具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

下文的公开提供了许多不同的实施例或例子用来实现本发明的不同实施方式。为了简化本发明的公开，下文中对特定实施例或示例进行描述。当然，他们仅仅为示例，并且目的不在于限制本发明。此外，本发明提供的各种特定工艺和材料的例子，本领域普通技术人员可以意识到其他工艺的可应用性和/或其他材料的使用。除非另有说明，本发明的实施将采用本领域技术人员的能力范围之内的化学、分子生物学等领域的传统技术。另外，除非另有说明，在本文中，核酸以5′至3′的方向从左向右书写，氨基酸序列则以氨基端到羧基端的方向从左向右书写。

下面通过说明性的具体实施例对本发明进行描述，这些实施例并不以任何方式限制本发明的范围。特别说明的是：本发明所用到的试剂除特别说明外均有市售。

实施例1构建耐碱κ-卡拉胶酶突变体

突变酶重组表达载体的构建：

以携带野生型κ-卡拉胶酶编码基因(SEQ ID NO.1)的载体为模板进行定点突变，构建突变酶重组表达载体，引物按照突变试剂盒Mut ExpressⅡFast Mutagenesis Kit V2引物设计要求设计定点突变引物，突变引物如表1所示。

表1突变引物表

定点突变参照突变试剂盒Mut ExpressⅡFast Mutagenesis Kit V2的说明书进行操作。包括目标质粒扩增、扩增产物Dpn I消化、重组反应三个步骤；突变获得的突变酶E237R的编码基因如SEQ ID NO.2所示。

目标质粒扩增：

依次加入上述试剂后，混合均匀，然后进行PCR。PCR反应参数：95℃ 30s，95℃15s，62℃ 15s，72℃ 2min30 s，30次循环，72℃ 5min，4℃保存。

扩增产物DpnⅠ消化：

DpnⅠ 1μL

扩增产物 40～50μL

在PCR反应液中加入1uL Dpn I并混匀，37℃反应1h 30min。

重组环化反应：

使用移液枪轻轻吸打混匀，短暂离心将反应液收集至管底。置于37℃恒温反应30min后，降至4℃或立即置于冰上冷却。

重组产物转化表达宿主：

(1)在冰上解冻E.coli BL21感受态细胞。

(2)取10μL重组产物加入到100μL感受态细胞中，轻弹管壁混匀，冰上静置30min。

(3)42℃水浴热激45s后，立即置于冰上冷却2～3min。

(4)加入900μL LB液体培养基(不添加抗生素)，37℃摇菌1h(转速200rpm)。

(5)4℃，5000rpm离心5min，弃掉900μL上清。用剩余培养基将菌体重悬。

(6)菌体涂布于LB固体培养基平板(含50μg/mL卡那霉素)，37℃恒温箱中倒置培养12～16h。

耐碱突变酶阳性重组子的鉴定：

PCR体系：

依次加入上述试剂后，混合均匀，然后进行PCR。PCR反应参数：95℃ 3min，95℃15s，60℃ 15s，72℃ 45s，30次循环，72℃ 5min，4℃保存。使用1％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。PCR阳性的重组子进行DNA序列分析，确认突变酶的DNA序列。

κ-卡拉胶酶的诱导表达和纯化：

含有突变型或野生型κ-卡拉胶酶基因的基因工程菌菌液按照1％的接种量接种于50mL LB液体培养基(含50μg/mL卡那霉素)，37℃、180rpm培养12h，进行菌种的活化。将活化后的菌液按照1％的接种量转接到200mL LB液体培养基(含卡那霉素50μg/mL)中，37℃、180rpm培养至OD₆₀₀达到0.6～0.8。加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)至终浓度为0.5mmol/L，16℃低温诱导表达18～24h。将诱导表达的菌液于5000rpm、4℃下离心15min，去上清，菌体用15mL预冷的缓冲液(50mmol/L NaH₂PO₄，300mmol/L NaCl，15mmol/L咪唑，pH8.0)重悬。在冰浴条件下，进行超声破碎，将破碎后的裂解液4℃、10000rpm离心20min，获得上清，即为粗酶液。参照GE Healthcare Life Sciences公司的金属镍螯合琼脂糖凝胶6FF使用说明书，利用亲和层析对重组蛋白进行分离纯化。采用SDS-PAGE分析纯化后目标蛋白的分子量及纯度。

利用亲和层析得到野生型酶和突变酶的单一蛋白条带，SDS-PAGE分析如图1所示。突变酶的分子质量与野生型酶一致，大小约为48.8kDa。

实施例2耐碱κ-卡拉胶酶的部分酶学性质测定

将10μL酶液(实施例1获得的)与490μL含有0.5％(w/v)浓度的κ-卡拉胶溶液(以50mmol/L的Na₂HPO₄-NaH₂PO₄缓冲液，pH 8.0配制)分别在不同温度下(40、45、50、55、60℃)反应15min后，加500μL的DNS试剂，沸水浴10min后冷却至室温，测定520nm处吸光值。酶活力最高时的温度为最适反应温度，并以此温度下的酶活力为100％。

分别用50mmol/L的NaH₂PO₄-Na₂HPO₄缓冲液(pH 6.0、7.0、8.0)，Tris-HCl缓冲液(pH 8.0、9.0)和甘氨酸-NaOH缓冲液(pH 9.0、10.0、11.0)配制0.5％(w/v)浓度的κ-卡拉胶溶液。取490μL底物溶液，加入10μL酶液，在最适温度下反应15min后，加500μL的DNS试剂，沸水浴10min后冷却至室温，测定520nm处吸光值。酶活力最高时的pH为最适反应pH，并以此pH下的酶活力为100％。野生型和突变型κ-卡拉胶酶的最适反应温度和最适反应pH结果如表2所示。

表2κ-卡拉胶酶的最适反应温度和最适反应pH

将10μL酶液(实施例1获得，蛋白含量400ng)分别在90μL 50mmol/L的Gly-NaOH缓冲液(pH 8.0、9.0、10.0、11.0、12.0)下25℃处理30min后，立即置于冰上，加入400μL含有0.5％(w/v)浓度的卡拉胶底物溶液(pH 8.0)，测定酶的残余活力，研究酶在不同pH下的稳定性，以未经缓冲液处理的酶活力为100％。

将野生型和突变型酶分别在pH 8.0～12.0处理30min后，残余酶活力如图2所示。野生型酶在pH为11.0，处理30min后仅保留了19.9％的相对酶活力，而突变酶E237R保留了36.0％的相对酶活力。由此可见，与野生型酶相比，突变酶在碱性条件下的pH稳定性有一定的提高。耐碱性的κ-卡拉胶酶在碱性条件下水解κ-卡拉胶的工业生产中具有良好的应用前景。

实施例3κ-卡拉胶酶在碱性条件下降解κ-卡拉胶

用50mmol/L的甘氨酸-NaOH缓冲液(pH分别为8.0、9.0、10.0)制备0.5％(w/v)的κ-卡拉胶底物溶液。取490μL底物，加入10μL酶液(蛋白含量400ng)，在45℃下分别反应15、30、60、90、120min后，加500μL的DNS试剂，沸水浴10min冷却，测定520nm处吸光值。根据半乳糖标曲计算野生型及突变酶的还原糖生成量。

将野生型酶和突变酶分别与不同pH底物在45℃反应2h后，还原糖含量变化如图3所示。图A、B、C分别代表pH为8.0、9.0、10.0的κ-卡拉胶底物溶液。当卡拉胶底物溶液在pH为8.0时，野生型酶对κ-卡拉胶的降解率高于突变型；在pH为9.0时，突变酶水解κ-卡拉胶90min后，得到的还原糖含量为57μg/mL，明显高于野生型酶。在pH为10.0的情况下也是如此，表明突变酶在碱性环境下对κ-卡拉胶的降解能力高于野生型酶。

综上，根据本发明的实施例，采用定点突变技术将野生型酶进行定点突变，通过将其第237位氨基酸由Glu变为Arg，相较于野生型酶，该突变酶的耐碱性得到了一定的提高，在碱性条件下提高了对κ-卡拉胶的降解能力，这些优点使突变酶在碱性条件下水解κ-卡拉胶的工业生产中具有良好的应用前景。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不应理解为必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例进行接合和组合。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

SEQUENCE LISTING

<110> 集美大学

<120> 一种耐碱κ-卡拉胶酶及其应用

<130> 无

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1194

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atgaaaccta aaaatattgt gatattccct ctatcagcat taagtatgct tatattaaat 60

tcagcagctc aagcggctga tatacaacca cctattgcaa aaccaggcga aacatggatt 120

ttacaagcga agcgctcaga tgagtttgat ataaaagatg ctacaaagtg gaactttcaa 180

accgaaaact atggtgtatg gtcgtggaaa aatgaaaatg cgacagtatc aaacggaaaa 240

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cctgcgtttt ggatgtatag caccattgac cgttcattaa cgaaagaagg ggatgtccaa 480

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cctcagacaa accataacgg ataccatcta cctttcgatc ctcgaaatga ctttcacacc 660

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<210> 2

<211> 1194

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

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