非诊断目的基于靶标等温循环扩增及核酸试纸条技术检测miRNA-21的方法及试剂盒
阅读说明：本技术 非诊断目的基于靶标等温循环扩增及核酸试纸条技术检测miRNA-21的方法及试剂盒 (Method and kit for detecting miRNA-21 based on target isothermal cycle amplification and nucleic acid test strip technology for non-diagnosis purpose ) 是由 常津 陈明慧 宫晓群 王汉杰 罗冉 于 2020-03-23 设计创作，主要内容包括：本发明属于miRNA检测领域,具体涉及一种非诊断目的基于靶标等温循环扩增及核酸试纸条技术检测miRNA-21的方法。包括下述步骤:1)使用水热法制备均一粒径的胶体金纳米粒子；2)使用TCEP活化巯基h-DNA后,与胶体金反应形成金硫键用于制备胶体金核酸探针；3)将胶体金核酸探针和待检miRNA互补配对,加入双链特异性核酸酶,实现靶标循环回收及信号放大；反应结束后,加入终止液,使酶失活,得到反应液；4)核酸试纸条的组装和检测：将上步骤3)产生的反应液加入到组装好的核酸试纸条上,观察检测结果。本发明能够显著提高miRNA的检测灵敏度。(The invention belongs to the field of miRNA detection, and particularly relates to a method for detecting miRNA-21 based on target isothermal cycle amplification and nucleic acid test strip technology for non-diagnosis purposes. Comprises the following steps of 1) preparing colloidal gold nanoparticles with uniform particle size by a hydrothermal method; 2) activating sulfhydryl group h-DNA by using TCEP, and reacting with colloidal gold to form a gold-sulfur bond for preparing a colloidal gold nucleic acid probe; 3) complementary pairing is carried out on the colloidal gold nucleic acid probe and the miRNA to be detected, and double-strand specific nuclease is added to realize target recycling and signal amplification; after the reaction is finished, adding a stop solution to inactivate the enzyme to obtain a reaction solution; 4) assembling and detecting the nucleic acid test strip: adding the reaction solution generated in the step 3) into the assembled nucleic acid test strip, and observing the detection result. The invention can obviously improve the detection sensitivity of miRNA.)
技术领域
本发明属于miRNA检测领域，具体涉及一种非诊断目的基于靶标等温循环 扩增及核酸试纸条技术检测miRNA-21的方法。
背景技术
微小RNA-21(miRNA-21)是一类内源性非编码RNA小分子，miRNA-21的显 着异常表达与各种疾病，特别是人类肿瘤的发生及发展密切相关。有关miRNA-21 在癌症中的功能已经有大量的文献研究，多项研究表明癌症患者的外周血miRNA 表达谱发生特异性改变，越来越多证据表明miRNA-21可作为一种新颖的分子标 志物应用于癌症诊断和预后评估.传统的基于miRNA-21的检测如基因测序、荧 光定量PCR等，但是这些检测方式毫无例外都需要大型的仪器配合，不仅费时、 费力，而且只适合医院等一些检测机构，无法造福于每个家庭以实现便携、惠 民大众化。因此miRNA-21的早期简便检测已经成为现今的研究热点。
靶标等温循环扩增技术通常是指基于酶促反应的核酸体外等温扩增技术， 主要利用核酸酶剪切DNA识别位点的能力，在等温条件下，促进目标物的结合 与释放，从而产生相应的信号实现信号累积及扩增。其中双链特异性核酸酶(DSN) 是一种最常见的适用于miRNA检测的核酸酶，DSN能高效识别并酶切完全互补配 对的DNA双链或者DNA/RNA杂交双链中的DNA链,而对单链DNA和单/双链RNA 几乎没有作用的核酸酶,此外，这种降解作用仅针对于至少12个完全匹配的核 苷酸序列，因此它具有高度特异性。
胶体金核酸试纸条是一种对复杂样品中目标物质进行检测的固相免疫分析方法，其主要原理如下：利用胶体金标记一种短的DNA序列，与目标物质核酸反 应形成复合物，由于毛细管作用在固相层析膜上涌动，被检测线上的DNA序列 捕获，形成肉眼可见的T线。一定条件下，T线信号强弱与目标核酸浓度正相关， 将胶体金免疫层析检测试纸条联合胶体金读取仪的方法，根据反射光度法原理， 可以快速、准确、简单的对相关物质进行定量或者半定量检测，胶体金核酸试 纸条已成为一种核酸即时检验(Point-of-care testing,POCT)方法。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中的缺陷，提供一种非诊断目的基于靶标 等温循环扩增及核酸试纸条技术检测miRNA-21的方法。
本发明为实现上述目的，采用以下技术方案：
一种非诊断目的基于靶标等温循环扩增及核酸试纸条技术检测miRNA-21的 方法，包括下述步骤:
1)使用水热法制备均一粒径的胶体金纳米粒子；
2)使用TCEP活化巯基h-DNA后，与胶体金反应形成金硫键用于制备胶体金 核酸探针；其中,巯基h-DNA为 5’-SH-TTTTTAGCTTATCAACTACTGATCAACATCAGTCTGATAAGCTA-3’；
3)将胶体金核酸探针和待检miRNA互补配对，加入双链特异性核酸酶，实 现靶标循环回收及信号放大；反应结束后，加入终止液，使酶失活，得到反应 液；
4)核酸试纸条的组装和检测：将上步骤3)产生的反应液加入到组装好的 核酸试纸条上，观察检测结果；所述的核酸试纸条上包含有检测垫；所述检测 垫上包含有检测线，所述的检测线上保护有sd—DNA，浓度为5-20μM；sd—DNA 的碱基序列号为5’-biotin-AAAACATGGTTACCGATCCAAGTTCAGTAGTTGATA-3’。
2.根据权利要求1所述的非诊断目的基于靶标等温循环扩增及核酸试纸条 技术检测miRNA-21的方法，其特征在于，步骤1)的具体步骤为：
将柠檬酸钠溶液加入到反应器，在磁力搅拌条件下加热至沸腾，第一次加 入氯金酸溶液；氯金酸与柠檬酸钠摩尔配比为1：10-20；溶液变为浅粉色后停止 加热，溶液降温到90-95℃，加入与第一次加入量等量的氯金酸溶液反应 20-30min，再次加入与第一次加入量等量的氯金酸溶液反应得到金种溶液；
将金种溶液和另外准备的柠檬酸钠溶液混合作为下一步反应的生长液，生 长液加热到90-95℃后加入氯金酸溶液反应20-30min，再次加入等量氯金酸溶 液得到下一步反应的大粒径胶体金纳米粒子溶液；其中，金种子溶液：氯金酸： 柠檬酸钠摩尔配比为1:1:13.75；制备得到的胶体金纳米粒子溶液粒径为 13-40nm。
步骤2)的具体步骤为10-50μL的浓度为10-50μM的巯基茎环h-DNA探针， 加入10-50μL的浓度为10-50mM的三(2-羧乙基)膦TCEP溶液，活化1-3h后， 加入1-5mL均一粒径纳米粒子，旋转培养反应16-24小时；之后加入4-10μL 的1mg/mL的鼠源单克隆第一抗体Ab1(北京博奥森生物科技，bsm-2027M)，反 应1-3h；再加入0.1-0.5mL的浓度为3M的氯化钠溶液，置于4℃反应过夜后， 在8000-15000转速条件下离心15-30min，除去上清，用0.1-0.5mL的0.01M磷 酸缓冲溶液PBS重悬沉淀，得到的则为胶体金核酸探针。
步骤3)的具体步骤为取3-7μL胶体金核酸探针和待检miRNA按照体积比 为1-3:1比例混合于磷酸缓冲液中，加入0.1-0.6U双链特异性核酸酶及10×双 链特异性核酸酶缓冲液，涡旋仪上低速旋转使其混匀，然后将上述混合溶液置 于金属浴中，35-60℃下反应20-60分钟，实现靶标循环回收及信号放大。反应 结束后，加入终止液，45℃反应5分钟，使酶失活。
步骤4)中核酸试纸条包括试纸条卡壳以及设置在所述的试纸条卡壳内的顺 序设置的样本垫、胶金垫、检测垫、以及吸收垫；其中样本垫的长度为1.1-2cm 之间；胶金垫的长度为0.3-0.8cm；检测垫的长度为2.5-4.5cm；吸收垫的长度 为1.1-2cm。
所述的检测垫包含检测线和质控线，其中质控线上包含了抗Ab1((北京博 奥森生物科技，bsm-2027M))的第二抗体Ab2(赛默飞科技，A32723)，浓度为 0.8-2mg。
步骤4)的具体步骤为井步骤3)得到的反应液加入到试纸条,试纸条信号 收集时间为5-15min，通过相应时间内的生检测线上胶体金信号的累积与相应 miRNA浓度的关系，建立此发明检测技术的标准曲线。
本发明还包括一种所述的检测miRNA-21的试剂盒，包括胶体金核酸探针、 核酸试纸条以及双链特异性核酸酶。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
1.显著提高miRNA的检测灵敏度。主要通过放大检测信号，降低背景噪音 两方面的有机结合，即以基于DSN辅助靶标循化回收及信号富集扩增策略，提 供更多待检测的d-DNA，用于核酸试纸条的检测；通过胶体金核酸探针聚集作为 检测信号，胶体金信号无需额外光激发的特点克服了背景噪音的干扰；从而显 著提高了检测的灵敏度。
2.实现样品中miRNA的快速、灵敏直接检测，针对样品，由于DSN酶的高 校特异性以及核酸试纸条的快速性，显著提高了样本中miRNA的检测时间，将 miRNA检测时间缩短到1小时左右。
3.实现样品中miRNA的高效特异性检测，通过分子茎环探针与DSN酶的协 同作用，可以从待测样品中高特异性的检测出目标miRNA，实现高特异性检测。
附图说明
图1为非诊断目的基于靶标等温循环扩增及核酸试纸条技术检测miRNA-21的方法的检测原理示意图；
图2为基于DSN辅助靶标等温循环扩增的琼脂糖凝胶电泳表征结果图；
图3为在阴性条件下使用不同h-DNA的显色情况，用于本方法h-DNA的选择；
图4为非诊断目的基于靶标等温循环扩增及核酸试纸条技术检测miRNA的灵敏 度实验图。
具体实施方式
为了使本技术领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合附 图和最佳实施例对本发明作进一步的详细说明。
本发明的试剂盒检测miRNA-21原理如图1所示，首先，使用水热法制备均 一粒径的胶体金纳米粒子，接着将胶体金纳米粒子与巯基化的h-DNA分子茎环 探针反应，制备高特异性的胶体金核酸探针。在有目标物存在的情况下，首先， 胶体金核酸探针上的h-DNA可以高效特异性的和临床样本中的目标miRNA-21结 合；接着，通过DSN的能高效识别并酶切完全互补配对的DNA双链或者DNA/RNA 杂交双链中的DNA链的能力,将目标miRNA-21释放出来，h-DNA被切割生成胶体 金d-DNA；核酸试纸条上的检测线通过生物素链霉亲和素固定sd-DNA,质控线 上固定羊抗鼠抗体；存在miRNA-21时生成的d-DNA最后与核酸试纸条上检测线 上的sd-DNA互补配对,产生检测信号，同时，核酸探针流过质控线时都会产生 对应的质控信号。本方法的可行性验证如图2所示，当目标miRNA-21和DSN同 时存在时，可以看到h-DNA被切割，条带变弱。当不存在目标物的情况下，胶 体金核酸探针无法从样本中结合到目标物质，因此后续反应无法进行，不产生 核酸试纸条胶体金信号。本方法的检测灵敏度曲线结果如图4所示，其灵敏度 可以达到nM级别。本试剂盒中所用到的引物及DNA、RNA序列均由上海生工合 成。
特异性h-DNA的设计：通过对目标miRNA的序列分析，根据配对Tm温度值 和△G能量值的差异，创造性的设计特异性的h-DNA茎环探针。miRNA-21配对 Tm温度值为57℃，△G能量值为-12.3，因此设计的hDNA探针Tm值高于57℃， △G能量值应高于-12.3，h-DNA探针可以高效特异的结合目标miRNA。由于DSN 的选择切割性，如图3所示，设计了三种茎环探针，分别为h-DNA1、h-DNA2以 及h-DNA3；其中用到的核酸序列如表1示出：表1
实施例1:一种非诊断目的基于靶标等温循环扩增及核酸试纸条技术检测 miRNA-21的方法，包括下述步骤:
1)使用水热法制备均一粒径的胶体金纳米粒子；将柠檬酸钠溶液加入到反 应器，在磁力搅拌条件下加热至沸腾，第一次加入氯金酸溶液；此次氯金酸与柠 檬酸钠摩尔配比为1：15；溶液变为浅粉色后停止加热，溶液降温到90-95℃， 加入与第一次加入量等量的氯金酸溶液反应20-30min，再次加入与第一次加入 量等量的氯金酸溶液反应得到金种溶液；
将金种溶液和另外准备的柠檬酸钠溶液混合作为下一步反应的生长液，生 长液加热到90-95℃后加入氯金酸溶液反应20-30min，再次加入等量氯金酸溶 液得到下一步反应的大粒径胶体金纳米粒子溶液；其中，金种子溶液：氯金酸： 柠檬酸钠摩尔配比为1:1:13.75；制备得到的胶体金纳米粒子溶液粒径为 13-40nm。
2)使用TCEP活化巯基h-DNA1后，与胶体金反应形成金硫键用于制备胶体 金核酸探针；20μL的浓度为10-50μM的巯基茎环h-DNA探针，加入20μL的浓 度为20mM的三(2-羧乙基)膦TCEP溶液，活化1-3h后，加入2mL均一粒径纳米 粒子，旋转培养反应16-24小时；之后加入6μL的1mg/mL的鼠源单克隆第一 抗体Ab1，反应1-3h；再加入0.2mL的浓度为3M的氯化钠溶液，置于4℃反应 过夜后，在8000-15000转速条件下离心15-30min，除去上清，用0.3mL的0.01M 磷酸缓冲溶液PBS重悬沉淀，得到的则为胶体金核酸探针。
3)将胶体金核酸探针和待检miRNA互补配对，加入双链特异性核酸酶，实 现靶标循环回收及信号放大；反应结束后，加入终止液，使酶失活，得到反应 液；具体为取5μL胶体金核酸探针和待检miRNA按比例混合于磷酸缓冲液中， 加入0.3U双链特异性核酸酶及10×双链特异性核酸酶缓冲液，胶体金核酸探 针:待检miRNA:双链特异性核酸酶体积比为1：1：1；涡旋仪上低速旋转使其 混匀，然后将上述混合溶液置于金属浴中，50℃下反应50分钟，实现靶标循环 回收及信号放大。反应结束后，加入终止液，45℃反应5分钟，使酶失活。其中，分别配制待检miRNA的浓度分别为0M、0.5x10-9M、1x10-9M、2x10-9M、4x10-9 M、10x10-9M。
4)核酸试纸条的组装和检测：将上步骤3)产生的反应液加入到组装好的 核酸试纸条上，观察检测结果；所述的核酸试纸条上包含有检测垫；核酸试纸 条包括试纸条卡壳以及设置在所述的试纸条卡壳内的顺序设置的样本垫、胶金 垫、检测垫、以及吸收垫；其中样本垫的长度为1.1-2cm之间；胶金垫的长度 为0.3-0.8cm；检测垫的长度为2.5-4.5cm；吸收垫的长度为1.1-2cm。所述的检 测垫包含检测线和质控线，其中检测线上包含了检测用脱氧核糖核苷酸 (sd-DNA)，浓度为5-20μM；质控线上包含了抗Ab1的第二抗体Ab2((赛默飞科 技，A32723)，浓度为0.15mg-1.0mg/mL。
步骤4)的具体步骤为井步骤3)得到的反应液加入到组装好的核酸试纸条 上,试纸条信号收集时间为10min，通过相应时间内的生检测线上胶体金信号的 累积与相应miRNA浓度的关系，建立此发明检测技术的标准曲线。结果如图4 所示，核酸试纸条胶体金显色情况与miRNA-21浓度关系成正比，浓度越大，显 色强度越大，因此本发明可应用于样品中miRNA-21的检测
对比例1以及对比例2步骤2)中分别使用h-DNA2以及h-DNA3胶体金反应 形成金硫键用于制备胶体金核酸探针；结果表明其不能特异性的结合目标 miRNA。
以上内容仅为本发明的较佳实施例，对于本领域的普通技术人员，依据本 发明的思想，在具体实施方式及应用范围上均会有改变之处，本说明书内容不 应理解为对本发明的限制。