一种β-半乳糖苷酶GalNC3-89及其制备方法和应用
阅读说明：本技术 一种β-半乳糖苷酶GalNC3-89及其制备方法和应用 (Beta-galactosidase GalNC3-89 and preparation method and application thereof ) 是由 许波 范琴 黄遵锡 唐湘华 于 2021-08-05 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种β-半乳糖苷酶GalNC3-89及其制备方法和应用,该β-半乳糖苷酶GalNC3-89氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示,共827个氨基酸,理论分子量为91.50kDa,编码基因如SEQ ID NO.2所示。所述β-半乳糖苷酶GalNC3-89好的耐盐特性、温度稳定性及pH稳定性,高效转糖基活性和高效水解乳糖活性,在食品加工、生产生物乙醇和制备工业乳制品中具有较好的应用潜力。(The invention discloses a beta-galactosidase GalNC3-89, a preparation method and an application thereof, wherein the amino acid sequence of the beta-galactosidase GalNC3-89 is shown as SEQ ID NO.1, and the amino acid sequence totally 827 amino acids have the theoretical molecular weight of 91.50kDa, and the coding gene is shown as SEQ ID NO. 2. The beta-galactosidase GalNC3-89 has good salt tolerance, temperature stability, pH stability, high-efficiency transglycosylation activity and high-efficiency lactose hydrolysis activity, and has good application potential in food processing, bioethanol production and industrial dairy product preparation.)
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种β-半乳糖苷酶GalNC3-89及其制备方法和应用。
背景技术
β-半乳糖苷酶(EC3.2.1.23)能够催化乳糖水解生成半乳糖和葡萄糖；其次该酶具有将乳糖催化形成低聚半乳糖的转糖基活性。乳糖是一种二糖，在哺乳动物的乳汁中含量丰富，对新生儿的营养至关重要；可被肠道中的乳糖酶水解成可吸收的葡萄糖和半乳糖。耐盐β-半乳糖苷酶在高盐浓度中具有较高的酶活，在高盐工艺的食品工业中消化植物多糖。此外，还可合成低聚半乳糖(GOS)及作为报告基因。GOS由β-半乳糖苷酶通过乳糖水解过程中的转糖基化活性产生的，为食品中不可消化的益生元的成分，对人体健康至关重要，且酶法制备GOS具有简单、高效、量大、副反应较少等优势。
目前主要采取β-半乳糖苷酶水解乳糖的方法制备GOS。GOS具有促进益生菌增殖预防和治疗便秘等功能；其次，在食品工业中用作发酵乳产品、面包和饮料等低热量甜味剂；在婴幼儿配方奶粉、烘焙食品和宠物食品等诸多领域有着广泛的应用。此外，可解决乳糖不耐的问题。此外，在酸性条件下可于室温下长时间保存并应用于各种产品而不会分解，故其在乳清和牛奶加工市场应用前景非常广阔。因此开发多功能的β-半乳糖苷酶具有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种β-半乳糖苷酶GalNC3-89及其制备方法和应用，同时还提供了该水解酶的构建方法，本发明β-半乳糖苷酶GalNC3-89具有良好的耐盐特性、温度稳定性及pH稳定性，高效转糖基活性和高效水解乳糖活性。
为了实现上述技术目的，本发明具体采用以下技术方案：
一种β-半乳糖苷酶GalNC3-89，所述β-半乳糖苷酶GalNC3-89来源于动物粪便宏基因组，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，共827个氨基酸，理论分子量为91.50kDa。
所述β-半乳糖苷酶最适作用pH为6.5，在pH 5.0至pH 9.0下处理1h，其剩余酶活均在70％以上；最适作用温度为40℃，在37℃、40℃下分别处理1h，酶活性均在90％以上；该酶具有较好的NaCl稳定性，在0.5-2.0mol/L NaCl下均保持100％以上酶活性；即使在2.5-5.0mol/L NaCl下的酶活性也能维持在55％-99％。
在本发明的另一方面，提供了所述β-半乳糖苷酶GalNC3-89的编码基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，基因大小为2484bp。
在本发明的另一方面，提供了包含所述β-半乳糖苷酶GalNC3-89编码基因的重组表达载体，所述重组表达载体为pEASY-E2/GalNC3-89。
在本发明的另一方面，提供了包含所述β-半乳糖苷酶GalNC3-89编码基因重组菌株，所述菌株包括但不限于大肠杆菌、酵母菌、芽孢杆菌或乳酸杆菌，优选为重组菌株BL21(DE3)/GalNC3-89。
本发明通过PCR的方法克隆到β-半乳糖苷酶GalNC3-89编码基因，将该编码基因与质粒pEASY-E2连接得到重组表达载体，然后转化大肠杆菌BL21(DE3)获得重组菌。
在本发明的另一方面，提供了所述β-半乳糖苷酶GalNC3-89的制备方法，包括以下步骤：
1)以西黑冠长臂猿粪便微生物宏基因组DNA为模板，设计引物F和R进行PCR扩增，得到β-半乳糖苷酶基因；
2)将β-半乳糖苷酶基因与表达载体重组后转化到宿主细胞，得到重组菌株，培养重组菌株并诱导重组β-半乳糖苷酶表达；
3)回收并纯化所表达的β-半乳糖苷酶，得到β-半乳糖苷酶GalNC3-89。
所述引物F和R核苷酸序列如SEQ ID NO.3～4所示。
在本发明的另一方面，提供了所述β-半乳糖苷酶GalNC3-89在食品加工、生产生物乙醇和制备工业乳制品中的应用。
在食品加工过程中，本发明β-半乳糖苷酶GalNC3-89可用于高盐工艺来消化植物多糖、合成低聚半乳糖(GOS)及作为报告基因；在化工工艺中，可利用水解乳糖后的单糖来生产生物乙醇；在工业乳制品中，解决生产过程中产生的过多乳清带来环境污染的问题；此外，在乳制品行业中，用来生产低乳糖牛奶。
本发明的有益效果为：
本发明所述β-半乳糖苷酶最适作用pH为6.5，在pH 5.0至pH 9.0下处理1h，其剩余酶活均在70％以上；最适作用温度为40℃，在37℃、40℃下分别处理1h，酶活性均在90％以上；该酶具有较好的NaCl稳定性，在0.5-2.0mol/L NaCl下均保持100％以上酶活性；即使在2.5-5.0mol/L NaCl下的酶活性也能维持在55％-99％。该酶的Km、和Vmax分别为1.935mmol/L和0.8948mmol/min；Na+、Fe3+、Pb2+、Tween80和TritonX-100对GalNC3-89有激活作用，分别将酶活性提高10％、14％、28％、31％和9％；其余金属离子和化学试剂均不同程度抑制其活性。以上性质表明，本发明制备的β-半乳糖苷酶在食品工业、合成低聚半乳糖(GOS)及作为报告基因等具有较好的应用潜力。其次，该β-半乳糖苷酶可有效地利用水解乳糖后的单糖生产生物乙醇，解决工业乳制品生产过程中产生的过多乳清带来环境污染的问题；此外，在乳制品行业中可用来生产低乳糖牛奶具有较好的应用前景。
附图说明
图1是本发明实施例提供的在大肠杆菌中表达的重组β-半乳糖苷酶GalNC3-89的SDS-PAGE分析，其中，M：低分子量蛋白质Marker；1：仅含有pEASY-E2载体的大肠杆菌诱导后的粗酶；2：未纯化的重组β-半乳糖苷酶；3：纯化的重组β-半乳糖苷酶；
图2是本发明实施例提供的重组β-半乳糖苷酶的最适pH；
图3是本发明实施例提供的重组β-半乳糖苷酶的pH稳定性；
图4是本发明实施例提供的重组β-半乳糖苷酶的最适温度；
图5是本发明实施例提供的重组β-半乳糖苷酶的温度稳定性；
图6是本发明实施例提供的重组β-半乳糖苷酶NaCl的影响。
图7是本发明实施例提供的重组β-半乳糖苷酶NaCl的稳定性；
图8是本发明实施例β-半乳糖苷酶合成低聚半乳糖的UPLC分析，其中，A为GOS标准品，B为GalNC3-89的转糖苷产物GOS；
图9是本发明实施例β-半乳糖苷酶水解乳糖的UPLC分析，其中，A为葡萄糖标准品，B为GalNC3-89的水解产物。
具体实施方式
下面将结合本发明具体的实施例，对本发明技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而费全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
试验材料和试剂
1、菌株及载体：菌株Escherichia coli BL21(DE3)购于擎科生物科技有限公司，E.coli表达载体pEASY-E2购于北京全式金生物技术有限公司。
2、基因工程操作酶类、试剂盒及其它生化试剂：限制性内切酶、DNA聚合酶、连接酶和dNTP购自TaKaRa公司，DNA纯化试剂盒为OMEGA BIO-TEK公司公司；其它均为国产试剂(均可从普通生化试剂公司购买得到)。
3、LB培养基：Peptone 10g，Yeast extract 5g，NaCl 10g，加蒸馏水至1000mL，pH自然(约为7)。固体培养基在以上基础上加2.0％(w/v)琼脂。
说明：以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。
实施例1β-半乳糖苷酶基因GalNC3-89的获得
以GalNC3-89 DNA F：5’-taagaaggagatatacatatggaattggcccggacggaattcaaactg-3’和GalNC3-89 DNA R：5’-gtggtggtggtggtgctcgagtttcacggaaatttccaac-3’为上下游引物，用所述西黑冠长臂猿粪便微生物宏基因组DNA为模板进行PCR扩增。PCR反应参数为：98℃变性30s,55℃退火15s，72℃延伸90s，30个循环。PCR结果得到目的基因GalNC3-89。
实施例2β-半乳糖苷酶GalNC3-89的制备
将实施例1制备的β-半乳糖苷酶基因GalNC3-89与质粒pEASY-E2连接得到重组表达载体pEASY-E2/GalNC3-89，转化大E.coli BL 21(DE3)获得重组大肠杆菌菌株BL21(DE3)/GalNC3-89。取含有重组表达载体pEASY-E2/GalNC3-89的大肠杆菌菌株BL21(DE3)/GalNC 3-89，按0.1％V/V)的量接种于LB(含100μg/mL Amp)培养液中，37℃、180rpm培养12-16h。然后将活化的菌液以1％(V/V)量接种到新鲜的LB(含100μg/mL Amp)培养液中，37℃、180rpm37℃、180r/min摇床培养约4-5h(OD600＝0.6-0.8)后，加入终浓度为0.7mmol/L的IPTG于20℃、180r/min摇床下培养16h以诱导重组蛋白产生后。4℃、5000r/min离心10min收集菌体。用适量无菌水悬浮菌体后，高压破碎细胞(35KPSI)。上述破碎细胞液经4℃、12000r/min冷冻离心10min后，取上清并用Nickel-NTA Agarose纯化目的蛋白，得到耐盐β-半乳糖苷酶GalNC3-89。
对所述纯化蛋白GalNC3-89进行SDS-PAGE分析，结果参见图1，图1是本发明实施例提供的在大肠杆菌中表达的重组β-半乳糖苷酶的SDS-PAGE分析，其中，M：低分子量蛋白质Marker；1：仅含有pE ASY-E2载体的大肠杆菌诱导后的粗酶；2：未纯化的重组β-半乳糖苷酶；3：纯化的重组β-半乳糖苷酶。由图1可知，重组β-半乳糖苷酶在大肠杆菌中得到了表达，经Nickel-NTA Agarose纯化后为单一条带。
实施例3β-半乳糖苷酶GalNC3-89的性质测定
酶活性测定方法参照张文洪(张文洪，2019)：以对硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷(pNPGal)测定重组β-半乳糖苷酶酶活性。将对硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷(pNPGal)溶解于pH6.5缓冲液中，配制成终浓度为2mmol/L的底物溶液。取450μL pNPGal溶液，37℃下预热5min，加入50μL稀释适当倍数的酶液，准确反应10min后，立即加入1mL 1mol/L的Na2CO3终止反应并显色。取200μL上述反应液加到96孔板中，用酶标仪测定反应液的OD420，并以加入50μL已失活的酶液作为空白对照。酶活单位定义：一个酶活单位(U)即在酶的最适反应条件下，每分钟水解pNPGal释放1μmol pNP所需的酶量。
1)β-半乳糖苷酶GalNC3-89的最适pH和pH稳定性的测定
酶的最适pH测定：将实施例2纯化的β-半乳糖苷酶GalNC3-89在37℃下测定pH3.0-12.0(pH3.0-7.0：0.1mol/L柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液；pH8.0-12.0：0.2mol/L甘氨酸-氢氧化钠缓冲液)缓冲液中的酶活力。
酶的pH稳定性测定：将酶于37℃下在不同pH 3.0-12.0缓冲溶液中保温1h。按照酶活测定方法，在最适反应条件下测定残余的酶活力。以最高活力作为100％，计算各个pH值下该酶的相对活力。
结果参见图2和图3，图2为本发明实施例提供的耐盐β-半乳糖苷酶最适pH，图3为本发明实施例提供的β-半乳糖苷酶的pH稳定性。由图2和图3可知，本发明提供的β-半乳糖苷酶的最适pH为6.5；在pH 5.0、pH 9.0下分别处理1h，其剩余酶活均在70％以上。
2)β-半乳糖苷酶的最适温度及温度稳定性测定
酶的最适温度测定：在pH6.5下，测定不同温度(0-60℃)条件下的β-半乳糖苷酶活力，并以最高活力100％计算各个温度下该酶的相对活力。
酶的温度稳定性测定：在pH6.5条件下，测定37℃和40℃下放置1h，每隔10分钟在pH6.5及40℃下进行酶促反应，以未处理的酶液作为对照。
结果参见图4、图5。图4是本发明实施例提供的β-半乳糖苷酶的最适温度，图5是本发明实施例提供的β-半乳糖苷酶的温度稳定性。结果表明：耐盐β-半乳糖苷酶的最适温度为40℃，在37℃、40℃条件下保持稳定。
3)NaCl对β-半乳糖苷酶的影响及NaCl耐受性测定
酶的NaCl影响测定：在40℃、pH 6.5，0.5-5mol/L NaCl条件下进行酶促反应。
酶的NaCl稳定性测定：在酶的最适作用条件下及标准酶反应体系中加入不同浓度的NaCl，使其终浓度为0.5-5mol/L，于40℃下恒温水浴1h后，于40℃、pH 6.5条件下测定其剩余酶活力。以未处理的酶液作为对照。
结果参见图6、图7。图6是本发明实施例提供的β-半乳糖苷酶的NaCl影响，图7是本发明实施例提供的耐盐β-半乳糖苷酶的NaCl耐受。结果表明：当反应体系中含有3.5mol/LNaCl时酶活性达到半衰期。在40℃、0.5-5.0mol/L NaCl下分别保温1h后，GalNC3-89在0.5mol/L NaCl下保留117％酶活性；1.0-2.0mol/L NaCl下均保持100％以上活性；在2.5-5.0mol/L NaCl下维持在55％-99％。
4)重组β-半乳糖苷酶的动力学参数测定
动力学参数在pH 6.5、温度40℃和一级反应时间下以不同浓度的pNPGal为底物(0.1-0.9mmol/L)进行测定，根据Lineweaver-Burk法计算出Km和Vmax值。经测定，在40℃、pH 6.5条件下该酶的Km和Vmax分别为1.935mmol/L和0.8948mmol/min。
5)不同金属离子及化学试剂对重组β-半乳糖苷酶活力影响测定
将各种金属离子(Na+、K+、Fe2+、Fe3+、Cu2+、Ag+、Ca2+、Zn2+、Co2+、Mn2+、Ni2+、Al3+、Li+、Mg2+、Sn2+、Pb2+、Hg2+)和化学试剂(SDS、EDTA、盐酸胍、Tween80、Triton X100、DTT、丙三醇、乙酸、乙醇、甲醇、PEG4000、乙酸乙酯、尿素、β-巯基乙醇)加入到酶促反应体系中，使其终浓度分别为10mmol/L、1％(V/V)，在酶最适作用条件下测定β-半乳糖苷酶活力。以不加金属离子和化学试剂的酶活力为参照，结果参见表1。
表1化学试剂对重组β-半乳糖苷酶的活力影响
由表1可知，Na+、Fe3+、Pb2+、Tween80和Triton X-100对Gal NC3-89有激活作用，分别将酶活性提高10％、14％、28％、31％和9％；其余金属离子和化学试剂均不同程度抑制其活性。
6)重组β-半乳糖苷酶转糖基活性的UPLC测定
将重组β-半乳糖苷酶添加到25％(W/V)乳糖溶液中，于37℃、pH6.5反应条件下反应24h，立即煮沸5min终止反应，后于12000r/min离心10min，取上清进行UPLC分析。
结果参见图8，重组β-半乳糖苷酶能在24h时将乳糖全部转化为GOS。
7)重组β-半乳糖苷酶水解乳糖产物的UPLC测定
将重组β-半乳糖苷酶添加到5％(W/V)乳糖溶液中，于37℃、pH 6.5反应条件下反应12h，立即煮沸5min终止反应，后于12000r/min离心10min，取上清进行UPLC分析。
结果参见图9，重组β-半乳糖苷酶能在12h时将乳糖全部水解为葡萄糖。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
序列表
<110> 云南师范大学
<120> 一种β-半乳糖苷酶GalNC3-89及其制备方法和应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 827
<212> PRT
<213> β-半乳糖苷酶(GalNC3-89)
<400> 1
Met Lys Arg Leu Ser Phe Thr Ala Thr Leu Leu Leu Thr Ala Phe Ser
1 5 10 15
Ala Phe Ala Ala Arg Thr Glu Phe Lys Leu Glu Lys Gly Trp Arg Phe
20 25 30
Thr Arg Glu Asp His Ala Glu Ala Val Arg Pro Asp Phe Asp Asp Ser
35 40 45
Ala Trp Gln Arg Val Thr Val Pro His Asp Trp Ala Ile Tyr Gly Pro
50 55 60
Phe Asp Ile Gly Asn Asp Pro Gln Phe Val Ala Ile Glu Gln Asp Gly
65 70 75 80
Glu Thr Val Pro Ser Leu Lys Ala Gly Arg Thr Gly Gly Leu Pro Val
85 90 95
Val Gly Pro Gly Trp Tyr Arg Ile Arg Phe Asp Val Pro Asp Phe Ala
100 105 110
Ala Gly Lys Arg Ala Asp Ile Leu Phe Asp Gly Ala Met Ser Asn Ala
115 120 125
Arg Val Tyr Leu Asn Gly Glu Glu Ile Gly Tyr Trp Pro Tyr Gly Tyr
130 135 140
Gly Ser Phe Gln Leu Asp Ala Thr Arg Leu Leu Lys Pro Glu Gly Asn
145 150 155 160
Val Leu Ala Val Arg Leu Glu Asn Tyr Pro Glu Ser Ser Arg Trp Tyr
165 170 175
Pro Gly Ala Gly Leu Tyr Arg Asn Val His Val Ile Val Ser Asp Glu
180 185 190
Ile Arg Ile Pro Leu Trp Gly Ile Arg Leu Thr Thr Pro Glu Ile Arg
195 200 205
Pro Asp His Ala Lys Val Arg Leu Gln Ala Asp Val Glu Ser Pro Ala
210 215 220
Gly Thr Asp Ser Arg Leu Val Leu Lys Thr Leu Leu Arg Asp Ala Gly
225 230 235 240
Gly Arg Val Val Ala Lys Ala Glu Thr Thr Leu Ala Glu Tyr Asp Ala
245 250 255
Gly Thr Phe Cys Gln Asp Leu Val Ile Asp Ala Pro Arg Leu Trp Ser
260 265 270
Pro Asp Thr Pro Asp Leu Tyr Glu Ala Glu Leu Arg Leu Tyr Ala Asp
275 280 285
Gly Glu Leu Arg Asp Thr Arg Ser Val Pro Phe Gly Val Arg Glu Leu
290 295 300
Lys Ile Val Pro Asp Arg Gly Met Phe Leu Asn Gly Glu Pro Ile Lys
305 310 315 320
Phe Arg Gly Val Cys Leu His His Asp Leu Gly Pro Leu Gly Ala Ala
325 330 335
Val Asn Val Ser Ala Leu Arg Arg Gln Leu Ser Ile Leu Lys Glu Met
340 345 350
Gly Ala Asn Ala Val Arg Thr Ala His Asn Ile Pro Ala Pro Glu Leu
355 360 365
Val Glu Leu Cys Asp Arg Met Gly Leu Met Val Met Val Glu Thr Phe
370 375 380
Asp Glu Trp Arg Thr Pro Lys Met Lys Asn Gly Tyr His Leu Tyr Phe
385 390 395 400
Asp Glu Trp Ala Glu Arg Asp Leu Val Asn Thr Val Arg Arg Phe Arg
405 410 415
Asn His Pro Ser Val Val Met Trp Cys Ile Gly Asn Glu Val Pro Asp
420 425 430
Gln Ser Ser Tyr Glu Gly Ala Lys Ile Ala Arg Trp Leu Gln Asp Ile
435 440 445
Cys His Arg Glu Asp Pro Thr Arg Leu Val Thr Met Gly Ile Asp Arg
450 455 460
Val Gln Asp Ala Ile Asp Thr His Phe Ala Ala Val Met Asp Val Val
465 470 475 480
Gly Phe Asn Tyr Arg Thr His Leu Tyr Thr Lys Ala Tyr His Glu Leu
485 490 495
Pro Gln Gln Ile Met Met Gly Ser Glu Thr Ala Ser Thr Phe Ser Ser
500 505 510
Arg Gly Thr Tyr His Phe Pro Val Glu Arg Thr Val Asn Lys Val Arg
515 520 525
Pro Asp Asn Gln Ser Ser Gly Tyr Asp Leu Asp Cys Gly Ser Trp Ser
530 535 540
Asn Leu Pro Glu Asp Asp Phe Val Leu His Asp Asp Tyr Asp Trp Cys
545 550 555 560
Ile Gly Glu Phe Val Trp Thr Gly Phe Asp Tyr Leu Gly Glu Pro Thr
565 570 575
Pro Tyr His Glu Ile Trp Pro Asn His Ser Ser Leu Phe Gly Ile Val
580 585 590
Asp Leu Ala Gly Leu Pro Lys Asp Arg Tyr Tyr Leu Tyr Arg Ser His
595 600 605
Trp Arg Pro Glu Glu Glu Thr Leu His Val Leu Pro His Trp Thr Trp
610 615 620
Pro Gly Arg Glu Gly Glu Val Thr Pro Val Phe Val Tyr Thr Asn Tyr
625 630 635 640
Pro Ser Ala Glu Leu Phe Val Asn Gly Arg Ser Gln Gly Arg Ile Ala
645 650 655
Lys Asp Thr Thr Met Thr Gln Ala Ala Thr Asp Ser Glu Glu Ala Ala
660 665 670
Arg Gly Leu Trp Arg Gln Arg Arg Tyr Arg Leu Met Trp Met Asp Val
675 680 685
Lys Tyr Glu Pro Gly Thr Leu Arg Val Val Ala Tyr Asp Arg Asn Gly
690 695 700
Arg Pro Ala Ala Glu Thr Glu Val His Thr Ala Gly Glu Pro Cys Arg
705 710 715 720
Leu Glu Leu Ser Ala Asp Arg Gln Thr Leu Arg Ala Asp Gly Lys Asp
725 730 735
Leu Ser Phe Val Thr Val Arg Val Val Asp Arg Ala Gly Asn Leu Cys
740 745 750
Pro Asp Ala Ala Pro Glu Val Ser Phe Arg Val Thr Gly Ala Gly Gly
755 760 765
Phe Arg Ala Ala Ala Asn Gly Asp Pro Thr Cys Leu Glu Pro Phe His
770 775 780
His Pro Arg Met Lys Ala Phe Lys Gly Gln Leu Val Ala Ile Val Arg
785 790 795 800
Ser Gly Glu Arg Pro Gly Lys Ile Gly Phe Glu Ala Ser Ala Glu Gly
805 810 815
Leu Arg Lys Ala Arg Leu Glu Ile Ser Val Lys
820 825
<210> 2
<211> 2484
<212> DNA
<213> β-半乳糖苷酶编码基因(GalNC3-89)
<400> 2
atgaaacgat tatcttttac cgcgactctc ttattgaccg ctttttccgc attcgccgcc 60
cggacggaat tcaaactgga aaagggctgg cgatttaccc gcgaagatca tgcggaggcc 120
gttcgtccgg atttcgacga ttcggcctgg cagcgcgtga cggttccgca cgactgggcg 180
atttacgggc ctttcgacat cggcaacgac cctcagttcg tggccatcga gcaggacggc 240
gagaccgttc cgtcgctcaa agccggacgt accgggggac tgcccgtcgt cgggcccggt 300
tggtacagga ttcgtttcga cgtgccggat tttgccgccg ggaaacgggc cgatattctt 360
ttcgacggag ccatgagcaa tgcccgggtc tatctcaacg gagaggagat cggttactgg 420
ccctatggct acggcagttt ccagctggat gcgacccggc tgctgaagcc ggagggcaac 480
gtgctggccg tgcggttgga gaactatccc gaatcctccc ggtggtatcc gggggccgga 540
ttgtaccgga acgtgcatgt gatcgtttcg gatgaaattc gtatcccgct gtggggcatt 600
cgtctcacga cgcccgagat ccgtccggac catgcgaagg tgcggttgca ggcggatgtc 660
gaatcgccgg cggggaccga ttcacggctg gtgttgaaaa cgcttcttcg ggatgccgga 720
ggacgggtcg ttgcgaaggc tgaaacgacg cttgccgaat acgacgccgg gaccttctgt 780
caggatctgg tgatcgatgc cccgcggctt tggtcgcccg atacgcccga cctgtatgaa 840
gcggagctcc ggctatatgc cgacggggag cttcgggata cccgttcggt gccgttcggt 900
gtccgggagc tgaaaatcgt tcccgaccga gggatgttcc tcaacggcga accgatcaag 960
ttcaggggtg tttgcctgca tcacgatctc gggccgctgg gcgcggcggt caacgtcagt 1020
gcgctgcgcc ggcagttgtc gatcctcaag gagatggggg ccaatgccgt ccgcacggcg 1080
cataatatcc ccgctccgga gctggtcgaa ctgtgcgacc ggatggggct gatggtgatg 1140
gtggagacct tcgacgagtg gcgcaccccc aagatgaaga acggttatca cctctatttc 1200
gacgaatggg ccgagcgcga tctggtcaat acggtccggc gtttccgcaa tcatccgtcg 1260
gtggtgatgt ggtgcatcgg caacgaggtt cccgaccaaa gcagttacga aggggcgaag 1320
atcgcccggt ggttgcagga tatctgtcat cgggaggacc cgacgcgcct cgttaccatg 1380
gggatcgacc gggtgcagga tgctatcgac acccatttcg cggccgtcat ggacgtggtg 1440
ggcttcaact accgcaccca tctctatacg aaggcgtatc acgagctgcc ccagcagatt 1500
atgatggggt ccgagaccgc ttccacgttc agttcgcggg ggacctatca tttcccggtg 1560
gaacgcaccg tgaacaaggt ccgtccggat aaccagtcgt cgggctacga cctggactgc 1620
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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