阅读说明：本技术 一种使用辣根过氧化物酶定量检测双链dna扩增产物的方法 (Method for quantitatively detecting double-stranded DNA amplification product by using horseradish peroxidase ) 是由 张道虹 李超灿 王雨菲 于 2019-04-02 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种检测方法,具体涉及一种使用辣根过氧化物酶定量检测双链DNA扩增产物的方法。其特点为,使用生物素修饰的引物进行特定DNA序列的扩增,利用中性亲和素捕获扩增产物,并使用链霉亲合素-辣根过氧化物进行标记,结果由辣根过氧化物酶的底物试剂进行检测,表现为颜色变化或化学发光。本发明方法便于操作,适用于环境、食品安全、或人体血液/血清中的特定DNA序列的定量检测,结果可通过肉眼观察,或拍照并进行定量分析。(The invention relates to a detection method, in particular to a method for quantitatively detecting a double-stranded DNA amplification product by using horseradish peroxidase. The method is characterized in that a biotin-modified primer is used for amplifying a specific DNA sequence, an amplification product is captured by using neutravidin, and streptavidin-horseradish peroxidase is used for labeling, and the result is detected by a substrate reagent of horseradish peroxidase and shows color change or chemiluminescence. The method is convenient to operate, is suitable for quantitative detection of specific DNA sequences in environment, food safety or human blood/serum, and can be used for observing results by naked eyes or photographing and carrying out quantitative analysis.)

一种使用辣根过氧化物酶定量检测双链DNA扩增产物的方法

技术领域

本发明用于环境、食品安全、或人体血液/血清中的特定DNA序列的定量检测。

背景技术

DNA是生物体内的遗传信息携带者，因此DNA非常稳定，并具有高度辨识性，是作为物种检测的一个强大的工具。而在DNA样品量比较少的时候，可采用DNA扩增手段，将目标DNA序列进行复制。该方法可信度高，能够极大程度上提高检测限，因此被广泛应用于医疗、食品、生物安全等行业。

最常用的DNA扩增技术，如聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)，能够将目标DNA序列数量扩增10⁶倍以上，该DNA扩增结果通常使用DNA凝胶电泳进行定性或半定量检测，在各个领域都有非常广泛的应用。随着DNA扩增技术的发展，也可使用荧光标记进行DNA扩增产物的实时定量(即实时定量荧光PCR，real-time PCR)，但该方法需要特殊仪器在进行DNA扩增的同时观测荧光数据，该仪器价格昂贵，其中的一些方法需要特殊的DNA引物设计(如使用Taqman探针)，材料价格高昂。

发明内容

(目的、技术路线和发明效果)

本发明的目的在于联合现有的DNA扩增技术，只在引物上加入生物素，就可以使用96孔板对特定DNA序列的双链扩增产物进行定量检测。目标物由辣根过氧化物酶进行标记，结果由辣根过氧化物酶的底物试剂进行检测，表现为颜色变化或化学发光，可进行拍照分析，无需使用大型仪器。

本发明的技术方案概述如下：

一种使用辣根过氧化物酶定量检测双链DNA扩增产物的方法，包括如下步骤：

(1)合成有生物素标记的上游引物、上游引物互补链和下游引物，并利用该引物进行DNA扩增；

(2)在96孔板中加入0.1mg/mL的中性亲和素50μL，在4摄氏度反应过夜；

(3)倒出溶液并清洗96孔板，加入1％奶粉150μL，室温反应1小时；

(4)倒出溶液并清洗96孔板，加入双生物素短DNA双链(0-400nM，至少四个点)及DNA扩增产物(不同稀释倍数)各50μL；每个浓度做三次重复实验；室温反应2小时；

(5)倒出溶液并清洗96孔板，加入链霉素亲和素-辣根过氧化物酶50μL，室温反应2小时；

(6)倒出溶液并清洗96孔板，加入显色液；

(7)中止反应，进行结果读取，或拍照进行颜色分析。

所述显色液可以为TMB、DAB等不同辣根过氧化物酶的显色试剂。

本发明的优点：

1、利用已有的DNA扩增技术，无需重新设计引物序列和改变操作步骤；

2、检测成本低廉，操作简单；

3、结果可拍照分析，无需大型仪器；

4、能够对DNA扩增产物进行定性和定量分析。

附图说明

图1为采用本方法分析短DNA目标的标准曲线和计算结果。

具体实施方式

实施例1：

对随机双链短DNA模板扩增产物进行分析，包括如下步骤：

(1)合成引物、互补链、短DNA模板和短DNA模板互补链，序列如下表所示：

(2)DNA扩增：

0.2mL离心管中的各试剂初始浓度为：dNTP mix(0.2mM)；上游引物(0.5μM)；下游引物(0.5μM)；双链短DNA模板含量(即短DNA模板与短DNA模板互补链杂交得到的双链DNA，1管PCR试剂中含量为1.0ng)；Mg²⁺(1.5mM)；Taq酶(0.05U)；加ddH₂O至50μL。

扩增步骤为：预变性1分钟(95℃)，30个循环(95℃反应15秒，55℃反应30秒，72℃反应30秒)，最后延伸5分钟(72℃)，扩增产物保存在4℃；

(3)在96孔板中加入0.1mg/mL的中性亲和素50μL，在4摄氏度反应过夜；

(4)倒出溶液并清洗96孔板，加入1％奶粉150μL，室温反应1小时；

(5)将上游引物与互补链进行DNA杂交，形成双生物素短DNA双链；

(6)倒出溶液并清洗96孔板，加入双生物素短DNA双链(浓度分别为0，10，20，30，40，100，200，400nM)及DNA扩增产物(1∶10，1∶100和1∶1000稀释)各50μL；每个样品做三次重复实验；室温反应2小时

(7)倒出溶液并清洗96孔板，加入链霉素亲和素-辣根过氧化物酶(1*)50μL，室温反应2小时；

(8)倒出溶液并清洗96孔板，加入TMB显色液；

(9)中止反应，并使用酶标仪在450nm测定吸光度。

(10)根据标准曲线和样品的吸光度，计算双链短DNA模板扩增产物的浓度：得到的标准曲线为y＝0.059x-0.424；由于双链短DNA模板扩增产物(1∶10，1∶100和1∶1000)吸光度分别为2.12，1.63和0.07，计算1∶100稀释的扩增产物浓度为34.8nM，因此该双链短DNA模板扩增产物浓度为3.48μM，即69.6ng/μL(相对分子量20kDa)。

上述实施例仅为本发明的优选例，并不用来限制本发明，凡在本发明的原则之内，所做的任何修改和变化，均在本发明的保护范围之内。

所述显色液可以为TMB、DAB等不同辣根过氧化物酶的显色试剂。