阅读说明：本技术 一种治疗aml的药物及应用 (Medicine for treating AML and application thereof ) 是由 曾辉 王惠雯 展会恩 姜欣雅 于 2020-07-30 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种治疗AML的药物,所述药物为AP-1抑制剂T5224,所述药物AP-1抑制剂T5224在制备抗AML药物中的应用；AP-1抑制剂T5224在AML细胞株中能抑制细胞的增殖和促进其凋亡,且不对正常细胞株的增殖造成明显的影响；T5224联合阿糖胞苷作用于AML细胞株,对AML细胞增殖的抑制较单用阿糖胞苷明显增强；T5224能增强AML细胞对化疗药物阿糖胞苷的敏感性,能促进阿糖胞苷对AML细胞的杀伤作用。(The invention discloses a medicine for treating AML, which is an AP-1 inhibitor T5224, and the application of the AP-1 inhibitor T5224 in preparing an anti-AML medicine; the AP-1 inhibitor T5224 can inhibit the proliferation of cells and promote the apoptosis of the cells in an AML cell strain, and does not cause obvious influence on the proliferation of a normal cell strain; the T5224 combined with cytarabine acts on AML cell strains, and the inhibition on AML cell proliferation is obviously enhanced compared with the inhibition on AML cell proliferation by singly using cytarabine; t5224 can enhance the sensitivity of AML cells to cytarabine, a chemotherapeutic drug, and promote the killing effect of cytarabine on AML cells.)

一种治疗AML的药物及应用

技术领域

本发明涉及抗肿瘤药物技术领域，特别涉及一种治疗AML的药物及应用。

背景技术

急性髓系白血病(Acute myeloid leukemia,AML)是一组由未成熟髓系原始细胞克隆性增殖引起的高度异质性的血液系统恶性肿瘤性疾病，其标准治疗方法是诱导缓解化疗后巩固化疗或造血干细胞移植。尽管早在20世纪70年代，诱导化疗药物柔红霉素和阿糖胞苷的联合应用可以使大量的AML患者获得完全缓解(Complete remission,CR)；然而，在过去的40年中，除急性早幼粒细胞白血病(APL)以外，AML的治疗进展缓慢，患者预后依然很差。因此，新的、有效的治疗方法对于提高AML预后至关重要。

人类的激活蛋白1(activating protein 1,AP-1)是由Jun(c-Jun、Jun-B、Jun-D)、Fos(c-Fos、Fos-B、Fra-1、Fra-2)、ATF(ATF2、ATF3、LRF1、B-ATF、JDP1、JDP2)和MAF(C-Maf、MafB、MafA、Maf)多基因的蛋白家族形成的同源或异源二聚体。AP-1作为一种重要的转录因子，参与细胞内多种生长因子与细胞因子的基因转录，在细胞增殖、凋亡、分化、存活、迁移和转化等生物学过程中起重要作用，在多种实体肿瘤与血液系统肿瘤中表达增加。早期许多研究致力于检测AP-1在肿瘤细胞中的活性，但结果显示其活性并不影响肿瘤细胞生存。因此，近期的研究开始致力于JUN家族与Fos家族成员在肿瘤中的表达与活性。其中Fos家族中Fra-1与c-Fos在肿瘤中的功能研究最为广泛。既往研究表明，在血液系统肿瘤里，在AML中，c-Fos、Jun与AP-1的表达水平升高。与Fra-1和c-Fos的大量研究资料相比，FosB、Fra-2及FosB2、△FosB2在肿瘤中的研究甚少，FosB在AML中的表达及发挥的生物学作用尚未明确。重要的是，FosB作为原癌基因，能增加乳腺癌细胞的侵袭能力、促进胰腺癌的进展。在胰腺癌中，miR-144-3p靶向原癌基因FosB，抑制胰腺恶性肿瘤细胞的增殖、转移和侵袭。而T5224是一种特异性的非肽小分子AP-1抑制剂，可抑制Fos与Jun蛋白形成的异源二聚体AP-1与启动子区AP-1结合位点的结合，从而抑制AP-1信号通路的激活，但其在急性髓系白血病中的作用尚未见报道。

发明内容

本发明通过检测急性髓系白血病患者的骨髓样本，发现AP-1信号通路中的FosB在AML的难治和复发组中表达显著增高。因此本发明通过提出设想：AP-1信号通路对AML的增殖调控作用如何，是否能影响AML细胞对化疗药物的敏感性。针对以上设想，本发明基于急性髓系白血病细胞株及临床样本为研究对象实验证实了这个设想，然后针对这一证明事实，本发明基于急性髓系白血病细胞株及临床样本为研究对象，探讨FosB在急性髓系白血病细胞中的作用及其对化疗药物阿糖胞苷(Cytarabine,Ara-C)敏感性的影响，验证了AP-1抑制剂T5224在不对正常细胞株的增殖造成明显的影响的情况下，在急性髓系白血病细胞株中能够抑制细胞的增殖和促进其凋亡，且能增强AML细胞株对Ara-C的敏感性。

本发明要解决的问题是提供T5224的新用途，即在制药中的新应用。本发明的目的是提供T5224在制备抗急性髓系白血病和化疗增敏药物中的应用。

为了达到上述目的，本发明所采用的的技术方案为：一种治疗AML的药物，所述药物为AP-1抑制剂T5224，所述T5224的化学式为：

优选的，所述药物至少还包括阿糖胞苷。

优选的，所述药物AP-1抑制剂T5224在制备抗AML药物中的应用。

优选的，所述药物以T5224为活性成分，加入一种或多种药学上可接受的辅料，辅料包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、吸收促进剂、表面活性剂、润滑剂、稳定剂、香味剂、甜味剂及色素。

优选的，所述药物为增加AML细胞对化疗药物，如阿糖胞苷的敏感性的增敏剂。

优选的，所述药物为一种抗AML的药物组合物，该组合物含有药学上有效量的T5224和药学上有效量的阿糖胞苷及药学上可接受的载体。

优选的，所述药物被制成任何一种药学上可接受的剂型，所述剂型包括片剂、胶囊剂、颗粒剂、口服液、缓释制剂、纳米制剂、注射剂。

与现有技术相比本发明的有益效果为：

1、本发明检测了T5224对细胞株的细胞杀伤作用，发现T5224对人脐静脉内皮细胞的增殖未造成明显影响；

2、T5224在急性髓系白血病细胞株中能抑制细胞的增殖，促进凋亡；

3、T5224联合阿糖胞苷作用于AML细胞株，对AML细胞增殖的抑制较单用阿糖胞苷明显增强；T5224能够促进阿糖胞苷对AML细胞的杀伤作用，增强AML细胞对化疗药物阿糖胞苷的敏感性；

4、本发明提出一种治疗急性髓系白血病的新药物—T5224，该药物尚未报道对人体有毒副作用，与化疗药物阿糖胞苷联用，一方面能促进阿糖胞苷对AML细胞的杀伤作用，另一方面，能减少阿糖胞苷剂量，减轻化疗药物对人体的毒副作用。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为FosB在AML患者中的表达图；

图2为FosB在正常细胞株和AML细胞株中的表达图；

图3为人脐静脉内皮细胞株与AML细胞株中药物干预后增殖结果图；

图4为AML细胞经不同浓度的T5224处理后的凋亡结果图；

图5为T5224联合阿糖胞苷干预AML细胞增殖结果图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例及说明书附图，对本发明中的相关技术进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

一种治疗AML的药物，所述药物为AP-1抑制剂T5224，所述T5224的化学式为：

优选的，所述药物至少还包括阿糖胞苷。

优选的，所述药物AP-1抑制剂T5224在制备抗AML药物中的应用。

优选的，所述药物以T5224为活性成分，加入一种或多种药学上可接受的辅料，辅料包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、吸收促进剂、表面活性剂、润滑剂、稳定剂、香味剂、甜味剂及色素。

优选的，所述药物为增加AML细胞对化疗药物，如阿糖胞苷的敏感性的增敏剂。

优选的，所述药物为一种抗AML的药物组合物，该组合物含有药学上有效量的T5224和药学上有效量的阿糖胞苷及药学上可接受的载体。

优选的，所述药物被制成任何一种药学上可接受的剂型，所述剂型包括片剂、胶囊剂、颗粒剂、口服液、缓释制剂、纳米制剂、注射剂。

实施例1

一、FosB在AML细胞株及临床患者中的表达

1、实验材料：

细胞株

人AML细胞株HL-60和THP-1及人脐静脉内皮细胞株(HUV-EC-E)均购于中南大学细胞中心。

临床样本

收集72例AML患者的新鲜骨髓标本，标本用含肝素钠抗凝剂的采血管收集，每份标本量约为2-3mL。

2、主要实验方法：

临床标本收集

2017年到2020年，一共收集72例AML患者骨髓细胞样本，急性髓系白血病诊断标准根据2019年NCCN Guidelines。样本男性40人，女性32人，年龄范围为17-67岁，平均年龄为42.1岁。AML患者的骨髓样本来源于中南大学湘雅医院住院部与门诊部，且通过伦理审核。将收集到的骨髓细胞样本分为完全缓解组(Completely Remission AML,AML-CR)与复发/难治组(Relapsed/Refractory AML,AML-RR)，如表1所示；在样本收集的72例AML患者中共有34例AML-CR组患者及38例AML-RR组患者。

表1 AML患者的基本信息

细胞培养

悬浮细胞THP-1与HL-60培养于RPMI-1640配置的完全培养基中(含10％FBS)，贴壁细胞HUV-EC-E培养于DMEM配置的完全培养基中(含10％FBS)，将细胞放置于37摄氏度、含有5％饱和湿度的二氧化碳的细胞培养箱内进行培养和传代；注意观察细胞生长状态及是否污染，根据细胞代谢情况换液，一般情况下每隔两天换一次液。

骨髓标本提取单个核细胞

(1)收集2-3mL AML患者新鲜骨髓样本至紫头肝素抗凝管中；

(2)将新鲜骨髓样本与等体积的PBS(4℃预冷)混合均匀；

(3)取一洁净15mL离心管，向管中加入2mL人淋巴细胞分离液，用1000uL移液器吸取上述稀释骨髓样本，将离心管倾斜固定最少45度，避免晃动，并沿离心管管壁将骨髓样本缓慢地加入淋巴细胞分离液上，使分离液与骨髓液液面之间出现明显分层。

(4)将离心管放置于离心机中，以0.4rcf/min离心20分钟。

(5)轻轻取出离心管，避免震荡，可见离心管中液体分4层，从下到上依次为：红细胞层、淋巴细胞分离液层、乳白色单个核细胞层、血浆层。取另一15mL无菌离心管加入2mLPBS(4℃预冷)，用1000uL移液器小心吸取第二层单个核细胞层加入管中，吹打混匀；

(6)将离心管放置于离心机中，设置参数为0.2rcf/min离心5分钟，丢弃上清，可见管底沉积有白色细胞，如果细胞偏红，可予以红细胞裂解液静置裂解5-8分钟后予以4℃预冷的PBS溶液反复洗涤、离心2次后备用。

提取RNA

(1)首先收集正处于对数生长期且生长状态良好的AML细胞株，将其置于1.5mL的无菌EP管中，于离心机中以1000rpm/min的转速离心5分钟后弃去上清，放置于冰上保存；

(2)向上述离心后的EP管中加入体积为1mL的Trizol，并用1mL移液器反复吹打均匀数次；

(3)向上述EP管混合液中加入200μL氯仿，手动上下颠倒混匀30秒，放置于室温中静置反应5分钟后予以4℃12000rpm/min离心15分钟；

(4)将离心后的EP管取出放置于冰上，EP管中液体分为3层：上层是澄清的RNA溶解液，中层是絮状的DNA及蛋白质，底层是淡红色Trizol等有机溶剂；用移液器小心吸取上层澄清液体量约400μL至另一1.5mL的无菌EP管中；

(5)向吸取上层澄清液后的EP管中加入400μL异丙醇，轻柔震荡数次后放置于室温静置约10分钟后，予以4℃12000rpm/min离心10分钟；避免震荡轻轻取出EP管，沉积在EP管壁底部的乳白色絮状物即为RNA；

(6)弃去上述离心后EP管中的上清液，取1mL现配4℃预冷的75％乙醇加入EP管中，轻轻震荡后将其置于离心机内，以4℃7500rpm/min离心5分钟后取出；除去管中液体，可用10μL移液器吸取残余少量液体，避免吸取沉淀的RNA；

(7)将上述去除液体的EP管置于室温中，晾干水分约15-20分钟后向其中加入dd水(约20μL)混合均匀；

(8)将EP管中的RNA标本在振荡器上震荡均匀，上机进行检测A260/A280比值与RNA浓度。

RNA逆转录

(1)准备一冰盒，将逆转录试剂(购自广州复能基因有限公司货号：Cat.No.QP007)各组分置于冰上充分溶解后轻柔震荡混匀，在离心机中短暂离心后放置于冰上备用；

(2)制备RNA-Primer预混液，依据表2将各试剂组分加入无RNase的洁净EP管中。

表2 RNA-Primer预混液各试剂组分

(3)轻柔震荡混匀RNA-Primer预混液，置于离心机中短暂离心，予以65℃恒温孵育10min后，立即置于冰上保存备用；

(4)准备逆转录反应液，按照表3内容，在冰上操作将各试剂组分加入混合液中；

表3逆转录反应液各试剂组分

(5)轻柔震荡逆转录反应液混合均匀，放置于离心机中短暂离心后予以37℃温育60min后以85℃孵育5min以终止逆转录反应；

(6)将反应后所得cDNA置于冰上保存备用。

RT-qPCR定量反应

(1)将试剂盒中的QPCR SYBR Green Master Mix(购自上海翊圣生物科技有限公司，货号：11202ES08)在冰上充分溶解并轻柔震荡混匀，于离心机中短暂离心后置于冰上备用。

(2)在冰上制备体积为20ul的qPCR反应体系，按照表4将各个试剂组分加入无核酸酶的96孔板中后离心混匀，使试剂沉积于管底，其中FosB引物与GAPDH引物由广州复能基因有限公司负责构建；

表4 qPCR反应体系各试剂组分

(3)设置qPCR反应条件

第一步:95℃5分钟--循环1次。

第二步:95℃10秒,60℃20秒，72℃20秒--循环40次。

第三步：溶解曲线生成--循环1次。

临床样本蛋白样品制备

(1)收集正处于对数生长期且生长状态良好的细胞株置于15mL离心管中，于离心机中以1000rpm/min离心5分钟，后用移液枪吸弃上清液，

(2)以4℃预冷的PBS清洗细胞2遍后将其转入至1.5mL的EP中，于离心机中以1000rpm/min离心5分钟，后用移液枪吸弃上清液；

(3)将-20℃保存的蛋白酶抑制剂PMSF与蛋白裂解液NP40于冰上溶解后按1：100的比例配置，1mL混合液混合均匀后放置于冰上。

(4)在1.5mL离心管中根据细胞量加入适量上述混合液，在冰上静置裂解，间隔10min震荡一次，每次震荡10s，共震荡3次；

(5)上述静置、震荡共30分钟后使用超声破碎仪对上述裂解液进行超声3次，每次10s，使DNA裂解后，EP管中液体变粘稠；

(6)将裂解后的EP管予以4℃、12000rpm/min离心15分钟，管底部沉积有白色沉渣(即DNA碎片)；

(7)取出EP管，用移液枪吸取上清液即蛋白，移至新的无菌1.5mL EP管中，后续进行蛋白浓度测定，或放置于-80℃冰箱中保存。

BCA法测定蛋白质含量

(1)取出-80℃冰箱储存的标准蛋白样本，置于冰上充分溶解；

(2)根据样本总数量，按每孔200ul计算BCA工作液总量，注意考虑损耗增加1-2个孔数，BCA试剂总量按照试剂B和试剂A以1:50的体积比例充分混匀后放置于冰上待用(BCA试剂包含试剂B和试剂A，其中试剂A:1％BCA二钠盐,2％无水碳酸钠,0.16％酒石酸钠,0.4％氢氧化钠,0.95％碳酸氢钠，混合调PH值至11.25；试剂B：4％硫酸铜)；

(3)将标准蛋白样本以体积为0μL，1μL，2μL，4μL，8μL，12μL，16μL，18μL，19μL，20μL加入96孔板中；对应无酶水体积分别为20μL，19μL，18μL，16μL，12μL，8μL，4μL，2μL，1μL，0μL使每个孔总体积20μL。

(4)在上述96孔板上，在各待测蛋白样品孔中加入待测蛋白样本1μL，再分别加入无酶水19μL，使每个孔总体积20μL。

(5)每个待测蛋白样品加样孔均应设置三个复孔以使测量结果准确；

(6)分别取200μl步骤(2)中配置好的BCA工作液加入上述96孔板的各孔中，混匀后放置于37℃恒温箱中，孵育30分钟；

(7)将上述96孔板取出放置于常温中降温至室温，放入酶标仪，设置参数，检测562nm波长处蛋白样本的吸光度(OD值)；

(8)根据标准蛋白孔测得读数绘制标准曲线，将待测蛋白孔读数代入回归方程计算每个待测蛋白样本的蛋白质浓度及WB实验中每孔的上样体积。

凝胶电泳

(1)使用清水洗净厚薄两块玻璃板后吹干，用制胶夹将两块玻璃板对齐夹紧，将制胶夹固定卡紧于底部有防漏胶条的WB制胶架上，水平放置制胶架；

(2)配置分离胶，分离胶按照SDS-PAGE分离胶(10％)方法进行配置，将各组分混匀后用1000μL移液器沿着长短玻璃缝隙水平匀速注胶，后立即用ddH2O快速封胶，放置于室温静置约30min-1h，待分离胶凝固；

(3)配置浓缩胶，待ddH2O与分离胶之间出现明显分界线后缓慢轻柔地倒去上层ddH2O，用洁净的滤纸小心吸干胶槽内残留的ddH2O；上层浓缩胶按照SDS-PAGE浓缩胶(5％)的方法进行配置，将各组分混匀后水平、快速、均匀灌胶后立即水平***梳子，保持梳齿下缘水平以避免气泡产生，将制胶架放置于水平桌面上室温静置约15-30min；

(4)待浓缩胶胶体凝固后取出，将玻璃板夹紧(短板靠内)于电泳夹中，放入电泳槽中(槽中盛满现配电泳缓冲液)，用手捏住梳子两端将梳子轻轻拔出，避免产生气泡和碎胶破坏胶条；

(5)从-80℃冰箱取出已测定蛋白浓度的蛋白样品，冰上溶解，将蛋白样品1/4体积的上样缓冲液SDS加入蛋白样品中，充分震荡混匀后放置于100℃恒温加热器中，持续加热10分钟使蛋白变性后取出样品，放置于冰上备用；

(6)震荡混合蛋白Marker，沿胶槽左边第1个上样孔加入的蛋白Marker 5μL，充分震荡混合蛋白样品，根据计算好的等质量的蛋白上样体积，用10μL移液器将蛋白样品缓慢加入至上样孔中；上样时注意避免产生气泡，避免蛋白样品加至孔外；

(7)将电泳槽核对正负极后接通电源，参数设置为恒压90V进行电泳，当溴酚蓝条带下行接近分离胶、浓缩胶分界处时，改为恒压120V并继续电泳，当溴酚蓝条带跑至分离胶底部时，切断电源停止电泳。

转膜

(1)取出电泳槽中的玻璃板，充分浸泡于4℃的冰箱中预冷的现配转膜液中，用小心分开两块玻璃板，避免胶条破裂，将胶条浸泡于转膜液中；按照蛋白Marker显示条带与蛋白分子量对应范围切取适当大小的胶条，根据胶条大小裁取PVDF膜后置于甲醇溶液中浸泡5分钟后取出，可见白色PVDF膜被激活而变得透明，将PVDF膜没过转膜液覆盖于胶条之上，予以塑料工具轻柔排除PVDF膜和胶之间残留的气泡；

(2)按以下顺序放置好相关物品制作“三明治”：转膜夹红色正极-海绵-PVDF膜-胶条-滤纸-海绵-转膜夹黑色负极，叠好后将夹紧转膜夹压平，将转膜夹放置于转膜液中待用。；

(3)准备一泡沫盒，底部铺一层冰块，将转膜槽置于其内，区分正负极顺序后将“三明治”放入转膜槽中，注意勿弄错正负极，向转膜槽中倒入4℃预冷的转膜液使其没过“三明治”上部，合上转膜槽盖子，用冰将覆盖整个转膜槽，用冰水封固冰块与转膜槽之间的缝隙，将转膜仪设置为为恒压转膜，电压110V，时长约为90分钟；

(4)转膜结束后，关闭转膜仪，取出PVDF膜，丢弃胶条，区分PVDF膜正反，用剪刀在PVDF膜一角剪一小角以做标记。

免疫反应

(1)封闭：取快速封闭液倒入封闭盒中后将PVDF膜放入封闭盒内，注意封闭液应覆盖整张PVDF膜，将封闭盒放置于摇床上室温缓慢摇动封闭约15分钟；

(2)洗膜：回收封闭液，向封闭盒中倒入1XTBST缓冲液覆盖整张PVDF膜，于摇床快速摇动清洗3遍，每次10分钟；

(3)孵一抗：取出清洗后的PVDF膜放置于一抗孵育盒中，加入浓度适当的一抗(按抗体说明书用一抗稀释液稀释配置)，使其覆盖整张PVDF膜，置于于4℃冰箱，摇床上缓慢摇动过夜；

(4)洗涤一抗：回收一抗，取出PVDF膜放入洗膜盒中，向洗膜盒中倒入1XTBST缓冲液覆盖整张PVDF膜，于摇床快速摇动清洗3次，每次10分钟；

(5)孵二抗。将洗好的PVDF膜放入二抗孵育盒中，加入浓度适当的二抗(按抗体说明书用二抗稀释液稀释配置)，于摇床上缓慢摇动，室温孵育2h。

(6)洗涤二抗：回收二抗，取出PVDF膜放入洗膜盒中，向洗膜盒中倒入1XTBST缓冲液覆盖整张PVDF膜，于摇床上快速摇动，充分洗涤3次，每次10分钟。

化学发光成像

(1)用滤纸充分吸干PVDF膜上的液体，区分正反面，将膜放置于清洁的培养皿中，加入适量的发光液并使其覆盖整条PVDF膜，用塑料工具轻轻排出膜下的气泡；

(2)将培养皿置于凝胶成像仪中，使用成像软件(Image Lab)获取成像条带；

统计分析

使用Image Lab成像软件分析图像，运用GraphPad Prism 9做统计图表和数据分析。使用t检验方法比较两种样本均值。P<0.05结果有统计学意义。

3、本发明通过以上实验步骤证明了FosB基因在在急性髓系白血病细胞中的作用及对药物敏感性的影响如下：

A、FosB在AML患者中，难治/复发组较缓解组表达增高；

本实验通过qPCR方法检测34例完全缓解(AML-CR)与38例难治/复发(AML-RR)的急性髓系白血病患者FosB的表达差异；结果如图1所示，AML-RR患者骨髓样本FosB表达明显高于AML-CR患者；由以上实验结果可知，在急性髓系白血病中难治/复发患者中，相比较缓解患者FosB的基因表达明显增高，说明FosB与急性髓系白血病的疾病进展有关；

B、FosB在AML细胞株中表达高于人脐静脉内皮细胞株

本实验通过运用qPCR和WB的实验方法检测人正常细胞株(HUV-EC-E)与人急性髓系白血病细胞株(THP-1与HL-60)中FosB的表达差异；结果如图2A所示，在基因表达水平上，相比人正常细胞株，FosB在人AML细胞株中表达明显升高；同时，如图2B所示在蛋白表达水平上，FosB亦在人AML细胞株中表达明显高于人正常细胞株。

4、结论

急性髓系白血病(Acute myeloid leukemia,AML)是一组由造血干细胞克隆性增殖失控引起的血液系统恶性肿瘤，其发生发展与多种信号通路的异常调节息息相关。AP-1是调节细胞增殖、分化和凋亡的关键转录因子，AP-1相关信号通路的活性失调与多种自身免疫性疾病及肿瘤的发生、发展有关。AP-1相关信号通路成员的异常表达见于多种血液系统肿瘤，如AML、慢性粒细胞白血病(Chronic myelogenous leukemia,CML)、霍奇金淋巴瘤(Hodgkin's disease,HD)和间变性大细胞淋巴瘤(Anaplastic large cell lymphoma,ALCL)；通过AML患者骨髓样本基因表达分析，Staber PB等人发现疾病复发时RAF/MEK/ERK通路被激活，同MKP-1,c-jun,c-fos和egr-1mRNA表达水平增高，提示AP-1家族中的c-jun,c-fos与不良预后有关。而AP-1信号通路成员FosB在AML中的研究甚少。

本实验通过收集72例临床患者骨髓样本运用qPCR的方法检测FosB基因表达水平，结果提示，相对于AML-CR组患者，在AML-RR组中FosB在基因水平表达明显增高。同时，相对于人正常细胞株，FosB在AML细胞株中表达也增高。由此推断，FosB可能与急性髓系白血病的状态紧密相关，FosB在AML患者中高表达可能提示患者的不良预后，有望为AML患者提供提示预后的实验室指标，也为急性髓系白血病的靶向治疗中新的靶点研究提供实验基础。

相对于AML-CR组患者，FosB在AML-RR组中表达明显升高，同时，相对于人正常细胞株，FosB在AML细胞株中的表达也增高，提示FosB可能与AML的复发、耐药上存在某些程度上的联系。

实施例2

AP-1抑制剂T5224在AML细胞中对其增殖与耐药的影响

1、主要实验方法

细胞培养

悬浮细胞THP-1与HL-60培养于RPMI-1640配置的完全培养基中(含10％FBS)，贴壁细胞HUV-EC-E培养于DMEM配置的完全培养基中(含10％FBS)，将细胞放置于37摄氏度、含有百分之五饱和湿度的二氧化碳的细胞培养箱内进行培养和传代；注意观察细胞生长状态及有无污染，根据细胞代谢情况换液，一般情况下每隔两天换一次液。

细胞增殖的检测

FosB抑制剂T5224处理细胞

(1)进行细胞计数后，按照5×104个/mL的细胞接种密度将HUV-EC-E、THP-1和HL60细胞株分别接种于96孔板中，不同处理的细胞均设置3个副孔，按每孔90μL的体积进行接种；

(2)取10μl FosB抑制剂T5224(购自美国Selleck生物科技有限公司，货号：S8966)按照表5，0μM,10μM,20μM,40μM,60μM,80μM的终浓度梯度加入各孔中，轻微震荡混匀后将96孔板放入细胞培养箱中，培养共72h；

表5 FosB抑制剂T5224终浓度梯度

(3)在培养0、24、48、72h时分别向各待测孔中加入CCK-8试剂10μL；

(4)混匀后将96孔板继续放入37℃恒温孵育箱中孵育3～4h；

(5)将96孔板放入酶标仪中，设定酶标仪波长450nm，测定OD值，计算三个复孔OD值的平均值。

阿糖胞苷处理细胞

(1)进行细胞计数后，按照5×104个/mL的细胞接种密度将THP-1细胞接种在96孔板中，不同处理的细胞均设置3个副孔，细胞悬液总体积为90ul；

(2)取10μl阿糖胞苷(购自国药一心制药有限公司，国药准字H20055127)按照0.625μM,1.25μM,2.5μM,5μM,10μM,20μM,0μM的终浓度梯度加入各孔，轻微震荡混匀后将96孔板放入细胞培养箱中继续培养72h；

表6阿糖胞苷终浓度梯度

(3)在培养0、24、48、72h时分别各待测孔中加入CCK-8试剂10μL；

(4)混匀后将96孔板继续放入37℃恒温孵育箱中孵育3～4h；

(5)将96孔板放入酶标仪中，设定波长为450nm，测定OD值，计算三个复孔OD值的平均值。

T5224联合阿糖胞苷处理细胞

(1)进行细胞计数后，按照5×104个/mL的细胞接种密度将THP-1细胞接种在96孔板中，不同处理的细胞均设置3个副孔，细胞悬液总体积为80ul,；

(2)取10ul阿糖胞苷按照表7，0.625μM,1.25μM,2.5μM,5μM,10μM,20μM,0μM的终浓度梯度加入各孔中，轻微震荡混匀；

表7阿糖胞苷终浓度梯度

(3)每孔中各加入FosB抑制剂T5224 10μL，使其终浓度为40μmol/L，轻微震荡混匀后将96孔板放入培养箱中继续培养24小时；

(4)向各待测孔中加入CCK-8试剂(购自上海七海复泰生物科技有限公司，货号：C008-3)10μL，轻微混匀后将96孔板放入细胞培养箱中继续培养3～4h；

(5)将96孔板放入酶标仪中，设定波长为450nm，测定OD值，计算三个复孔OD值的平均值。

细胞凋亡的检测

(1)进行细胞计数后，按照5×106个/mL的细胞接种密度将HL-60细胞接种到6孔板中，按终浓度分别0μM、40μM、80μM加入FosB抑制剂T5224后放入细胞培养箱中继续孵育24小时。不同处理的细胞均设置3个副孔。

(2)孵育24小时后用1mL移液器吸取细胞于1.5mL的无菌EP管中，将离心管置于离心机中，以1.0rcf/min的离心条件离心5分钟后弃上清，用4℃预冷的PBS反复清洗离心2遍，弃去上清液。

(3)将4℃预冷的双蒸水与5×Binding Buffer按4：1的比例进行混合，获得1×Binding Buffer，取适量1×Binding Buffer重悬细胞，进行细胞计数，将细胞密度调整为1×106个/mL

(4)取4个1.5ml无菌EP管，各取100μL重悬好的细胞液后按照以下表内容向4个EP管中分别加入各试剂组分(AnnexinV-APC/7AAD细胞凋亡试剂盒购自杭州联科生物技术股份有限公司，货号：AP104-30)；

表8 AnnexinV-APC/7AAD细胞凋亡实验分组

(5)轻柔震荡各管中组分充分混匀，放置于室温中，避光孵育约15分；

(6)取300μL 4℃预冷的1×Binding Buffer加入上述各管中；

(7)用移液枪将上述样本吸取至流式管中，在流式细胞仪中，用空白对照管调节荧光通道压、SSC、FSC，并在此压力下用单标管调节荧光通道的补偿。

统计方法

应用FlowJo 7.6进行数据计算及软件做图，应用GraphPad Prism 7进行数据分析及统计图表。使用t检验方法比较两种样本均值。P<0.05则结果有统计学意义。

2、本发明通过以上实验步骤证明T5224在急性髓系白血病细胞中的作用及对药物敏感性的影响如下：

A、T5224对细胞株增殖的影响

运用CCK-8方法检测在人正常细胞株(HUV-EC-E)及AML细胞株(HL-60、THP-1)中，分别加入抑制剂T5224干预24h后的细胞增殖情况，如图3所示T5224在AML中能抑制细胞的增殖，且不影响正常细胞株的增殖；

B、T5224对AML细胞株凋亡的影响

采用Annexin V-APC/7-AAD试剂盒检测对HL-60细胞株予以不同浓度的T5224处理24h后的细胞凋亡率；结果如图4所示，T5224对急性髓系白血病细胞株的凋亡有促进作用，且浓度越高促进凋亡作用越明显；

C、T5224联合阿糖胞苷对AML细胞株增殖的影响

本实验组共设置两组，取THP-1细胞，第一组加入不同浓度的阿糖胞苷，第二组在已加入不同浓度阿糖胞苷的处理组中加入同浓度FosB抑制剂T5224(40μM)；分别培养24h，采用CCK-8试剂盒检测相对细胞活力，结果如图5所示，T5224联合阿糖胞苷对AML细胞增殖的抑制作用更强。

3、结论

急性髓系白血病(Acute myeloid leukemia,AML)是一种血液系统恶性肿瘤，具有高度异质性，其高发病率和高死亡率严重威胁人类健康。随着临床医生与科学家的不懈努力，AML患者的预后不断改善，其中维甲酸和亚砷酸的应用使90％以上的APL患者获得治愈。对于非APL患者，造血干细胞移植也有可能从根本上治愈白血病。近年来，新的分子靶向药物与免疫治疗临床试验的结果鼓舞人心，开启了AML治疗的新篇章。尽管如此，复发、难治性急性髓系白血病仍是临床治疗的难题，随着多重耐药的出现，探索新的治疗模式依旧是当前血液病领域的研究热点。

鉴于前期实验中FosB与AML患者疾病状态的关系，为探索抑制FosB在AML中的作用及为在AML中靶向FosB的治疗研究提供实验基础，本实验通过运用FosB抑制剂T5224作用于AML正常人脐静脉内皮细胞株和AML细胞株后检测增殖和凋亡的情况，发现抑制FosB可降低AML细胞的细胞活力与增殖速度，促进AML细胞的凋亡，且对正常细胞株的生长抑制较小，初步提示了抑制FosB在AML中治疗的有效性及安全性，但实验结果有待进一步在动物实验中予以确认。同时，T5224联合阿糖胞苷处理AML细胞比单用阿糖胞苷处理生长抑制作用更显著，提示T5224与阿糖胞苷的联合应用有协同抑制AML细胞增殖的作用，可提高阿糖胞苷的药物敏感性。在胃癌的相关研究里，在长春新碱耐药的细胞株SGC7901/VCR中，AP-1抑制因子BATF2可通过下调c-Fos、c-Jun的表达改善耐药细胞株的耐药性，而在原代AML耐药细胞或AML耐药细胞株中T5224是否可克服AML对化疗耐药还有待下一步实验继续探索；对于FosB的功能调控机制，Shidan Liu等人在胰腺癌中发现miR-144-3p靶向下调FosB，通过过表达FosB后可上调COX2,VEGF,MMP2和MMP9的表达，其中COX2介导的信号通路可调控细胞增殖，VEGF是重要的血管生成因子之一，可以促进肿瘤血管的增殖与侵袭，MMP2和MMP9是基质金属蛋白酶基因家族(MMPs)的成员，参与肿瘤的侵袭与迁移。而Fos B在AML中的功能调控机制有待于后期在AML中建立FosB过表达细胞株来进行进一步研究。以上结果都为研究FosB抑制剂作为治疗急性髓系白血病的药物研发提供了实验基础，且有望为对阿糖胞苷耐药的AML-RR患者提供新的治疗选择。

因此，本发明证实了T5224在急性髓系白血病细胞株中能抑制细胞的增殖和促进其凋亡；且不对正常细胞株的增殖造成明显的影响。T5224能增强AML细胞株对化疗药物阿糖胞苷的敏感性。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并非用于限定本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均包含在本发明的保护范围内。