阅读说明：本技术 萝卜硫素或其纳米粒在制备改善孕妇杂环胺摄入导致的胚胎神经系统发育不良药物中的应用 (Application of sulforaphane or nanoparticles thereof in preparation of drugs for improving embryonic nervous system dysplasia caused by intake of heterocyclic amine in pregnant women ) 是由 王广 杨雪松 张萍 穆斯塔法·辛迪 刘畅 程欣 于 2020-07-09 设计创作，主要内容包括：本发明公开了萝卜硫素或其纳米粒在制备改善孕妇杂环胺摄入导致的胚胎神经系统发育不良药物中的应用。本发明提供了一种萝卜硫素的新用途-胚胎发育保护用途,不仅扩大了萝卜硫素的应用范围,提高了其应用价值,还有助于进一步开发新的改善孕妇杂环胺摄入诱导的胚胎神经系统发育不良的纳米药物,具有良好的应用前景。(The invention discloses application of sulforaphane or nanoparticles thereof in preparing a medicine for improving embryonic nervous system dysplasia caused by intake of heterocyclic amine in pregnant women. The invention provides a new application of sulforaphane, namely an embryonic development protection application, which not only expands the application range of the sulforaphane and improves the application value of the sulforaphane, but also is beneficial to further developing a new nano-medicament for improving embryonic nervous system dysplasia induced by heterocyclic amine intake of pregnant women, and has good application prospect.)

萝卜硫素或其纳米粒在制备改善孕妇杂环胺摄入导致的胚胎 神经系统发育不良药物中的应用

技术领域

本发明属于医药技术领域，特别涉及萝卜硫素或其纳米粒在制备改善孕妇杂环胺摄入导致的胚胎神经系统发育不良药物中的应用。

背景技术

神经管发育为机体的中枢神经系统。亨氏节后移诱导形成脊索和神经板，神经板经过被诱导分化，向背侧弯曲折叠融合形成神经管。由于神经管发育异常导致的畸形，称为神经管畸形，是一种严重的畸形疾病，包括无脑畸形，脑膨出，露脑，颅脊柱裂等。神经管闭合缺陷(Neural tube defects，NTDs)为最常见的出生缺陷，约占全球出生比例的0.5‰-2‰(Sanna et al.,Nat Genet 2019)。随着神经管的闭合，在神经管的背侧，有一群特殊的细胞-神经嵴细胞，经过诱导(Specification)、上皮-间充质转化(Epithelial-to-mesenchymal transition，EMT)、迁移(Migration)和分化(Differentiation)等一系列过程，分化为周围神经系统、色素细胞、头面部大部分软骨和骨骼、内分泌细胞、部分心脏组织以及平滑肌和肌腱等。神经嵴发育异常与多种先天性疾病相关，包括先天性巨结肠、神经纤维瘤、病颅面部骨骼缺损等(Kalcheim,Genesis 2018；Prasad et al.,Genesis 2019)。

胚胎发育的3-8周为致畸敏感期，在此期间，胚胎的细胞移动组合，形成器官原基，对致畸因素最敏感。如致畸因素PhIP(2-氨基-1-甲基-6-苯基-咪唑[4,5-b]吡啶，食品中一种含量相对较高的杂环胺)可以影响神经细胞发育，从而导致神经系统发育异常。然而，目前尚无安全性较高的针对保护孕期杂环胺诱导的胚胎神经发育不良的药物。

胎儿的肝脏发育不完善，药物及降解产物***延滞，且排除的部分代谢产物，可因“羊水肠道循环”被胎儿重吸收，容易在体内蓄积，影响胎儿组织器官的发育。因此，在妊娠期间，即使对母体无严重的不良反应的药品也可能对胎儿产生毒性作用。采用药物保护胚胎不仅要考虑其治疗效果，还必须考虑其对胎儿或新生儿发育的影响，从绿色食品中筛选天然小分子药物，发掘其对胚胎发育的保护作用也尤为可行。

萝卜硫素(1-异硫氰酸-4-甲磺酰基丁烷，Sulforaphane，SFN)又称莱菔硫素或莱菔硫烷，是硫代葡萄糖苷的衍生物，属于异硫氰酸酯类物质，其富含于十字花科蔬菜中，如西兰花芽(Keum et al.,Drug News Perspect 2005)。萝卜硫素易溶于水，相对分子质量为177.29，分子式C₆H₁₁S₂NO，结构式如下：

有可靠证据表明富含莱菔硫烷的西兰花芽及其他来源的食用性莱菔硫烷，可通过激活Nrf2信号通路，诱导二相解毒酶和抗氧化酶的产生，并且有助于预防癌症等疾病(Dinkova-Kostova et al.,Proc Natl Acad Sci U S A 2002)。在萝卜硫素的应用方面，多集中在其对抗氧化、对抗癌症等成体保护作用的专利，例如抑制紫外光诱导的皮肤癌发生的药物(200680022993.6；101208079B)，萝卜硫素的肝脏保护作用及其在非酒精性脂肪肝中的应用，10.0μmol/L萝卜硫素有明显保护作用(201610938091.2)等。纳米萝卜硫素(纳米SFN)的专利多集中在制备和抗癌作用，如一种负载萝卜硫素的载药体系及其制备方法(201811510938.2)，载多西他赛和莱菔硫烷的自组装纳米粒的制备方法与应用(201410060679.3)。

纳米技术是近年来发展很快的新型技术，药剂学中的纳米粒或称纳米载体与纳米药物，其尺寸界定于1-1000nm之间。纳米药物主要是将药物的微粒或将药物吸附包裹在载体中，制成纳米尺寸范围的微粒，再以其为基础制成不同种类的剂型。纳米药物在提高药物稳定性、减小对胃肠道的刺激、消除毒副作用、提高药效、实现靶向给药、提供缓释作用等具有独特的优势(高洁et al.,化学工业与工程2012；谢华,医药化工2018)。常见的纳米药物载体有纳米磁性颗粒，高分子纳米药物载体等。药物中的常见纳米粒类型有纳米球和纳米囊，纳米脂质体，固体脂质纳米粒，纳米胶束，纳米乳等。纳米颗粒的粒径大小、表面电荷和表面性质是影响纳米颗粒体内分布与药代特征的主要因素，药代特征和体内分布的改变会继而影响其药效和毒性(常艳,纳米物质遗传毒性研究与评价专题研讨会论文汇编.中国毒理学会遗传毒理专业委员会:中国毒理学会2018)。

发明内容

萝卜硫素虽然具有良好的抗氧化能力和广泛的抗肿瘤作用，但萝卜硫素的胚胎发育毒性以及能否用于制备胚胎神经系统发育保护药物尚不明确。本发明的首要目的在于克服现有技术中的缺点与不足，提供萝卜硫素或其纳米粒在制备改善孕妇杂环胺摄入导致的胚胎神经系统发育不良药物中的应用。

本发明的目的通过以下技术方案实现：

萝卜硫素或其纳米粒在制备改善孕妇杂环胺摄入导致的胚胎神经系统发育不良药物中的应用。

所述的萝卜硫素或其纳米粒的有效浓度均优选为0～10μmol/L(不等于0)；更优选为5μmol/L。

所述的药物包含萝卜硫素和其作为先导化合物合成出来的药学上可接受的修饰物中的至少一种。

所述的修饰包括成盐修饰、酯化修饰、酰胺化修饰、成环修饰和开环修饰中的至少一种。

所述的萝卜硫素纳米粒包括纳米载体和包载在纳米载体中的萝卜硫素。

所述的纳米载体优选为脂质体或能形成胶束的聚合物；更优选为甲氧基聚乙二醇-聚谷氨酸；其中，甲氧基聚乙二醇段的分子量为3000～7000，聚谷氨酸段的分子量为8000～12000；最优选为甲氧基聚乙二醇-聚谷氨酸；其中，甲氧基聚乙二醇段的分子量为5000，聚谷氨酸段的分子量为10000。

甲氧基聚乙二醇-聚谷氨酸属于高分子纳米药物载体，mPEG-PGA可以在水中自行组装为具有稳定物理性质的花冠状结构，同时具有亲水性和亲油性基团，在水中溶解后自发形成高分子胶束。由于萝卜硫素属于脂溶性药物，因此它会被包裹于mPEG-PGA内核部分。mPEG-PGA聚合物可以延长大分子生物半衰期(Kataoka et al.,Adv Drug Deliv Rev2001)，具有良好的穿透细胞膜作用(Hubbell,Science 2003)。

所述的萝卜硫素纳米粒优选通过如下方法制得：将甲氧基聚乙二醇-聚谷氨酸溶液与萝卜硫素溶液混合，超声处理，静置；然后离心处理，洗涤沉淀即可；优选的，所述的方法包括如下步骤：

1)将萝卜硫素溶解在二甲基亚砜(DMSO)中，得到萝卜硫素溶液；

2)将甲氧基聚乙二醇-聚谷氨酸溶解在乳酸钠林格氏溶液(LR)中，得到甲氧基聚乙二醇-聚谷氨酸溶液；

3)将步骤2)得到的甲氧基聚乙二醇-聚谷氨酸溶液与步骤1)得到的萝卜硫素溶液混合，超声处理，静置；然后离心处理，洗涤沉淀，所得沉淀即为甲氧基聚乙二醇-聚谷氨酸包封的萝卜硫素纳米粒。

DMSO用作表面活性剂和有机溶剂作用于萝卜硫素。DMSO也有助于提高形成纳米颗粒的稳定性并避免纳米颗粒的快速聚集。乳酸钠林格氏溶液用作mPEG-PGA的溶剂并用作形成纳米颗粒的缓冲溶液；与纯水相比，通过保持稳定的pH值，可以减缓纳米颗粒的快速聚集和zeta电位的变化。

步骤1)中所述的萝卜硫素溶液的浓度优选为10～100mmol/L；更优选为40～60mmol/L最优选为56.4mmol/L。

步骤2)中所述的的甲氧基聚乙二醇-聚谷氨酸溶液浓度优选为0.01～0.1μg/μL；更优选为0.04～0.06μg/μL；最优选为0.05μg/μL。

步骤3)中所述的甲氧基聚乙二醇-聚谷氨酸溶液与萝卜硫素溶液的配比优选为体积比1:5～20；更优选为1：10。

步骤3)中所述的混合的具体操作优选为将甲氧基聚乙二醇-聚谷氨酸溶液逐滴滴加到萝卜硫素溶液中。

步骤3)中所述的超声处理的具体操作为：将得到的混合液超声处理30～40分钟，然后向混合液中按混合液：乳酸钠林格氏溶液＝体积比1:10～15加入乳酸钠林格氏溶液，震荡5～8分钟，再次超声处理30～40分钟。

步骤3)中所述的静置的条件优选为4℃的暗室中过夜。

步骤3)中所述的离心处理的条件优选为15000～20000g下离心10～30分钟；更优选为18000g下离心20分钟。

步骤3)中所述的离心处理，洗涤沉淀的操作优选为重复5次以上。

所述的杂环胺优选指吡啶类杂环胺，包括2-氨基-1-甲基-6-苯基-咪唑[4,5-b]吡啶(PhIP)、2-氨基-1,6-二甲基咪唑[4，5-b]吡啶(DMIP)、2-氨基-1,5,6-三甲基咪唑[4，5-b]吡啶(TMIP)；尤其是指2-氨基-1-甲基-6-苯基-咪唑[4,5-b]吡啶(PhIP)。

所述的胚胎神经系统发育不良包括神经管畸形、神经管分化不良、神经嵴细胞产生受抑制、神经嵴细胞迁移受抑制、神经管细胞增殖受抑制、神经管细胞凋亡。

所述的药物的剂型为胶囊、丸剂、片剂、口服液、颗粒剂、酊剂或注射液。

所述的药物还含有一种或多种药学上可接受的辅料或载体。

所述的辅料为缓释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂或润滑剂中的至少一种。

在我们的前期研究中，通过直接暴露给鸡胚能通过胎盘屏障的致畸因子，观察神经管细胞和神经嵴的发育，建立神经系统发育缺陷的模型(Cheng et al.,ToxicologicalSciences 2017；Cheng et al.,Neurotoxicology 2012；Jin et al.,Mol Reprod Dev2015；Liu et al.,Toxicol Sci 2016；Ma et al.,PLoS One 2012；Zhang et al.,ToxicolLett 2017)，这为本发明提供了一个良好神经系统发育缺陷保护药物的在体研究模型。

本发明采用自组装法，应用生物相容性好、生物可降解的甲氧基聚乙二醇5000-b-聚谷氨酸10000(mPEG5K-PGA10K)为基材(Jiang et al.,Adv Funct Mater 2018；Xiao etal.,Chem Commun(Camb)2013；Yang et al.,Mater Sci Eng C Mater Biol Appl 2019；Zhang et al.,J Colloid Interface Sci 2016)，制备了纳米萝卜硫素(SFN-mPEG5K-PGA10K)。

我们通过PhIP诱导鸡胚神经系统发育异常进行了鸡胚试验。结果证明，一定浓度的萝卜硫素和纳米萝卜硫素均能够有效缓解致畸因素如PhIP诱导的胚胎神经系统发育不良：

(1)纳米萝卜硫素的制备和自组装；

(2)纳米萝卜硫素的药物装载效率分析；

(3)纳米萝卜硫素的纳米特性检测；

(4)萝卜硫素改善PhIP诱导的胚胎死亡和神经管畸形；

(5)萝卜硫素改善PhIP诱导的胚胎神经管细胞分化不良；

(6)萝卜硫素改善PhIP抑制的胚胎神经嵴细胞的产生；

(7)萝卜硫素改善PhIP抑制的胚胎神经嵴细胞的迁移；

(8)萝卜硫素改善PhIP抑制的胚胎神经管细胞增殖；

(9)萝卜硫素改善PhIP诱导的胚胎神经管细胞凋亡。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

本发明提供了一种萝卜硫素的新用途-胚胎发育保护用途，不仅扩大了萝卜硫素的应用范围，提高了其应用价值，还有助于进一步开发新的改善孕妇杂环胺摄入诱导的胚胎神经系统发育不良的纳米药物。

附图说明

图1为纳米颗粒形成过程的示意图。

图2为纳米萝卜硫素药物装载效率分析结果图；其中，A为标准样品DMSO和DMSO+SFN的色谱图；B为装载后、装载前上清液的色谱图。

图3为纳米萝卜硫素的Zeta电位、粒径和形态分析结果图；其中，A为Zeta电位图；B为粒度分布图；C为透射电镜图。

图4为萝卜硫素改善PhIP诱导的胚胎死亡和神经管畸形的实验研究结果图；其中，A为白光和PAX7荧光下正常胚胎和死亡胚胎检测图；B为正常胚胎和神经管畸形胚胎头部和躯干部拍照图；C为神经管缺陷和胚胎死亡率统计结果。

图5为萝卜硫素改善PhIP诱导的胚胎神经管细胞分化不良的实验研究结果图；其中，A为NF免疫荧光观察不同组别鸡胚神经管细胞形态的检测结果图；B为NF阳性细胞与神经管细胞的比率统计结果。

图6为萝卜硫素改善PhIP抑制的胚胎神经嵴细胞的产生的实验研究结果图；其中，A为Ap2α标记神经嵴细胞的不同组别检测结果图；B为Ap2α阳性面积统计结果。

图7为萝卜硫素改善PhIP抑制的胚胎神经嵴细胞的迁移的实验研究结果图；其中，A为HNK1标记迁移的神经嵴细胞的不同组别检测结果图；B为HNK1阳性面积统计结果。

图8为萝卜硫素改善PhIP抑制的胚胎神经管细胞增殖的实验研究结果图；其中，A为PHIS3标记神经管增殖细胞的不同组别检测结果图；B为PHIS3阳性细胞数统计结果。

图9为萝卜硫素改善PhIP诱导的胚胎神经管细胞凋亡的实验研究结果图；其中，A为c-Caspase3标记标记神经管凋亡细胞的不同组别检测结果图；B为c-Caspase3阳性细胞数统计结果。

具体实施方式

下面通过具体实施方式及附图来进一步说明本发明技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。

以下实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所用的实验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂厂商购买得到的。

下述实施例中所述的材料中：

萝卜硫素购自Sigma(S6317)，分子式为C₆H₁₁NOS₂，分子量为177.29；

甲氧基聚乙二醇5000-b-聚谷氨酸10000(mPEG5K-PGA10K)购自西安瑞禧生物科技有限公司(R-PL1236-15K)。

实施例1纳米萝卜硫素的制备和自组装

参照图1所示流程，将药物萝卜硫素通过自组装包封到mPEG5K-PGA10K中。具体操作如下：

1)将萝卜硫素溶解在纯二甲基亚砜(DMSO)中，得到浓度为56.4mmol/L的SFN-DMSO溶液；

2)将mPEG5K-PGA10K溶解在乳酸钠林格氏溶液(Sodium lactate ringersolution:LR，一种等张静脉注射液，市场上有售，购自上海茁彩生物科技有限公司，货号ZC-A0302)中，得到浓度为0.05μg/μL的mPEG5K-PGA10K溶液；

3)10分钟后，将10μL mPEG5K-PGA10K溶液在轻轻滴在100μL SFN-DMSO溶液中，充分震荡得到混合液；确保能得到过饱和萝卜硫素溶液；

4)将混合液超声处理30分钟，以固定分子间相互作用；

5)向混合液中加入1.2mL乳酸钠林格氏溶液，充分震荡5分钟，再次超声处理30分钟；

6)将溶液置于4℃的暗室中过夜；

7)将溶液在18,000g下超速离心20分钟，取出上清液，用乳酸钠林格氏溶液洗涤沉淀，该步骤重复5次，得到纳米纳米萝卜硫素SFN-mPEG5K-PGA10K。

将纯化的纳米颗粒用于进一步表征检测或用于生物学研究。

实施例2纳米萝卜硫素的药物装载效率分析

采用低速离心法分离载药纳米粒，高效液相色谱法测定上清液中游离药物的含量，测定峰面积。分别取标准样品溶液(DMSO，DMSO+SFN)，装载后、装载前上清液(Nanoparticles⁺，Nanoparticles^-)各10μL注入高效液相色谱仪(色谱柱：Agilent C18(250mm×4.6mm,5μm)；流动相：甲醇-水(10:90)；流速：1.0mL·min^-1；检测波长：266nm；柱温:30℃；进样量：10μL。)，记录色谱图，色谱图见图2。该色谱条件下，萝卜硫素(Sulforaphane)达到基线分离且峰形良好，保留时间7.8min，溶剂及辅料不干扰萝卜硫素的测定(图2A)。根据峰面积计算得到游离药物的量(图2B)，分别测定装载后上清中萝卜硫素的量(Nanoparticles⁺，W1)，以及装载前总萝卜硫素的量(Nanoparticles^-，W2)，计算药物装载效率EE＝(1-W1/W2)*100％。纳米萝卜硫素的药物装载效率为23.02％±2.7％。

实施例3纳米萝卜硫素的纳米特性检测

采用Zeta电位分析仪测定所制纳米萝卜硫素的纳米特性，结果如图3所示。在pH7.4，纳米萝卜硫素的Zeta电位(ZP)为-7.21mV±1.3mV，多分散指数(PDI)为0.430+/-0.095(图3A)。取稀释的纳米粒应用激光粒度分布测量仪分析其粒径分布(图3B)，应用透射电子显微镜分析纳米粒的形态大小(图3C)。根据纳米萝卜硫素投射电镜(TEM)图片，可以观察到纳米萝卜硫素为均匀球形颗粒，粒径为195nm±32nm，粒径分布比较均一。

实施例4萝卜硫素改善PhIP诱导的胚胎死亡和神经管畸形

采用Early chick(EC)Culture的方法培养早期鸡胚，将鸡胚分为正常对照组(0.1％DMSO)，20μmol/L PhIP处理组，100μmol/L PhIP处理组，200μmol/L PhIP处理组，300μmol/L PhIP处理组，200μmol/L PhIP+5μmol/L SFN组，200μmol/L PhIP+5μmol/L纳米SFN组(每组n＝100，PhIP、萝卜硫素、纳米萝卜硫素均用DMSO溶解，所用实验组工作液DMSO浓度低于0.1％，下同)。将各组试剂混匀在蛋白琼脂培养基中，HH0期鸡胚置于培养基上在37℃恒温箱孵育，到HH10期(36小时)收获胚胎。将胚胎进行PAX7免疫荧光染色，观察胚胎神经管形态，死亡胚胎无荧光表达(图4A，bar＝500μm)。正常胚胎头部和躯干部均无神经管畸形的发生，神经管畸形胚胎可以观察到神经管闭合缺陷和明显的神经管发育不良(图4B箭头所示，bar＝200μm)。20μmol/L PhIP处理组的胚胎死亡率为8％，神经管畸形的发生率为5％；100μmol/L PhIP处理组胚胎死亡率为20.17％，神经管畸形的发生率为14.29％；200μmol/LPhIP处理组的胚胎死亡率为53.41％，神经管畸形的发生率为35.80％；300μmol/L PhIP处理组的胚胎死亡率为85％，神经管畸形的发生率为14％(图4C)。PhIP诱导胚胎的死亡率和神经管畸形随着PhIP浓度的升高而升高，后续选择200μmol/L PhIP作为实验研究浓度。200μmol/L PhIP+5μmol/L SFN组胚胎死亡率为10.14％，神经管畸形的发生率为9.42％；200μmol/L PhIP+5μmol/L纳米SFN组胚胎死亡率为7％，神经管畸形的发生率为6％(图4C)。应用5μmol/L萝卜硫素和5μmol/L纳米萝卜硫素干预可以显著降低神经管畸形的发生率和胚胎的死亡率。

实验证实，在鸡胚模型中，纳米萝卜硫素可以显著改善PhIP诱导的胚胎神经管发育不良，提高胚胎存活率。

实施例5萝卜硫素改善PhIP诱导的胚胎神经管细胞分化不良

采用神经丝轻链多肽(Neurofilament，NF)免疫荧光对鸡胚神经管细胞形态进行观察(图5箭头所示)，我们发现200μmol/L PhIP处理组的胚胎神经管细胞分化状态较正常对照组明显减弱，同时添加5μmol/L SFN时神经管细胞分化状态有所改善，而200μmol/LPhIP+5μmol/L纳米SFN组胚胎则有明显挽救效果，NF荧光表达明显上升(图5A，bar＝50μm)。结果表明，5μmol/L纳米萝卜硫素能够促进PhIP抑制下的鸡胚早期神经管细胞分化(PhIP处理组与正常组相比，***p<0.001；PhIP+SFN组与正常组相比，***p<0.001；PhIP+SFN组与PhIP处理组相比，***p<0.001；PhIP+纳米SFN组与PhIP处理组相比，***p<0.001；PhIP+纳米SFN组与PhIP+SFN组相比,*p<0.05；每组n＝12)。

实验证实，在鸡胚模型中，PhIP诱导的神经管细胞分化不良可以通过添加5μM萝卜硫素得到改善，而且纳米萝卜硫素的效果更为显著。

实施例6萝卜硫素改善PhIP抑制的胚胎神经嵴细胞的产生

胚胎的神经系统包括中枢神经系统和周围神经系统，神经管组成胎儿的中枢神经系统，而周围神经系统则由神经嵴细胞分化形成。采用Ap2α免疫荧光特异性标记神经嵴细胞(图6虚线所示区域内的表达和切片上箭头所指)，检测了正常对照组、200μmol/L PhIP、200μmol/L PhIP+5μmol/L SFN、200μmol/L PhIP+5μmol/L纳米SFN处理后，对鸡胚神经嵴细胞的影响。结果发现，200μmol/L PhIP处理后，神经嵴细胞明显减少，200μmol/L PhIP+5μmol/L SFN组神经嵴细胞数量有所回升，而200μmol/L PhIP+5μmol/L纳米SFN处理组神经嵴细胞的产生恢复到接近正常水平(图6，A、B，整体bar＝100μm,切片bar＝50μm)(PhIP处理组与正常组相比，**p<0.01；PhIP+纳米SFN组与PhIP处理组相比，**p<0.01；n＝18)。

实验证实，在鸡胚模型中，PhIP抑制的神经嵴细胞产生可以通过添加纳米萝卜硫素得到改善。

实施例7萝卜硫素改善PhIP抑制的胚胎神经嵴细胞的迁移

神经系统的发育是一个复杂的过程，涉及细胞的诱导，确定和运动。神经嵴是一种具有高度迁移能力的多功能细胞群，在发育过程中，神经嵴细胞正常迁移后，可以形成周围神经系统的神经元和神经胶质，这对胚胎神经系统的建立具有重要意义。利用HNK1特异性标记迁移的神经嵴细胞(图7虚线区域内的表达)。结果显示，200μmol/L PhIP处理下，HNK1荧光表达面积明显减小，200μmol/L PhIP+5μmol/L SFN组HNK1荧光表达面积高于单独PhIP处理组，200μmol/L PhIP+5μmol/L纳米SFN干预后，HNK1阳性面积显著上升。(图7，A、B，整体bar＝100μm,切片bar＝50μm)(PhIP组与正常组相比，*p<0.05；PhIP+SFN组与PhIP处理组相比，*p<0.01；PhIP+纳米SFN组与PhIP处理组相比，***p<0.001；n＝41)。

实验证实，在鸡胚模型中，萝卜硫素和纳米萝卜硫素均显著改善孕妇PhIP摄入抑制的胚胎神经嵴细胞的迁移。

实施例8萝卜硫素改善PhIP抑制的胚胎神经管细胞增殖

神经发生是指***的祖细胞产生有丝***后的神经元和神经胶质，这是建立功能性中枢神经系统所必需的过程。神经发生在生物体形成的很早就开始，尽管各个物种的确切系统发育阶段可能有所不同，但第一个神经元通常在原肠胚形成后或神经管闭合时出现。我们将鸡胚培养至HH10，用PHIS3标记神经管上增殖的细胞(图8箭头所指为增殖细胞)，结果发现，200μmol/L PhIP处理下，PHIS3阳性细胞数显著减少，200μmol/L PhIP+5μmol/LSFN组PHIS3阳性细胞数有所增加，而在200μmol/L PhIP+5μmol/L纳米SFN处理下，PHIS3阳性细胞数回到正常水平。(图8，A、B，bar＝50μm)(PhIP处理组与正常组相比，***p<0.001；PhIP+SFN组与PhIP处理组相比，***p<0.001；PhIP+纳米SFN组与PhIP处理组相比，**p<0.001；n＝27)。

实验证实，在鸡胚模型中，萝卜硫素和纳米萝卜硫素均能够显著改善PhIP抑制的神经管细胞增殖。

实施例9萝卜硫素改善PhIP诱导的胚胎神经管细胞凋亡

神经管是整个中枢神经系统的前体，尽管许多基因已经牵涉到神经管的闭合中，但是闭合所基于的细胞机制却鲜为人知。神经发生过程的一个标志是在闭合过程中和闭合后神经褶皱中存在死亡的细胞。在神经系统中需要凋亡，然而异常的凋亡可导致神经管闭合缺陷。我们用c-Caspase3标记神经管上凋亡的细胞(图9箭头所指为凋亡细胞)，结果发现，200μmol/L PhIP处理下，c-Caspase3阳性细胞数显著增加，200μmol/L PhIP+5μmol/LSFN组c-Caspase3阳性细胞数减少，而在200μmol/L PhIP+5μmol/L纳米SFN处理下，神经管细胞凋亡情况得有所缓解，相较于PhIP处理组，c-Caspase3阳性细胞数明显减少。(图9，A、B，bar＝50μm)(PhIP处理组与正常组相比，***p<0.001；PhIP+SFN组与PhIP处理组相比，***p<0.001；PhIP+纳米SFN组与PhIP处理组相比，**p<0.001；n＝27)。

实验证实，在鸡胚模型中，萝卜硫素和纳米萝卜硫素均能够显著改善PhIP诱导的神经管细胞凋亡。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。