

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atgatcaacg aaaaactgcc gaaaatctgg cgtttcgaag acgacggtct gaaaccggac 60

gacgaagttt gggacgaaat ccgtatgttc aaactggacg gtatcgacgt tgacaccctg 120

aacgttttct cttgggacct gaaccagccg gacgaagaaa cctacgactt cacctggctg 180

gacgaacaga tcgaccgtct gtacgaaaac ggtatctaca cctgcctgga cacctctacc 240

gacgaccacc cggactggat ggacaaaaaa tacccggacg ttctgcgtgt tgactaccag 300

ggtcgtaaac gtgacttcgg tggtcgtcac aactcttgcc cgaactctac ccgttcttac 360

aaatacgacg aacgtatgga cgaccgtctg ggtgaacgtt acaaagacca cccgggtgtt 420

ctgatctggc acgtttctaa catgtacggt ggttactgct actgcgacaa ctgcgacgac 480

tctttccgta aatggctgca gcagaaatac ggtaccctgc agaacgttaa caaagactgg 540

aacacccgtt tctggggtca caccttctac gactgggacg aaatcgttcc gccgaacgtt 600

ctgtctgaag aatgggaagg tgactctacc aacttccagg gtatctctct ggactaccgt 660

atcttccagt ctgactctct gctggaatgc ttcaaactgg aacgtgacga cctgaaaaaa 720

cacaccccga acctgccgga aaccaccaac ctgatgggta cctacaaaga actggactac 780

ttcaaatggg gtaaagaaat gcacgttgtt tcttgggaca actacccgga ctacgacacc 840

ccggtttctt tcaccgacat ggaccacgac ctgatgaccg ctctgaaatc tggtcagccg 900

ttcatgctga tggaacagac cccgtctcag cagaactggc agccgtacaa ctctctgaaa 960

cgtccgggtg ttatgcgtct gtggtcttac caggacgttg accgtggtga cgaaaccgtt 1020

atgttcttcc agctgcgtcg ttctgttggt gactgcgaaa aataccacgg tgacgttatc 1080

gaacacgttg gtcacgaaaa cacccgtgtt ttccgtgaaa ccgacgacct gggtaaagaa 1140

ctgggtaacc tgtctgacga cctgctggac gaccgtgttc aggacaaagt tgacatcgtt 1200

ttcgactggg aaaaccgttg ggacaccgaa ctgtcttctg gtccgtctaa agacctggac 1260

tacgttaaag aagttcacaa ctactacgac gacctgttcg acgaaaacat cccggttgac 1320

atgatcggtg ttgacgaaga cctgtctaaa tacgaaatcg ttatcgaccc ggttctgtac 1380

atggttaaat ctggttacga cgaccgtgtt aaagaattcg ttcagaacgg tggtaccttc 1440

gttaccacct tcttctctgg tatcgttaac gaacacgacc tggttaccct gggtggttac 1500

ccgggtgaac tgcgtgacct gctgggtatc tgggttgaag aaatcgacga cctgccgccg 1560

gaagttaaaa accagatcgt tatcaccaac gacaccggtc gtctgaccgg tacctacgaa 1620

tgccgtctgc tgttcgacat catccactct gaaggtgacg acgttctgga cgaatacggt 1680

tctgctttct acttcggtac cccggttatc acccgtcaca cctacggtaa aggtaaaacc 1740

tactacgttg gtacctgccc ggaccaggac ttcctgaccc gtttcatgaa aaccgtttgc 1800

gctgaaaaag aaatcgaccc gctgctgaac gttccgaaag gtgttgaagt taccgaacgt 1860

cgtaaacgtg gtgaatctta cttcttcatc atgaaccaca acgactctac cgttgaactg 1920

gaaatcggtg aaggtaccca cctgctgacc ggtaaagaac tgaccggtga cacctctctg 1980

gaagactacc gtggtgaagg taccgct 2007

<210> 3

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

catgccatgg atgatcaacg aaaaactgcc 30

<210> 4

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ccgctcgaga gcggtacctt caccacggt 29