萝卜硫素在制备抑制和/或治疗放射性肌纤维化的药物中的应用
阅读说明：本技术 萝卜硫素在制备抑制和/或治疗放射性肌纤维化的药物中的应用 (Application of sulforaphane in preparation of drugs for inhibiting and/or treating radioactive muscle fibrosis ) 是由 姜新 辛颖 杨格 王斌 赵钦 魏金龙 王欢欢 于 2021-09-30 设计创作，主要内容包括：本发明提供了萝卜硫素在制备抑制和/或治疗放射性肌纤维化的药物中的应用,涉及生物医药技术领域。本发明所述萝卜硫素(SFN)作为Nrf2激动剂,可通过干预氧化应激、炎症、细胞周期、增殖、凋亡及血管生成和转移等相关的信号传导通路发挥抑制肿瘤的效果,且萝卜硫素可保护多种组织和器官免于纤维化。本发明所述SFN可通过调控Nrf2介导的氧化应激和TGF-β1/Smad信号通路来抑制纤维化基因的表达,减少细胞外基质(ECM)的过度积累,从而显著改善放射引起的肌纤维化,对未来在临床上应用具有一定的意义。(The invention provides an application of sulforaphane in preparation of a medicine for inhibiting and/or treating radioactive muscle fibrosis, and relates to the technical field of biological medicines. The Sulforaphane (SFN) as an Nrf2 agonist can play a role in inhibiting tumors by interfering in relevant signal transduction pathways such as oxidative stress, inflammation, cell cycle, proliferation, apoptosis, angiogenesis and metastasis, and the like, and the sulforaphane can protect various tissues and organs from fibrosis. The SFN provided by the invention can inhibit the expression of fibrosis genes by regulating Nrf 2-mediated oxidative stress and TGF-beta 1/Smad signal pathways, and reduce the excessive accumulation of extracellular matrix (ECM), so that the muscle fibrosis caused by radiation is obviously improved, and the SFN has a certain significance for clinical application in the future.)
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及萝卜硫素在制备抑制和/或治疗放射性肌纤维化的药物中的应用。
背景技术
放疗通过电离辐射(ion-irradiation,IR)在杀死肿瘤细胞的同时，也会对靶区范围内正常组织造成不同程度的损伤。但正常组织的长期放疗毒性仍然不可避免，其中放射性肌纤维化(RIMF)是放疗引起的常见严重长期并发症之一，不仅对患者的美观和生存质量带来严重不良影响，并且会导致放疗的中断及延迟，甚至影响患者的治疗效果及总体生存期。目前，临床上尚未批准用于预防和逆转放射性肌纤维化的抗纤维化药物，治疗策略仅仅是对症支持治疗，如使用糠酸莫米松、倍他米松等类固醇激素药膏和比亚芬等乳膏，但效果均不理想，仅仅起到一定程度的预防及治疗作用，难以满足临床患者需求。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供萝卜硫素在制备抑制和/或治疗放射性肌纤维化的药物中的应用，萝卜硫素能够调动和活化机体自身的内源性抗氧化防御系统，上调多种内源性抗氧化物质有效防治放射性肌纤维化。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了萝卜硫素在制备抑制和/或治疗放射性肌纤维化的药物中的应用。
本发明还提供了萝卜硫素在制备上调内源性抗氧化物质表达量的制剂中的应用。
优选的，所述内源性抗氧化物质包括Nrf2/ARE信号通路的下游抗氧化基因CAT和HO-1的表达蛋白。
本发明还提供了萝卜硫素在制备抑制TGF-β1/Smad信号通路的试剂中的应用。
本发明还提供了一种抑制和/或治疗放射性肌纤维化的药物，所述药物的有效成分包括萝卜硫素。
优选的，所述药物中还包括药学上可接受的辅料。
优选的，所述药物的剂型包括注射剂。
优选的，所述药物的注射剂量以萝卜硫素计，为0.5mg/kg。
有益效果：本发明提供了萝卜硫素在制备抑制和/或治疗放射性肌纤维化的药物中的应用，所述萝卜硫素(SFN)作为Nrf2激动剂，可通过干预氧化应激、炎症、细胞周期、增殖、凋亡及血管生成和转移等相关的信号传导通路发挥抑制肿瘤的效果，且萝卜硫素可保护多种组织和器官免于纤维化。本发明将安全无副作用的SFN通过其抗氧化作用来预防放射引起肌纤维化，在具体实施例中，本发明构建了小鼠放射性肌纤维化及SFN治疗模型，在体内探究SFN预防放射性肌纤维化的有效性。结果显示，SFN可通过调控Nrf2介导的氧化应激和TGF-β1/Smad信号通路来抑制纤维化基因的表达，减少ECM的过度积累，从而显著改善放射引起的肌纤维化，对未来在临床上应用具有一定的意义。
附图说明
图1为SFN减轻放射诱导的肌纤维化结果图，其中A为H&E染色结果图(20μm)，B为Masson染色结果图(20μm)，C为胶原纤维所占面积统计结果；
图2为SFN抑制ECM成分的表达结果图(20μm)；
图3为SFN削弱骨骼肌的氧化应激反应结果图，其中A为ROS表达水平的ELLISA结果图，B和C为3-NT的Westernblot结果图；
图4为SFN强烈抑制RIMF小鼠中TGF-β1的表达结果图；
图5为SFN显著降低IR/SFN组小鼠肌肉组织中磷酸化Smad2/3蛋白表达结果图(20μm)；
图6为SFN激活Nrf2/ARE信号通路结果图(20μm)。
具体实施方式
本发明提供了萝卜硫素在制备抑制和/或治疗放射性肌纤维化的药物中的应用。
本发明所述萝卜硫素(SFN)是从日常食用的十字花科蔬菜中提取得到的异硫氰酸酯(ITC)类化合物，如西兰花、花椰菜、羽衣甘蓝和卷心菜，具有式I所示结构：
在本发明实施例中，利用放射性肌纤维化动物模型证实，给SFN后，肌纤维排列整齐，未见中央核肌纤维，间质中有少量纤维结缔组织生成，炎性细胞消散；并且胶原纤维生成减少，肌纤维间隙缩小，且结构规则，胶原纤维占所观察视野总面积比例明显降低，提示SFN可显著降低模型肌肉组织纤维化的程度。同时，SFN还可以显著下调小鼠肌肉组织中collagen-I(NCBI ID:12842)和CTGF(NCBI ID:14219)的表达，削弱骨骼肌的氧化应激反应，抑制TGF-β1/Smad信号通路，并激活Nrf2/ARE信号通路，从而体现出SFN显著的预防和治疗放射性肌纤维化的效果。在本发明中，当利用所述萝卜硫素作用于人体时，显效基因或蛋白质均为人源，collagen-I人源(NCBI ID:1277)、CTGF人源(NCBI ID:1490)，CAT人源(NCBIID:847)，HO-1的人源(NCBI ID:3162)。
本发明对所述SFN的来源没有特殊限定，可采用本领域的常规市售产品，也可自行提取或合成，实施例中优选购自源叶生物公司。
本发明还提供了萝卜硫素在制备上调内源性抗氧化物质表达量的制剂中的应用。
本发明所述内源性抗氧化物质优选包括Nrf2/ARE信号通路的下游抗氧化基因CAT(NCBI ID:12359)和HO-1(NCBI ID:15368)的表达蛋白。
本发明还提供了萝卜硫素在制备抑制TGF-β1/Smad信号通路的试剂中的应用。
TGF-β1/Smad是关键的促纤维化信号通路，本发明实施例中通过Western blot结果表明，与模型空白对照组(CON组)相比，照射组(IR组)小鼠肌肉组织中的TGF-β1的表达均显著增加。与IR组相比，照射/SFN组(IR/SFN组)小鼠肌肉组织中的TGF-β1的表达显著降低，说明SFN强烈抑制了RIMF小鼠中TGF-β1的表达。免疫组化结果发现，SFN显著降低了IR/SFN组小鼠肌肉组织中磷酸化Smad2/3蛋白表达，而总Smad2/3蛋白表达水平没有明显改变，综上，SFN抑制了TGF-β1/Smad信号传导途径抑制纤维化基因的表达。
本发明还提供了一种抑制和/或治疗放射性肌纤维化的药物，所述药物的有效成分包括萝卜硫素。
本发明所述药物中优选还包括药学上可接受的辅料。本发明所述药物的剂型优选包括注射剂，且所述药物的注射剂量以萝卜硫素计，为0.5mg/kg。
下面结合实施例对本发明提供的萝卜硫素在制备抑制和/或治疗放射性肌纤维化的药物中的应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
对动物进行分组：
构建动物模型：通过使用X-RAD 320X射线辐照仪对小鼠左侧大腿骨骼肌进行单次照射的方法建立放射性肌纤维化动物模型。
(1)空白对照组(CON)：无射线照射处理，每周连续5天皮下注射相应剂量的生理盐水，连续注射4周，观察至第8周；
(2)SFN组(SFN)：无射线照射处理，与IR/SFN组同步接受SFN(0.5mg/kg)皮下注射，连续注射4周，观察至第8周；
(3)照射组(IR)：小鼠左侧大腿骨骼肌接受单次40Gy射线照射，并在照射当天给予同等剂量的SFN配制溶剂(生理盐水)，每周连续5天，连续注射4周，观察至第8周；
(4)照射/SFN组(IR/SFN)：小鼠左侧大腿骨骼肌接受单次40Gy射线照射，并在照射当天给予SFN(0.5mg/kg)皮下注射，每周连续5天，连续注射4周，观察至第8周；
于实验开始后第8周处死小鼠，观察小鼠肌肉损伤的情况。
1、SFN减轻放射诱导的肌纤维化：参考文献(PMID:32032580)进行H&E染色，结果显示，IR组小鼠的肌肉组织中出现肌纤维萎缩，细胞核出现在肌纤维中央，间质中出现大量纤维结缔组织增生，散布伴有少量的炎性细胞浸润。与IR组小鼠相比，IR/SFN组肌纤维排列整齐，未见中央核肌纤维，间质中有少量纤维结缔组织生成，炎性细胞消散(图1中A)。Masson染色(PMID：31481954)观察到，与CON组相比，IR组红色肌纤维稍萎缩，蓝色胶原纤维的数量明显增加，肌纤维间隙增宽，胶原纤维占所观察视野总面积比例增大，显示纤维化明显增加；而与IR组相比，IR/SFN组胶原纤维生成减少，肌纤维间隙缩小，且结构规则，胶原纤维占所观察视野总面积比例明显降低，提示肌肉组织纤维化的程度明显降低(图1中B和C)。
2、SFN抑制ECM成分的表达：Western Blot(参考PMID:32032580、PMID:28596000)结果显示，与CON组相比，IR组中collagen-I的水平急剧升高，而IR/SFN组的collagen-I的表达远低于IR组，IHC(参考PMID：32032580)结果与Western Blot结果一致，说明SFN给药能够下调小鼠肌肉组织中collagen-I的表达。CTGF能有效刺激成纤维细胞的分裂增殖，促进胶原蛋白的合成和结缔组织增生，使肌肉发生纤维化。与CON组相比，IR组中CTGF的表达水平明显升高，而IR/SFN组的CTGF的表达远低于IR组，说明SFN对ECM表达有明显的抑制作用(图2)。
3、SFN削弱骨骼肌的氧化应激反应：ELLISA结果显示，IR组中ROS表达水平较CON组明显升高，给予SFN干预后，ROS表达水平明显下降(图3中A)。同时，Westernblot结果显示，与CON组相比，IR组小鼠肌肉组织中的氧化应激损伤指标3-硝基酪氨酸(3-NT)明显升高。与IR组相比，3-NT在IR/SFN组中的表达明显降低(图3中B和C)，说明辐射可以造成肌肉氧化性损伤，增加3-NT表达，而SFN可以抑制ROS的产生及氧化应激造成的损伤，从而发挥抗氧化作用。
4、SFN抑制经典的TGF-β1/Smad信号通路：TGF-β1/Smad是关键的促纤维化信号通路。Western blot结果表明，与CON组相比，IR组小鼠肌肉组织中的TGF-β1的表达均显著增加。与IR组相比，IR/SFN组小鼠肌肉组织中的TGF-β1的表达显著降低，说明SFN强烈抑制了RIMF小鼠中TGF-β1的表达(图4中A和B)。免疫组化结果发现，SFN显著降低了IR/SFN组小鼠肌肉组织中磷酸化Smad2/3蛋白表达，而总Smad2/3蛋白表达水平没有明显改变(图5中A和B)。以上结果共同表明，SFN抑制了TGF-β1/Smad信号传导途径抑制纤维化基因的表达。
5、SFN激活Nrf2/ARE信号通路：Western blotting结果显示，在SFN组小鼠肌肉组织中，Nrf2表达明显升高，而IR组小鼠肌肉组织Nrf2表达较SFN组显著降低；IR/SFN组小鼠肌肉组织中Nrf2的表达明显高于CON组和IR组(图6中A和B)。此外，与CON组相比，SFN组小鼠肌肉组织中Nrf2下游抗氧化基因CAT和HO-1的蛋白表达均显著增加；与CON组比较，IR组这些基因的表达无显著性差异；而与IR组比较，IR/SFN组CAT和HO-1的蛋白表达显著增加(图6中A，图6中C、D和E)。以上结果表明，SFN能够激活RIMF小鼠体内的Nrf2/ARE信号通路。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
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